Nikotin pogoršava oštećenje bubrega izazvano takrolimusom programiranom smrću stanica
Mar 23, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yu Ji Jiang, Sheng Cui, Kang Luo, Jun Ding
UVOD
Unatoč otkriću novih imunosupresiva, takrolimus (TAC) ostaje kamen temeljac imunosupresivnih režima u transplantaciji čvrstih organa. Međutim, dugotrajna primjena TAC-a povećava rizik od nuspojava (npr. nefrotoksičnost, neurotoksičnost, infekcije, maligne bolesti, dijabetes i gastrointestinalne tegobe) [1]. Među njima, akutnibubregozljedaili kronična TAC nefrotoksičnost prijavljena je u 46 posto primatelja presađenih pluća [2] i 22,4 posto primatelja presađenih bubrega [3]. Dok je akutnabubregozljedasmatra se reverzibilnom nakon smanjenja doze TAC-a ili potpunog prekida, kronična nefrotoksičnost, koja dovodi do gubitka alografta, je nepovratna. Kroničnu nefrotoksičnost TAC karakteriziraju glomerulopatija, hijalinoza aferentnih arteriola i prugasta tubulointersticijalna fibroza (TIF) [4]. Iako točan mehanizam ove kliničke dileme ostaje nepoznat, nedavno smo pokazali da upala uzrokovana oksidativnim stresom, transformirajući faktor rasta 1 (TGF- 1) i programirana stanična smrt mogu biti važni igrači [5]. Pušenje cigareta kritičan je javnozdravstveni izazov i društveni financijski teret koji smanjuje kvalitetu života. Epidemiološka izvješća pokazuju da trenutno u svijetu ima više od jedne milijarde pušača cigareta i šest milijuna smrtnih slučajeva godišnje zbog upotrebe duhana. Ove stope su u porastu, posebno u zemljama u razvoju ili nerazvijenim zemljama [6]. Dobro je poznato da je pušenje cigareta faktor rizika za razne vrste raka, kardiovaskularne događaje (infarkt miokarda i moždani udar) i opstruktivne bolesti pluća. U bubrezima, pušenje povećava ozbiljnost bubrežne disfunkcije u bolesnika s dijabetesom, hipertenzijom, policističnimbubregbolest, i nakon transplantacije bubrega [7]. Štoviše, pušenje također može uzrokovati de novo oštećenje bubrega čak i kod zdrave populacije bez postojeće kronične bubrežne bolesti (CKD) [8]. Ova studija nastojala je procijeniti: (1) je linikotin(NIC), primarna toksična komponenta pušenja cigareta, pogoršava oštećenje bubrega izazvano TAC-om; i, ako je tako, (2) koji mehanizam odgovara za NIC(nikotin)-ubrzana nefrotoksičnost.
cistanches herba može olakšati rad bubrega
REZULTATI
Učinak NIC-a(nikotin)na osnovne parametre
Tablica 1 prikazuje učinke NIC-a(nikotin)na osnovne parametre u eksperimentalnim skupinama. Oba NIC-a(nikotin)i TAC povećava UV (poliurija), što je dodatno povećano NIC-om(nikotin)i TAC tretman. Ni NIC(nikotin)ni TAC nije spriječio gubitak BW. Izlučivanje proteina urinom, Scr, BUN i Cys-C bili su značajno viši u oba NIC-a(nikotin)i TAC skupine u usporedbi s VH skupinom; te su razine dodatno porasle s kombinacijom dvaju lijekova, što implicira da NIC(nikotin)ubrzava TAC-induciranu bubrežnu disfunkciju. Nije bilo značajnih razlika u SBP između grupa. Četverotjedno liječenje TAC-om povećalo je koncentraciju TAC-a u krvi na 11.0±og ng/mL, dok je NIC(nikotin) did not influence blood TAC concentration(12.8±15 ng/mL,p>o.o5 naspram TAC).Pored toga, tretiranje normalnih štakora s NIC(nikotin)što je rezultiralo povećanjem koncentracije kotinina u serumu i urinu za 56,5±17 ng/mL odnosno 8,6±192,6 ug/dan. Ove koncentracije kotinina u serumu i urinu oponašaju one opažene kod ljudi koji su aktivni pušači [13].
Tablica 1. Učinak NIC-a(nikotin)na funkcionalne parametre
Učinak NIC-a(nikotin)o histopatologiji kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Kroničnu TAC nefrotoksičnost karakteriziraju jedinstvene histološke značajke uključujući prugasti TIF i glomerulopatiju. Histološkim bojanjem i elektronskom mikroskopijom otkrili smo da se ozljeda glomerula uzrokovana TAC-om očituje zadebljanjem baze glomerula i brisanjem nožica podocita (Slika IA, IC i D), što može biti povezano s povećanim izlučivanjem proteina mokraćom. Na kvantitativnim analizama, oba NIC(nikotin)i TAC je povećao frakcijsko mezangijsko područje, s daljnjim povećanjem uočenim u NIC-u(nikotin)i TAC skupina. Glavne promjene u kroničnoj nefrotoksičnosti TAC-a bile su ograničene na tubulointersticijska područja, kao što je ocrtano tubulointersticijskim fibroznim taloženjem, tubularnom atrofijom i prugastom fibrozom (Slika 1B, 1E i F). Brojke jasno pokazuju da je TIF rezultat u NIC-u(nikotin)plus TACgroup je bio viši nego u bilo kojem NIC-u(nikotin)grupa ili TAC grupa.
Slika 1. Reprezentativne fotomikrografije periodne kiseline-Schiff (PAS)(A), Massonov trikrom (B), transmisijska elektronska mikroskopija (CF) i kvantitativna analiza glomerularne ozljede i tubulointersticijske fibroze (TIF); (C) zadebljanje bazalne membrane glomerula (strelice); (D) brisanje podocitnog stopala procesi (strelice); (E) oticanje tubulointersticija i opsežno taloženje kolagena (raspršeni); (F) atrofirani tubuli (strelice). VH, nosač; NIC(nikotin), nikotin; TAC, takrolimus. str
Učinak NIC-a(nikotin)na profibrotičnu ekspresiju citokina u kroničnoj TAC nefrotoksičnosti
Ova studija nastojala je usporediti ekspresiju profibrotičnog citokina TGF- 1 i CTGF i komponente izvanstaničnog matriksa (ECM) ig-h; između eksperimentalnih skupina. U skladu s nalazima TIF-a, NIC(nikotin)povećana TAC-inducirana prekomjerna ekspresija profibrotičnog TGF- 1i CTGF i ECM ig-h3 (Slika 2)
Slika 2. Reprezentativne fotomikrografije imunobloting analizeza (A) transformirajući faktor rasta 1 (TGF-B1), (B TGF- -inducirani gen-h( ig-h3) i (C) faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF). Predstavljene su vrijednosti za ekspresiju proteina koristeći skupinu vehikuluma (VH) kao 100% reference i normalizirano na -aktin.NIC(nikotin), nikotin;TAC, takrolimus. 3p
Učinak NIC-a(nikotin)na upalu kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Kako bismo definirali učinak NIC-a na upalu kod ozljede bubrega izazvane TAC-om, proučavali smo ekspresiju proupalnih medijatora i gena povezanih s piroptozom imunoblotingom i imunohistokemijom. Slika 3 pokazuje da je liječenje TAC-om povećalo ekspresiju citokina povezanih s piroptozom (ⅡL-1, IL-18 i NLRP3) i MCP-1, što je rezultiralo ED-1-pozitivnim stanične infiltracije, a daljnja povećanja su pronađena kombiniranim liječenjem NIC-a(nikotin)i TAC.
Slika 3. Reprezentativne fotomikrografije imunohistokemije za ektodermalnu displaziju-1 (ED-1)(A) i imunoblot analiza za proupalne citokine (B). VH, vozilo; NIC(nikotin), nikotin; TAC, takrolimus; MCP-1, kemotaktički protein monocita-1;IL, interleukin; NLRP3, protein koji sadrži pirinsku domenu NOD-sličnog receptora3. str
Učinak NIC-a(nikotin)o oksidativnom stresu kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Kao što je prikazano na sl.4, kronični(nikotin)Liječenje TAC-om usko je povezano s neravnotežom između oksidativnih i antioksidativnih enzima [12,14. Imunobloting analiza pokazala je da je NIC povećao ekspresiju NOX-2 i NOX-4 izazvanu TAC-om, ali je potisnuo ekspresiju SOD1 i SOD2. Osim toga, razine 8-OHdG u serumu i mokraći, markera oksidativnog stresa, bile su više u NIC i TAC skupinama u usporedbi s VH skupinom i najviše u NIC plus TAC skupini. Ovi nalazi upućuju na sinergistički učinak NIC i TAC na oksidativni stres u ovom modelu.
Slika 4. Reprezentativne fotomikrografije imunobloting analize niza proteina povezanih s oksidativnim stresom (A) i seruma (B) i urina (C)Koncentracije 8-hidroksi-2'-deoksigvanozina (8-OHdG). VH, vozilo; NIC(nikotin), nikotin; TAC, takrolim-us; SOD, superoksid dismutaza; NOX, NADPH oksidaza. Bp
Učinak NIC-a(nikotin)o programiranoj staničnoj smrti kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Programirana stanična smrt tipa I (apoptoza) ili tipa II (autofagija) uključena je u patogenezu kronične ozljede bubrega izazvane TAC-om [1s]. Koristeći TUNEL test, primijetili smo da je većina TUNEL-pozitivnih stanica ili apoptotičkih tijela lokalizirana na tubularne epitelne stanice i intersticijske vaskularne endotelne stanice, gdje je napredovala tubularna atrofija i tipični TIF (Slika 5A). Kvantitativna analiza pokazala je da oba NIC(nikotin) i TAC je značajno povećao TUNEL-pozitivne stanice u usporedbi s VH grupama; to je bilo izraženije u skupini NIC plus TAC. Na molekularnoj razini, dodatak NIC(nikotin)štakorima tretiranim TAC-om rezultiralo je značajnom disregulacijom ekspresije Bcl-2/Bax i cijepane kaspaze-3 prema staničnoj smrti (Slika 5B). Osim toga, elektronska mikroskopija pokazala je da je liječenje TAC-om izazvalo obilno stvaranje autofagnih odjeljaka, kao što su početne autofagne vakuole (AVi), degradativne autofagne vakuole (Avd) i mitofagija (oblik selektivne autofagije) u NIC, TAC i NIC plus TAC skupine (slika 6). Kvantitativni imunobloting otkrio je da je prekomjerna ekspresija p62, LC3B, PINK1 i Parkin proteina uočena u bubrezima štakora tretiranih TAC-om dodatno povećana s NIC (Slika 6G i 6H).
Slika 5. Reprezentativne fotomikrografije TdT-posredovanog dUTP-biotin nick end označavanja (TUNEL) testa(A) i imunobloting analiza za gene koji kontroliraju apoptozu (B).Nikotintretman povećava TUNEL-pozitivne stanice (strelice) u bubrezima štakora tretiranim takro-limusom. VH, nosač; NIC(nikotin),nikotin; TAC, takrolimus; Bcl, B-stanični limfom; Bax, Bcl2-pridružen X. str
Učinak NIC-a(nikotin)o disfunkciji mitohondrija kod kronične nefrotoksičnosti TAC-a
Transmisijskom elektronskom mikroskopijom jasno smo uočili da oba NIC(nikotin)i TAC je uništio mitohondrijske arhitekture, kao što je ilustrirano smanjenom veličinom i brojem mitohondrija, neorganiziranim kristama, vakuolizacijom, fuzijom, formiranjem mitofagije i fisijom mitohondrija podijeljenih u dvije ili tri organele kćeri) (Slika 6). Rezultati kvantitativne analize pokazali su da NIC(nikotin) liječenje je dodatno smanjilo broj i veličinu mitohondrija u usporedbi sa samim liječenjem NIC ili TAC. Imunobloting analiza otkrila je da je disregulacija proteina povezanih s mitohondrijima (OPA1 i Drpi) izazvana Nicor TAC-om pogoršana istovremenom primjenom NIC-a i TAC-a (slika 6).
Slika 6. Reprezentativne prijenosne elektronske mikrografije autofagije i morfologije mitohondrija(AF), analiza imunoblotiranja (G, H) i kvantifikacija broja i veličine mitohondrija u svakoj liječenoj skupini. (A) Autofagijsko stvaranje takrolimusa (TAC) u bubrezima i/ilinikotin(NIC) tretirani štakori (strelica); (B) autofagni odjeljak koji sadrži mitohondrije bubrege 'TAC i/ili NIC(nikotin)tretirani štakori (mitofagija, strelica); (C) normalni mitohondriji; (D) smanjen broj mitohondrija u bubrezima TAC i/ili NIC(nikotin)liječeni štakori; (E) mitohondrijska fuzija viđena u bubrezima štakora liječenih TAC-om i/ili NIC-om (zaokružiti); (F) mitohondriji podijeljeni u dvije ili više organela kćeri u bubrezima štakora liječenih TAC-om i/ili NIC-om (fisija, kružić) . VH, vehikulum; LC3B, laki lanac 3B; PINK1, homolog fosfata i napetosti izbrisan na kinazi 1 induciranoj deset kromosoma; OPA, protein optičke atrofije; Drp, protein povezan s dinaminom.str
fisetinokobubreg
Učinak NIC-a(nikotin)o stresu endoplazmatskog retikuluma kod kronične TAC nefrotoksičnosti
Kao što je prikazano na slici 7, Nicor TAC je izazvao degranulaciju ribosoma, nepovezane i proširene cisterne i vakuolizaciju peroksisoma u grubom endoplazmatskom retikulumu (ER), dok je glatka struktura ER ostala gotovo normalna (Slika 7B). Imunobloting analiza otkrila je da ili NIC(nikotin)ili TAC je povećao ekspresiju ER gena povezanih sa stresom, uključujući CHOP, Bip, IRE-1 i ATF-6, ali je njihova ekspresija dodatno povećana kombinacijom ta dva (slika 7C).
Slika 7. Reprezentativne fotomikrografije transmisijske elektronske mikroskopije (A, B) i imunobloting analize endoplazmatskog retikuluma (ER) gena povezanih sa stresom (C).(A) Normalni grubi ER (strelice); (B) degranulacija ribosoma, nepovezane i proširene cisterne i dilatacija vezikula grubog ER unikotin(NIC) i/ili takrolimusom (TAC) tretiran bubreg štakora. VH, nosač; CHOP, C/EBP homologni protein; Bip, vezni imunoglobulinski protein; IRE-1c, protein koji zahtijeva inozitol-1c; ATF, aktivirajući faktor transkripcije. str< o.01="" vs.vh,="">
RASPRAVA
Pušenje cigareta važan je promjenjivi čimbenik rizika za progresiju kronične bubrežne bolesti i kod zdravih populacija i kod pacijenata s podležećim bolestima (npr. dijabetes, hipertenzija). Klinička ispitivanja pokazuju da pušenje cigareta povećava izlučivanje albumina mokraćom i nepovoljno utječe na funkciju bubrega [16]; osim toga, prestanak pušenja može poboljšati proteinuriju u bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti i dijabetesom tipa 2 te usporiti napredovanje do završnog stadija bubrežne bolesti[1-,18]. Štoviše, pušenje primatelja ili davatelja doprinosi epizodama odbacivanja i kroničnoj nefropatiji alografta, što dovodi do gubitka alografta kod transplantacije bubrega [19,2o]. Ovi štetni učinci pušenja (NIC(nikotin)) odražavaju se u studijama na modelima s/6 nefrektomije [2al] i dijabetičke nefropatije [o] na glodavcima. U ovoj studiji otkrili smo da NIC(nikotin)pogoršano TAC-inducirano frakcijsko mezangijsko područje i TIF. Ove patološke promjene dovele su do izraženijeg oštećenja bubrežne funkcije i pojačanog izlučivanja proteina mokraćom. Na temelju ovih rezultata i drugih izvješća, predlažemo da pušenje cigareta može ubrzati gubitak bubrežnog alografta kod primatelja transplantata koji primaju imunosupresive na bazi TAC-a.
Upala igra ključnu ulogu u evoluciji kronične TACnefrotoksičnosti jer prethodi trajnom bubrežnom ožiljku. Povećani proupalni medijatori kao odgovor na štetne podražaje mogu regrutirati upalne stanice, koje zauzvrat prekomjerno izražavaju proupalne i profibrotične citokine kao što su kemoatraktanti, adhezijske molekule i TGF- 1. Nedavno smo pokazali da su NLRP3-ovisni i neovisni inflamasomi uključeni u patogenezu kronične TAC nefrotoksičnosti [s]. Naši rezultati pokazuju da administriranje NIC-a(nikotin)štakorima liječenim TAC-om pojačava ekspresiju gena povezanih s piroptozom (NLRP3, IL-1 i I-18), proupalnih medijatora MCP-1 i profibrotskih citokina TGF- i CTGF, vodeći do pretjeranog priljeva ED-1-pozitivnih stanica i regulacije ig-h; ti odgovori odražavaju ozbiljnost ozljeda glomerula i tubula. Naši su nalazi u skladu s onima Aranya i sur. [22] i Agarwala i sur. [23], koji su pokazali učinke NIC-a na upalu i fibrozu bubrega.
Iako NIC(nikotin)Egzacerbacija kronične TAC nefrotoksičnosti u ovom modelu može biti multifaktorska, vjerojatno je povezana s utjecajem oksidativnog stresa. Dobro je poznato da je liječenje kroničnim TAC-om usko povezano s hipoksijom povezanom s aferentnom arteriolopatijom, koja se potom povezuje s oksidativnim stresom, koji zauzvrat aktivira prekomjernu ekspresiju profibrotičnog TGF- 1, što dovodi do fibroze. Ovaj konstrukt je podržan opažanjem da antioksidativne terapije (npr. koenzim Q10) smanjuju ekspresiju TGF- 1 i TIF očuvanjem integriteta mitohondrija u kroničnoj TAC nefrotoksičnosti 24]. Nedavno, veliki broj dokaza iz in vitro studija pokazuje međuodnos između kronične izloženosti NIC-u i oksidativnog stresa kod raznih ozljeda bubrega [o,25,26. Ovdje smo otkrili da NIC povećava razine 8-OHdG u serumu i urinu i pojačanu ekspresiju oksidativnih proteina, dok potiskuje ekspresiju antioksidativnih proteina, čime se pojačava oksidativni stres izazvan TAC-om, kao i fibroza. Doista, pogoršanje NIC-a kod bubrega liječenih TAC-om u ovoj studiji može se pripisati oksidativnom stresu.
cistanche erektilna disfunkcija
Također je moguće da su i apoptoza (tip I programirana stanična smrt) i autofagija (tip II programirana stanična smrt) uključeni u NIC(nikotin)-ubrzana kronična TAC nefrotoksičnost. Kao što je prethodno ilustrirano, NIC izravno inducira apoptozu podocita i stanica proksimalnih tubula bubrega [27,28]; također neizravno izaziva apoptotičku staničnu smrt putem oksidativnog stresa[2g] ili aktivacije TGF- 1[22].NIC(nikotin)također može inducirati autofagiju u zvjezdastim stanicama gušterače Bo], neonatalnim mišjim srčanim miocitima 31] i vaskularnim glatkim mišićnim stanicama 32]. Stoga su oksidativni stres i programirana stanična smrt međusobno povezani. Koristeći TUNEL test i elektronsku mikroskopiju, jasno smo uočili da je NIC značajno povećao broj TUNEL-pozitivnih stanica u tubularnim epitelnim stanicama, intersticijskim vaskularnim endotelnim stanicama i autofagičnim odjeljcima u bubrezima štakora tretiranih TAC-om. Ove morfološke promjene bile su popraćene disregulacijom gena povezanih s apoptozom ili autofagijom u bubrezima štakora, što je dovelo do stanične smrti. Ovaj kumulativni dokaz sugerira da NIC(nikotin)sam po sebi ne samo da izaziva oksidativni stres i programiranu staničnu smrt, već također promiče štetni učinak TAC-a na bubrege, što dovodi do bubrežne disfunkcije i oštećenja arhitekture, kao što je prethodno objavljeno u modelima dijabetičke nefropatije [o] i KBB-a izazvane streptozotocinom (STZ) ( s/6 nefrektomija) B3].
Osim toga, unutarstanične organele nastale oksidativnim stresom kao što su mitohondrijska disfunkcija i ER stres igraju ključnu ulogu u cjelovitosti kronične nefrotoksičnosti TAC-a, pokreću ER stres i disreguliraju mitohondrijske i ER gene koji kontroliraju stres, a učinci se pogoršavaju kombiniranim liječenjem s dva . Stoga, pogoršanje mitohondrijske sposobnosti i ER stres mogu objasniti učinak NIC-a(nikotin) na oštećenje bubrega izazvano TAC-om
Naša je studija otkrila da NIC(nikotin)u dozi od 15 mg/kg pogoršava oštećenje bubrega izazvano TAC-om kroz oksidativni stres, upalu i programiranu smrt stanica, u skladu s prethodnim studijama [27,37,38]. Međutim, drugi su primijetili suprotna otkrića. Sadis et al.Bg] pokazali su da NICat doza od 0,5 mg/kg štiti bubreg od ishemije/reperfuzijske ozljede kolinergičkim protuupalnim putem. Druga studija koju su proveli Agarwal et al.[23] izvijestio da je dugotrajno oralno liječenje NIC-om(nikotin)(28 tjedana) daje renoprotektivne učinke u štakorskom modelu spontane proteinurije （Munich-Wistar-Frömter štakori). Razlozi ove razlike u ulozi NIC-a na bubregu nisu poznati, ali mogu ovisiti o dozi NIC-a, trajanju liječenja lijekom ili modelu glodavaca. Za rješavanje ovih problema potrebna su daljnja istraživanja. Ova studija jasno pokazuje da NIC pogoršava oštećenje bubrega izazvano TAC-om u štakorskom modelu kronične TAC nefrotoksičnosti. Pogoršanje oksidativnog stresa i programirana stanična smrt mogu biti jedan od mehanizama u podlozi štetnih učinaka NIC-a. Naša otkrića pružaju bolji uvid u utjecaj pušenja među primateljima transplantacije.
cistamche u funkciji bubrega
REFERENCE
1. Bentata Y. Takrolimus: 20 godina uporabe u transplantaciji bubrega odraslih: što trebamo znati o njegovoj nefrotoksičnosti. Artif Organi 202044140-152.
2. Sikma MA, Hunault CC, van de Graaf EA, et al. Visoke koncentracije takrolimusa u krvi rano nakon transplantacije pluća i rizik od ozljede bubrega. Eur J Clin Pharmacol 201773:573-58o.
3. Yagisawa T, Omoto K, Shimizu T, Ishida H, Tanabe K. Arterioskleroza u biopsiji nultog vremena faktor je rizika za kroničnu nefrotoksičnost izazvanu takrolimusom. Nefrologija (Carlton)201s;2o Suppl2:s1-57.
4. Nankivell BJ, P'Ng CH, O'Connell PJ, Chapman JR. Nefrotoksičnost inhibitora kalcineurina kroz leću longitudinalne histologije: usporedba razdoblja ciklosporina i takrolimusa. Transplantacija 2016;1oo:1723-171.
5. Lim SW, Shin Y, Luo K, et al. Učinak Klothoa na klirens autofagije kod bubrežne ozljede izazvane takrolimusom. FASEB J 2o193:2694-2706.
6. Lim SS, Vos T, Flaxman AD, et al. Komparativna procjena rizika tereta bolesti i ozljeda koja se može pripisati 67 čimbenika rizika i skupinama čimbenika rizika u 21 regiji, 199o-201o:sustavna analiza za Studija o globalnom teretu bolesti 201o.Lancet 2o12;38o:2224-226o.
7. Formanek P, Salisbury-Afshar E, Afshar M. Pomaganje pacijentima s ESRD i ranijim stadijima CKD da prestanu pušiti. Am J Kidney Dis 2018;72:255-266.
8. Jain G, Jaimes EA.Nikotinsignalizacija i progresija kronične bubrežne bolesti u pušača. Biochem Pharmacol 2013;861215-1223.
9. Zhang LY, Jin J, Luo K, et al. Shen-Kang štiti od oštećenja bubrega uzrokovanog takrolimusom. Korean JIntern Med 2019341078-1090.
10. Ibrahim ZS, Alkafafy ME, Ahmed MM, Soliman MM. Renoprotektivni učinak kurkumina protiv kombiniranog oksidativnog stresa dijabetesa inikotinkod štakora. Mol Med Rep 2016;13:3O17-3026.