NGF modulira metabolizam kolesterola i stimulira izlučivanje ApoE u glijalnim stanicama pružajući neurozaštitu od oksidativnog stresa 2. dio

2.6. NGF-posredovana sekrecija ApoE pomoću U373 štiti neuronske stanice od oksidativnog oštećenja

Prikupljeni dokazi naglašavaju da ApoE povećava otpornost neurona na oksidativne insulte, čime se sprječava apoptoza i neurodegeneracija [17,18,37]. U tom kontekstu, procijenili smo može li NGF-inducirano izlučivanje ApoE od strane U373 stanica zaštititi neurone N1E-115 od oksidativnog stresa. Potpuno diferencirani N1E-115 prethodno su tretirani rotenonom, koji inducira oksidativni stres inhibicijom mitohondrijskog kompleksa I.

Apoptoza je proces samouništenja i važan je način na koji stanice održavaju homeostazu tijela kroz programirano samouništenje pod određenim okolnostima. Apoptoza igra različite uloge u različitim fazama života.

Nedavne studije pokazale su da postoji određeni odnos između apoptoze i pamćenja. Već znamo da je pamćenje složen neuralni proces u mozgu, koji uključuje veze i koordinaciju između više regija mozga. Apoptoza može igrati ulogu u ovom neurološkom procesu.

S jedne strane, apoptoza može stabilizirati mrežnu strukturu neurona čišćenjem nepotrebnih neurona i sinapsi, čineći veze neurona profinjenijim, čime se poboljšava kvaliteta i učinkovitost pamćenja. S druge strane, prekomjerna apoptoza također može dovesti do smanjenja broja moždanih stanica, što može negativno utjecati na pohranjivanje i hvatanje sjećanja.

Stoga, uz održavanje odgovarajuće razine apoptoze, možemo poboljšati pamćenje kroz niz ponašanja i vještina, kao što su čitanje, učenje, vježbanje i prilagođavanje našeg načina razmišljanja. Ova ponašanja i vještine mogu potaknuti rast i povezanost moždanih stanica te poboljšati kvalitetu i učinkovitost pamćenja stimulirajući veze i koordinaciju između moždanih neurona.

Zaključno, odnos između apoptoze i pamćenja je složen. Samo uz održavanje odgovarajuće apoptoze možemo stimulirati naš mozak i poboljšati pamćenje kroz niz ponašanja i vještina. S ove točke gledišta, moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche deserticola nam može značajno pomoći u poboljšanju pamćenja, jer Cistanche deserticola također može regulirati ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta. Te su tvari važne za pamćenje. Vrlo je važno za učenje i učenje. Osim toga, meso iz mesa također može poboljšati fluidnost krvi i pospješiti transport kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati suplemente za poboljšanje pamćenja

Nakon 16 sati izlaganja rotenonu, neuroni N1E-115 uzgajani su u svježem mediju (Ctrl), kondicioniranom mediju iz stanica U373 (U373-Ctrl), kondicioniranom mediju iz U373 prethodno tretiranog NGF-om tijekom 48 sati (U373-NGF), ili kondicionirani medij iz ApoE-utišanog U373 prethodno tretiranog NGF-om tijekom 48 h (U373-NGF ApoE siRNA). Prethodni tretman rotenonom snažno je smanjio broj N1E-115 uzgojenih u kontrolnom mediju, što ukazuje da primjena ovog pesticida ozbiljno utječe na preživljavanje N1E-115.

Citotoksičnost rotenona također je odredila intenzivno povlačenje neurita, što se vidi po duljini neurita. Oštećenje neurita izazvano tretmanom rotenonom bilo je posebno vidljivo nakon procjene stanica koje nose neurite, jer se broj N1E-115 s neuritima smanjio na 50%. Slični rezultati dobiveni su kada su N1E-115 stanice uzgojene u U373-Ctrl kondicioniranom mediju, što sugerira da prisutnost supernatanta dobivenog iz nestimuliranih astrocita nije dovoljna za zaštitu neuronskih stanica od toksičnosti posredovane rotenonom. Naprotiv, primjena kondicioniranog medija dobivenog iz U373 tretiranog NGF-om učinkovito je spriječila smrt neurona, kao i smanjenje broja stanica koje nose neurite i duljine neurita uzrokovano primjenom rotenona (Slika 5).

Što je još važnije, kondicionirani medij izveden iz ApoE-utišanih U373 stanica potpuno je izgubio blagotvorne učinke izazvane d pomoću U373-NGF kondicioniranog medija, što ukazuje da je neurozaštita vođena NGF-om posredovanim otpuštanjem ApoE u mediju kulture. Značajno je da je kondicionirani medij iz U373 tretiranog NGF-om transficiranog kodiranom siRNA u potpunosti zadržao zaštitne učinke koje ima U373-NGF kondicionirani medij, pokazujući da gubitak neuroprotekcije uočen u kondicioniranom mediju iz ApoE-utišanih stanica učinkovito ovisi o ApoE downregulation (Slika S3C).

Slika 5. Učinci kondicioniranog medija U373 na oksidativni stres u neuronima. Reprezentativne slike u svijetlom polju i kvantitativna procjena morfologije neurona N1E-115. Stanice su prethodno tretirane (+) ili ne (-) rotenonom (0.1 µM) tijekom 16 h, a zatim uzgajane u svježem DMEM (Ctrl), u kondicioniranom mediju dobivenom iz kontrole U373 (U{{ 9}}Ctrl), U373 prethodno tretiran NGF-om (U373-NGF) i U373 prethodno tretiran NGF-om utišan za apoE (U373-NGF ApoE siRNA) 48 h. n=5 različitih eksperimenata. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD. Statistička analiza procijenjena je korištenjem jednosmjerne ANOVA, praćene Tukeyjevim post hoc testom. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Kako bismo pojačali rezultate dobivene iz kondicioniranog medija, izveli smo kokulture U373/N1E115. Za početak, U373 stanice su prethodno tretirane ili ne s NGF-om tijekom 48 h. Nadalje, diferencirane N1E-115 stanice bile su prethodno tretirane ili ne s rotenonom tijekom 16 sati. Zatim je medij U373 zamijenjen svježim medijem koji je sadržavao 0.5% FBS, a pokrovna stakalca zasijana s N1E-115 prebačena su na sloj U373 za pripremu kokultura (Slika 6A).

Oksidativno oštećenje izazvano tretmanom rotenonom znatno je utjecalo na stanice koje nose viabilineuritne prstenaste stanice i duljinu neurita kontrolnih N1E-115 i N1E-115 kokultiviranih s U373-Ctrl astrocitima (Slika 6B). U skladu s eksperimentima s kondicioniranim medijem, N1E-115 stanice koje su kultivirane s U373-NGF stanicama bile su zaštićene od oksidativnog oštećenja, dok je utišavanje ApoE u U373 ukinulo neuroprotekciju koju je održavao NGF.

Slika 6. Izlučivanje ApoE od strane NGF-tretiranih U373 stanica osigurava neurozaštitu od oksidativnog stresa. (A) Reprezentativna shema kokultura astrocita i neurona postavljenih kako je opisano u Odjeljku o materijalima i metodama. Stanice koje nose neurite, duljina neurita i broj stanica procijenjeni su satima nakon uspostave kokulture. (B) Reprezentativne slike u svijetlom polju i kvantitativna procjena neuronske morfologije N1E-115 stanica, prethodno tretiranih (+) ili ne (-) rotenonom (0.1 µM) tijekom 16 sati.

N1E-115 su zatim držani u svježem DMEM (Ctrl) ili sukultivirani s kontrolnim U373 (U373-Ctrl), U373 prethodno tretiranim NGF-om (U373-NGF) i U373 prethodno tretiran NGF-om utišan za ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) 48 h. n=5 različitih eksperimenata. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD. Statistička analiza provedena je korištenjem jednosmjerne ANOVA-e, nakon koje je slijedio Tukeyjev post hoc test. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

3. Rasprava

Neravnoteže u signalnim putovima neurotrofina, kao i promjene u metabolizmu kolesterola u mozgu, snažno su povezane s neurološkim i neurodegenerativnim bolestima, kao što su Rettov sindrom, HD, Alzheimerova bolest (AD) i Parkinsonova bolest (PD) [2,38,39] . U tom kontekstu, fundamentalno istraživanje biološke aktivnosti neurotrofina ključno je za seciranje molekularnih mehanizama koji povezuju metabolizam kolesterola i fiziopatologiju mozga. Tijekom posljednjih nekoliko godina, zanimljiva studija izvijestila je o ulozi BDNF-a u regulaciji metabolizma kolesterola u astrocitima [38].

Unatoč ovoj ideji, nema dostupnih informacija o navodnoj uključenosti NGF u regulaciju astrocitnog kolesterola. Stoga smo se u ovom radu usredotočili na prospektivnu ulogu koju ima NGF u regulaciji metabolizma kolesterola, s posebnim osvrtom na utjecaj izlučivanja ApoE na neuronsku diferencijaciju i preživljavanje. U373, stanična linija astrocitoma koja se koristi kao eksperimentalni model ljudskih astrocita, zadržava potencijal potpunog odgovora na NGF, budući da izražava značajne razine TrkA i p75NTR.

Glavni rezultati pokazuju da NGF povećava razine glavnih proteina uključenih u biosintezu kolesterola (HMGCR), unutarstaničnu trgovinu (NPC1) i sekreciju (ABCA1). Ovi događaji su popraćeni istodobnim povećanjem ApoE i kolesterol leina u mediju kulture, što sugerira da NGF povećava biosintezu kolesterola i ekstruziju iz glijalnih stanica. Zabilježeno je da NGF inducira ekspresiju proteina ApoE povećanjem njegove transkripcije [40]. Međutim, nismo primijetili nikakvu značajnu promjenu u intracelularnoj ekspresiji ApoE. Ova očita nedosljednost može se objasniti budući da se nakupljanje ApoE ne može cijeniti zbog njegovog povećanog efluksa iz UIn-a tretiranog NGF-om
U pokušaju da bolje seciramo molekularne mehanizme, tretirali smo U373 s LM11A-31 i otkrili da modulator p75NTR može samo oponašati porast ekspresije HMGCR-a posredovan NGF-om. Uključenost p75NTR u modulaciju razina HMGCR u skladu je s prethodnim podacima dobivenim u drugim tipovima stanica, pokazujući da ovaj receptor kontrolira transkripciju kolesterogenih enzima [41]. Međutim, LM11A-31 nije izazvao nikakve promjene niti u drugim proteinima analiziranim u ovoj studiji, uključujući ABCA1, niti u razinama kolesterola i ApoE u mediju kulture, što ukazuje da selektivna modulacija p75NTR nije dovoljna za promicanje kolesterola ekstruzija kroz čestice bogate ApoE uočene u stanicama tretiranim NGF-om. Ovi rezultati navode nas na hipotezu da NGF upravlja metabolizmom kolesterola u glijalnim stanicama kroz uključenost i p75NTR i TrkA receptora.

Dobro je poznato da vezanje neurotrofina na Trk receptore aktivira ERK1/2, regulirajući tako nekoliko putova uključenih u diferencijaciju stanica, proliferaciju i preživljavanje [2,38]. Zanimljivo je da je uočeno da aktivacija ERK1/2 također regulira ekspresiju ABCA1 i ApoE u različitim tipovima stanica [38,42,43]. Ovi nalazi, zajedno s dokazima da osovina BDNF/TrkB/ERK potiče ekstruziju ApoE i ekspresiju ABCA1 u glijalnim stanicama [38], sugeriraju da put transdukcije signala koji uključuje osovinu TrkA/ERK može objasniti dio učinaka koje ima NGF u našoj studiji.

Iako nisu primijećene promjene u izrastanju neurita, primjena U373- kondicioniranog medija i uspostava eksperimenata sukulture pokazali su da je povećano izlučivanje ApoE iz glijalnih stanica posredovano NGF-om odlučujuće za sprječavanje štetnih ishoda induciranih oksidativnim stres u neuronskim stanicama. Za induciranje citotoksičnosti upotrijebili smo rotenon, pesticid koji se obično koristi u pretkliničkim istraživanjima za induciranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) izvedenih iz mitohondrija i naknadne apoptoze [44].

Naši rezultati naglašavaju da NGF stimulira izlučivanje ApoE od strane glijalnih stanica, što je neophodno za jamčenje neuroprotektivnih učinaka protiv primjene rotenona u diferenciranim N1E-115 stanicama. Uloga ApoE u prevenciji oksidativnog stresa dobro je dokumentirana. Na primjer, smanjenje ApoE u mišjim modelima pogoršava oksidacijsku ozljedu u tkivu mozga [45,46]. Sukladno tome, primjena egzogenog ApoE štiti od ireverzibilnog oksidativnog oštećenja uzrokovanog tretmanom vodikovim peroksidom suzbijanjem sekundarne toksičnosti glutamata [18]. Osim toga, lipoproteini koji sadrže ApoE učinkoviti su u ublažavanju apoptoze izazvane povlačenjem trofičke potpore u ganglijskim neuronima retine [47].

U našoj studiji, korištenje rotenona sugerira da ApoE-posredovana neuroprotekcija, koju promiču NGF-stimulirane glijalne stanice, može biti relevantna u kontekstu neurodegenerativnih stanja kao što je PD. Značajno je da rotenon reproducira dopaminergičku neuronsku degeneraciju sličnu onoj uočenoj kod PD-a, kako u životinjskim modelima tako iu staničnim kulturama, uključujući neurone izvedene iz N1E-115- [48-50]. Sukladno tome, naši rezultati podupiru prethodne dokaze koji pokazuju da ApoE izaziva neuroprotekciju nakon primjene 6-hidroksidopamina (6-OHDA), drugog neurotoksina koji može inducirati fenotip sličan PD [51]. Zajedno, naša studija pokazuje da je NGF ključni modulator metabolizma kolesterola i ekstruzije ApoE iz glijalnih stanica. Najvažnije je da je pojačanje izlučivanja ApoE koje potiče ovaj neurotrofin potrebno kako bi se osigurala neuroprotekcija protiv citotoksičnosti rotenona.

BDNF je najzastupljeniji neurotrofin u mozgu odrasle osobe. Unatoč ovim dokazima, pokazalo se da NGF može igrati ključnu ulogu ne samo tijekom razvoja, već iu središnjem živčanom sustavu odrasle osobe. Na primjer, NGF utječe na aktivnost hipokampusa i, kao posljedicu, na prostorno pamćenje i učenje [52]. Druga otkrića sugeriraju da NGF pokazuje neuroprotektivni učinak na nigrostrijatne dopaminergičke neurone i da ta aktivnost može postaviti osnovu za nove terapijske pristupe PD-u temeljene na NGF-u [53].

Prema ovoj ideji, pokazalo se da je proizvodnja NGF-a duboko regulirana u astrocitima tijekom odrasle dobi i vrši modulirajuće djelovanje na neuroupale, ozljede mozga i neurodegeneraciju [54-56]. U ovom kontekstu, bilo bi zanimljivo procijeniti, u budućim studijama, mogu li ovi učinci biti posredovani, barem djelomično, modulacijom glijalnog kolesterola koju potiče NGF. Ovaj rad predstavlja neka ograničenja koja bi trebalo prevladati u sljedećim eksperimentalnim istraživanjima; na primjer, bilo bi važno bolje secirati molekularne mehanizme koji povezuju liječenje NGF-om i metabolizam kolesterola u glijalnim stanicama.

Široko razumijevanje je korisno za identificiranje specifičnih molekularnih ciljeva podložnih farmakološkoj manipulaciji koji bi se mogli koristiti u neurodegenerativnim kontekstima. Nadalje, iako se stanice U373 i N1E-115 naširoko koriste kao stanične linije kojima se može upravljati za reprodukciju astrocitnih i neuronskih značajki [27-29,57], ove nalaze treba dodatno potvrditi u kulturama primarnih stanica. Iako bi se trebali uložiti daljnji napori kako bi se ojačala uključenost signalizacije neurotrofina u homeostazu kolesterola u mozgu, ovaj rad po prvi put pokazuje da NGF može neizravno vršiti neuroprotekciju utječući na metabolizam glijalnog kolesterola.

4. Materijal i metode

4.1. Kultura stanica

Stanice neuroblastoma N1E-115 i stanice U373 uzgajane su na 5% CO2 u DMEM na visokoj glukozi (Merck Life Science, Milano, Italija), s 10% (v/v) fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Merck Life Science , Milano, Italija) i dodana otopina penicilina/streptomicina.

Za induciranje neuronske diferencijacije, N1E-115 stanice su nasađene na 30% konfluentnosti i prebačene su na DMEM s 0,5% FBS tijekom 96 h.

Za induciranje neuronske diferencijacije, N1E-115 stanice su nasađene na 30% konfluentnosti i prebačene su na DMEM s 0,5% FBS tijekom 96 h.

Kokulture astrocita i neurona postavljene su prema protokolu koji su opisali Ioannou i kolege, uz modifikacije [59]. Parafinski razmaknici utisnuti su na pokrovna stakalca kako bi se osiguralo prianjanje; koristili smo razmaknice na pokrovnim stakalcima neurona kako bismo učinkovito spriječili mehanička oštećenja kada su stanice postavljene jedna nasuprot drugoj. Pokrovnice su zatim sterilizirane u etanolu i obložene poli-D-lizinom (Merck Life Science, Milano, Italija). N1E-115 su nasađene na presvučena pokrovna stakalca u željenoj gustoći i, kada su bile spremne za kokulturu, korištene su sterilne pincete da se podignu pokrovna stakalca s N1E-115 neuronima i stave licem prema dolje u { {10}}jažice zasađene s astrocitima U373.

Prethodni tretmani na stanicama N1E-115 provedeni su davanjem 0.1 µM rotenona (Sigma-Aldrich, Milano, Italija, R8875) tijekom 16 sati. Kontrolne stanice primile su DMSO (razrjeđenje 1:1000 u mediju stanične kulture) kao nosač. Stanice U373 tretirane su NGF-om (Alomone Labs, Jeruzalem, Izrael, N-245) u dozi od 100 ng/mL tijekom 48 sati u svim eksperimentima.

4.2. Priprema lizata i Western blot analiza

Stanice U373 su sonicirane (radni ciklus 20%, izlaz 3) u puferu uzorka (0,1 Tris-HClisHCl koji sadrži 10% SDS, koktel inhibitora proteaze, pH 6,8) kako bi se dobio ukupni lizat, kao što je prethodno opisano [ 60,61]. Dodan je Laemmli pufer, a uzorci su denaturirani na 95 ◦C tijekom 5 minuta. Proteinski ekstrakti (dvadeset mikrograma proteina) razdvojeni su na SDS-PAGE, a prijenos na nitroceluloznu membranu izveden je korištenjem trans-blot turbo prijenosnog sustava (Biorad Laboratories, Milano, Italija), kao što je ranije objavljeno [62].

Nakon toga, membrana je inkubirana na sobnoj temperaturi 1 h s 5% bezmasnim suhim mlijekom u Tris-puferiranoj slanoj otopini (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.05% Tween{ {10}}, pH 6,8) i ispitan preko noći na 4 ◦C sa sljedećim primarnim antitijelima: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-271708, razrjeđenje 1:500), anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-118, razrjeđenje 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-8984 , razrjeđenje 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, razrjeđenje 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, razrjeđenje 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, razrjeđenje 1:500), anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, SAD, NB400-148, razrjeđenje 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-58219, razrjeđenje 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-53570, razrjeđenje 1 :400), anti-vinkulin (SigmaAldrich, Milano, Italija, V9264, razrjeđenje 1:10 000) i anti- -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-47778, razrjeđenje 1 :10 000).

Membrane su uzastopno inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi s HRP-konjugiranim sekundarnim anti-mišjim ili anti-zečjim antitijelima (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italija). Antitijela vezana na proteine ​​vizualizirana su Clarity ECL Western blottingom (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italija, #1705061), a kemiluminiscencija je registrirana putem ChemiDoc MP sustava (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italija). Denzitometrijska analiza izvedena iz Western blotova zatim je provedena korištenjem ImageJ verzije 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) softvera za Windows. Vinkulin ili -aktin korišteni su kao kućni proteini, koji su služili kao interne kontrole za punjenje proteina. Denzitometrijski izračuni dobiveni su kao proizvoljne jedinice, izvedene iz omjera između intenziteta proteinske trake i odgovarajućeg kućnog proteina.

4.3. Uljno crveno O bojenje

Stanice U373 posađene su na pokrovna stakalca obložena poli-L-lizinom (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) u 6-pločama s jažicama, a bojanje Oil red O izvedeno je kao što je prethodno objavljeno [60]. Ukratko, stanice su fiksirane u paraformaldehidu (4% otopina) 10 minuta i nježno isprane tri puta s PBS-om. Fiksirane stanice su inkubirane sa 60% izopropanolom 5 minuta i zatim isprane destiliranom vodom. Nakon toga, stanice su ispitivane s 1 mL radne otopine Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi stavljanjem 6-pločice s jažicama na orbitalnu rotatorsku mućkalicu. Nakon inkubacije s otopinom za bojenje, jažice su tri puta isprane destiliranom vodom kako bi se uklonio višak boje.

Pokrovna stakalca su konačno montirana s Fluoroshield medijem za montiranje (Sigma-Aldrich, F6182), a autofluorescencija Oil red O vizualizirana je putem konfokalne mikroskopije (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Njemačka). Slike su snimljene pomoću Leica TCS SP8 opremljenog s povećanjem od 63x i Leica LAS X softverom (Milano, Italija). Kvantifikacija bojenja Oil red O provedena je pomoću softvera ImageJ za Windows i izračunata kao srednji intenzitet fluorescencije po površini stanice.
4.4. filipinsko bojenje

Bojanje Filipinom provedeno je korištenjem Filipin kompleksa (Sigma-Aldrich, F9765). Osnovna otopina filipina (10 mg/mL u PBS) uvijek je pripremana neposredno prije upotrebe. Stanice su fiksirane u paraformaldehidu (4% otopina) 10 minuta i isprane s PBS. U373 su zatim obojeni s 1 mL Filipin radne otopine (0,05 mg/mL u PBS) 1 h u mraku, na sobnoj temperaturi. Nakon toga, stanice su isprane tri puta s PBS-om, a pokrovna stakalca su postavljena s medijem za montiranje Fluoroshield i odmah analizirana konfokalnom mikroskopijom pomoću seta UV filtera (340-380 nm ekscitacija). Slike su snimljene pri povećanju od 40X. Filipinska kvantifikacija izračunata je kao srednji intenzitet fluorescencije po staničnoj površini korištenjem softvera ImageJ za Windows.

4.5. Kvantifikacija kolesterola

Kvantifikacija kolesterola provedena je pomoću kolorimetrijskog testa (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Milano, Italija) prema uputama proizvođača.

4.6. ELISA
Razine ApoE u mediju kulture procijenjene su korištenjem Human Apolipoprotein E ELISA Kit (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), prema uputama proizvođača.

4.7. Imunofluorescencija

Imunofluorescencija U373 stanica je izvedena kao što je prethodno opisano [60]. U373 su fiksirani u paraformaldehidu (4% u PBS) i testirani preko noći s primarnim antitijelima: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-271708, razrjeđenje 1:100) i anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-118, razrjeđenje 1:100). Zatim su stanice inkubirane 1 h s kozjim antimišjim sekundarnim antitijelom Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD, A28180) i s kozjim anti-zečjim sekundarnim antitijelom Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD , A27034). Provedeno je DAPI bojanje kako bi se vizualizirale jezgre, a pokrovna stakalca su konačno montirana s Fluoroshield medijem za montiranje. Uzorci su analizirani konfokalnom mikroskopijom, kao što je gore opisano.

4.8. ApoE utišavanje

Utišavanje ApoE mRNA provedeno je na U373 stanicama pomoću ApoE siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-29708) prema uputama proizvođača. Transfekcija je postavljena u 6-ploču za kulturu tkiva s jažicama gdje je 100000 stanica po jažici posađeno u DMEM medij za rast bez antibiotika s dodatkom 10% FBS-a tijekom 24 sata. Za svaku jažicu, siRNA transfekcijski medij (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc-36868) ​​dodan je u otopinu siRNA transfekcijske reakcije, pripremljenu pomoću siRNA duplexa i siRNA transfekcijskog reagensa (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD, sc29528). Stanice su zatim jednom isprane siRNA transfekcijskim medijem i prekrivene prethodno napravljenom transfekcijskom smjesom. Zatim je ploča s kulturom inkubirana 7 h na 37 ◦C u inkubatoru s 5% CO2.

DMEM medij za rast s 20% FBS-a i antibiotika (2-put više od normalne koncentracije) dodan je transfekcijskoj smjesi u svaku jažicu u omjeru 1:1. Stanice su inkubirane 18 h, a zatim je medij ispražnjen i zamijenjen svježim normalnim medijem za rast; 24 sata nakon ovog posljednjeg koraka, stanice su bile spremne za daljnje pokuse. Učinkovitost utišavanja ApoE procijenjena je RT-qPCR-om u U373 stanicama i ELISA-om u staničnom supernatantu; ApoE siRNA učinkovito je spriječila indukciju ApoE pomoću NGF-a u usporedbi s kodiranom siRNA (ApoE mRNA: 83% smanjenje; ApoE ELISA: 78% smanjenje). Značajno, ekspresija ApoE nakon utišavanja siRNA bila je niža od bazalne razine ekspresije opažene u kontrolnom U373 (ApoE mRNA: 72% smanjenje; ApoE ELISA: 58% smanjenje) (Slika S 3A, B).

4.9. Ekstrakcija RNA i PCR u stvarnom vremenu

Analiza mRNA provedena je kao što je prethodno objavljeno [22,63]. Ukratko, ukupna RNA iz U373 stanica ekstrahirana je s TRI reagensom (Merck Life Science, Milano, Italija) prema uputama proizvođača. Proveden je tretman DNAse (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milano, Italija), a zatim je RNA pročišćena korištenjem kompleta za čišćenje RNA (Zymo, Italija). RNA je sukcesivno reverzno transkribirana u cDNA pomoću cDNA reverzne transkripcije Cell Kit-a visokog kapaciteta (Applied Bio-System, Foster City, CA, SAD) i korištena za qPCR analizu.

Primeri korišteni u qRT-PCR za apoE bili su: naprijed 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 i obrnuti 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Primeri korišteni u qRT-PCR za gapdh (izabran kao referentni gen) bili su: naprijed 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 i obrnuto 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Proizvodnja ispravnog amplikona procijenjena je procjenom krivulje taljenja. Svaki biološki uzorak testiran je u triplikatu sa SYBR green IQ reagensom (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italija) i korištenjem detekcijskog sustava CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italija).

4.10. Kvantitativna procjena morfologije neurona

Morfologija neurona u stanicama N1E-115 procijenjena je snimanjem slika invertiranim mikroskopom. Morfometrijska analiza provedena je pomoću softvera ImageJ za Windows, a procijenjen je broj ukupnih stanica (izražen kao postotna varijacija kontrole), prosječna duljina neurita (izražena kao postotak kontrole) i stanica koje nose neurite. Za stanice koje nose neurite, postotak je izračunat dijeljenjem broja diferenciranih stanica s ukupnim brojem stanica po polju. N1E-115 bile su diferencirane deve kada su imale barem jedan neurit a čija je duljina jednaka ili veća od promjera some. Morfološka procjena provedena je na najmanje pet neovisnih eksperimenata, u kojima su analizirane najmanje tri slike.

4.11. Statistička analiza

Svi rezultati prikazani u ovoj studiji izraženi su kao srednja vrijednost ± SD (normalna distribucija standardne devijacije podataka provjerena je pomoću Shapiro–Wilkovog testa. Kada su uspoređivane dvije eksperimentalne skupine, primijenjeni su nespareni testovi. Međutim, kada su tri ili više skupina Uspoređeni su jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) praćena Tukeyjevim post hoc testom. Što se tiče pokusa s rotenonom, gdje su bile prisutne dvije varijable, korištena je dvosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim post-testom. p < 0.05 smatraju se statistički različitim Statistička analiza je provedena korištenjem GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, SAD) za Windows.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, MS; metodologija, MS i MC; validacija, MS i MC; formalna analiza, MS, MC, DP i MP; istraga, MC, NM, LL, MP i DP; resursi, MS i VP; čuvanje podataka, MS i MC; pisanje—priprema izvornog nacrta, MS i MC; pisanje—pregled i uređivanje, MP, LL, DP, NM i VP; vizualizacija, MS, MC i MP; nadzor, MS; projektna administracija, MS; nabava sredstava, MS Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje:

Ovo istraživanje financirali su Fondovi za istraživanje odjela 2021. (Sveučilište Molise) za MS i poziv Zaklade Jerome Lejeune za sesiju dodjele bespovratnih sredstava 2021.a, #2043 za MS

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:

Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku:

Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka:

Nije primjenjivo.

Zahvale:

Zahvaljujemo Claudiji Tonini na pomoći u određivanju kolesterola

Sukob interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; Fogelman, AM Kolesterol u mozgu: Dugi tajni život iza barijere. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Neurotrofini kao ključni regulatori staničnog metabolizma: Implikacije za homeostazu kolesterola. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Višestruki mehanizmi posreduju kolesterolom izazvanu sinaptogenezu u neuronu CNS-a. Mol. Ćelija. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Širenje plazma membrane: Herkulov zadatak neurona. Nat. Neurosci vlč. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brügger, B.; Ringler, P.; et al. Molekularna anatomija organele za trgovinu. Cell 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Neurotrofični faktor koji potiče iz mozga regulira metabolizam kolesterola za razvoj sinapsi. J. Neurosci. 2007., 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trapani, L.; Pallottini, V. Neuspjeh homeostaze kolesterola u mozgu: implikacije na sinaptičku disfunkciju i kognitivno opadanje. Curr. Med. Chem. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

9. Ješke, DJ; Dietschy, JM Regulacija stope sinteze kolesterola in vivo u jetri i trupu štakora mjerena pomoću [3H] vode. J. Lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Metabolizam kolesterola u neuronima i astrocitima. Prog. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Izražene razlike u sintezi kolesterola između neurona i glijalnih stanica postnatalnih štakora. J. Neurochem. 2009., 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, JW ATP-vezujući kazeta transporter A1: Stanični izvoznik kolesterola koji štiti od kardiovaskularnih bolesti. Physiol. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Outsourcing u mozgu: Ovise li neuroni o isporuci kolesterola putem astrocita? BioEseji 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. Christopherson, KS; Ullian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; Dovraga, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Trombospondini su proteini koje izlučuju astrociti koji potiču sinaptogenezu CNS-a. Ćelija 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com