Neuroprotektivni učinci i mehanizmi procijanidina in vitro i in vivo 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Ova studija procijenila jeneuroprotektivniučinci i mehanizmi procijanidina (PC). In vitro, stanice feokromocitoma štakora (stanice PC12) bile su izložene PCs-u (1,2 ili 4 ug/mL) ili N-acetil-L-cisteinu （NAC） (20 µM) tijekom 24 sata i zatim inkubirane s 200 µM H, O, 24 sata. U usporedbi sa samim H2O2, PC-i su značajno povećali antioksidativne aktivnosti (npr. glutation peroksidazu (GSH-Px), superoksid dismutazu (SOD), katalazu (CAT), smanjene razine reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i malondialdehida (MDA) i povećanu nuklearnu faktor-eritroid 2-povezan faktor 2 (Nrf2) akumulacija i povećana ekspresija kinon oksidoreduktaze 1 (NQO1), hem oksigenaze 1 (HO-1), podjedinice modifikatora glutamat-cistein ligaze (GCLM) i katalitička podjedinica glutamat-cistein ligaze (GCLC). In vivo, ličinke zebrice (AB soj) 3 dana nakon oplodnje (pdf) bile su izložene NAC（30 uM） ili PCs（4, 8 ili 16 ug/mL） u odsutnosti ili prisutnost 300 µM H, O, tijekom 4 dana. U usporedbi s H, O, samim, PCs je poboljšaoantioksidansaktivnosti (npr. GSH-Px, CAT i SOD), smanjene razine ROS i MDA, te pojačana aktivacija Nrf2/elementa antioksidativnog odgovora (ARE) i povišene razine ekspresije NQO1, HO-1, GCLM i GCLC U zaključku, ovi rezultati pokazuju da PC-ji imaju neuroprotektivne učinke putem aktivacije puta Nrf2/ARE i ublažavanja oksidativnog oštećenja.

Ključne riječi:procijanidini; neuroprotektivno; zebrica; PC12 stanice; Nrf2/ARE put

Kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Neurodegenerativna bolest odnosi se na polaganu i postupnu degeneracijuneuroniu ljudskom mozgu, što dovodi do raznih motoričkih i/ili kognitivnih problema i na kraju dovodi do smrti neurona[1]. S povećanjem broja starijih osoba, stopa incidencije senilnih neurodegenerativnih bolesti ubrzano raste [2,3]. Iako su temeljni mehanizmi neurodegeneracije još uvijek nejasni, brojni dokazi pokazuju da oksidativni stres uzrokovan prekomjernom proizvodnjom reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i/ili oštećenjem antioksidativnog obrambenog sustava igra ključnu ulogu u ovim bolestima [4-6]. U procesu neurodegeneracije, postoji neravnoteža između proizvodnje intracelularnog ROS-a i sposobnosti antioksidativnog obrambenog sustava da očisti ROS i/ili popravi ROS-posredovana oštećenja 7]I. Pretjerana proizvodnja ROS dovodi do oštećenja makromolekula. Stoga nakupljanje staničnih makromolekularnih oštećenja dovodi do nekroze [8,9. Posljedično, dopuna antioksidansima za uklanjanje viška ROS-a može pomoći u sprječavanju neurodegenerativnih bolesti. Prirodni bioaktivni spojevi sigurni su s malo ili bez ikakvih nuspojava. Stoga se sve veća pažnja posvećuje otkrivanju antioksidativnih spojeva iz prirodnih izvora.

Cistanche može poboljšati imunitet

Procijanidini (PC) su prirodni fenolni spojevi flavonoida i sadrže oligomere monomera katehina iepikatehin[10-12]. PC su prirodni nutrijenti i antioksidansi, a njihovi antioksidativni učinci su jači od onih vitamina C i vitamina E [13]

Međutim, neuroprotektivni učinci i mehanizam PC-a u pogledu oksidativnog oštećenja in vivo i in vitro ostaju nejasni.

Zebrice su slatkovodne tropske ciprinidne ribe koje žive samo u Indiji. Zanimljivo je da je otprilike 87 posto gena povezanih s ljudskim bolestima povezano s homolognim genima u zebricama [14]. U odnosu na eksperimentalne mišje modele, korištenje zebrice kao modelnog sustava povezano je s kraćim eksperimentalnim razdobljima, smanjenim troškovima i podatljivijim genskim manipulacijama [15]. Što se tiče in vitro modela, štakorfeokromocitomstanice (PC12 stanice) slične su neuronima u smislu morfologije, strukture i funkcije [16]. Njihova su svojstva vrlo konzistentna s onima primarnih kultiviranih neurona i imaju eksperimentalne prednosti u smislu lakog i stabilnog održavanja u kulturi [17]. Nadalje, PC12 stanice naširoko su korištene kao in vitro modeli za proučavanje živčanih stanica [18-20]. Vodikov peroksid (H, O2) je vrsta ROS-a koji može prodrijeti kroz stanične membrane i inicirati oksidativni stres [21]. Brojna su izvješća pokazala da se HO može koristiti za uspostavljanje modela oksidativnog stresa [22-24]. U ovoj studiji procijenili smo neuroprotektivne učinke i mehanizme PC-a u PC12 stanicama i ribicama zebricama.

2. Rezultati

2.1. Učinci PC-a na H2O2-Liječeno oštećenje PC12 stanica

Stanice PC12 bile su izložene 200 µM H, O tijekom 24 sata, a vitalnost stanica se smanjila na 56,5 posto (Slika la). Prethodno tretiranje stanica samo s PC-ima u dozi od 1, 2 ili 4 ug/mL nije imalo učinka na vitalnost stanica, dok je tretman s 1, 2 i 4 ug/mL PC-ima značajno zaštitio stanice PC12 od citotoksičnosti tretirane H2O2- poboljšanjem vitalnost stanica (Slika 1b,c,str<0.05 versus="" h,="" o2-treated="" group).="" however,="" pcs="" treatment="" alone="" at8ug/ml="" decreased="" cell="" viability="" (figure="" 1b).="" n-acetyl-l-cysteine="" (nac),="" whichis="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="">

2.2. Učinci PC-a na oksidativni stres PC12 stanica tretiranih H2O2

Razine ROS i malondialdehida (MDA) ukazuju na ozbiljnost oksidativnog oštećenja. Stanice PC12 izložene 200 µM H2O2 tijekom 24 sata povisile su razine ROS-a i MDA, a prethodni tretman s 2 i 4 ug/mL PC-a inhibirao je razine ROS-a i MDA（Slika 2a-c, str.<0.05 versus="" h,="" o2-induced="" group).="" to="" further="" evaluate="" the="" antioxidant="" effects="" of="" pcs="" in="" h,o,-induced="" pc12="" cells,="" we="" measured="">glutationaktivnosti peroksidaze (GSH-Px), katalaze (CAT) i superoksid dismutaze (SOD), te su primijetili da tretman H, O potiskuje aktivnosti GSH-Px, CAT i SOD. Međutim, H2O2-inducirani učinci su spašeni predtretmanom s PC-ima od 2 i 4 ug/mL （Slika 2d-f,p<0.05 versus="" h2o2-treated="">

2.3. Učinci PC-a na put nuklearnog faktora-eritroid 2-srodnog faktora 2(Nrf2)/ARE u stanicama tretiranim H2O2-PC12

Otkrili smo da je razina Nrf2 regulirana prema gore, a ekspresija Keapl smanjena nakon predtretmana PC-ima (2 i 4 ug/mL) prije tretmana HO, u usporedbi s tim razinama u skupini induciranoj HO (Slika 3a-c ,str<0.05 versus="" h,o,-induced="" group）.="" furthermore,="" pcs="" （4="" μg/ml）="" facilitated="" nuclear="" localization="" of="" nrf2="" under="" h,o,-lesioning="" conditions="" (figure=""><0.05 versus="" h2o2-induced="" group).addition-ally,="" western="" blotting="" showed="" that="" heme="" oxygenase="" 1="" (ho-1),="" quinone="" oxidoreductase="" 1(nqo1),="" glutamate-cysteine="" ligase="" catalytic="" subunit(gclc),="" and="" glutamate-cysteine="" ligase="" modifier="" subunit="" (gclm)="" levels="" were="" upregulated="" following="" pcs(2="" and="" 4="" ug/ml)treatment="" compared="" with="" h2o2="" alone="" (figure="" 3g-k,=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Slika 3. Učinci PC-a na put Nrf2/ARE u stanicama PC12 tretiranim H, O{2}}. (a) Razine proteina Nrf2 i Keap1, kako je određeno Western blotom; (b) relativna ekspresija Nrf2/GAPDH proteina (omjer prema kontroli); (c) relativna ekspresija proteina Keap1/GAPDH (omjer prema kontroli); (d) razine ekspresije proteina nuklearnog Nrf2 i citoplazmatskog Nrf2, kako je određeno Western blottingom; (e) relativna ekspresija nuklearnog Nrf2/LaminB proteina (omjer prema kontroli); (f) relativna ekspresija citoplazmatskog Nrf2/GAPDH proteina (omjer prema kontroli); (g) razine proteina HO-1, NOO1, katalitičke podjedinice glutamat-cistein ligaze (GCLC) i GCLM, kako je određeno Western blotingom; (h) relativna ekspresija proteina HO-1/GAPDH (omjer prema kontroli); (i) relativna ekspresija proteina NQO1/GAPDH (omjer prema kontroli); (j) relativna ekspresija proteina GCLC/GAPDH (omjer prema kontroli); (k) Relativna ekspresija GCLM/GAPDH proteina (omjer prema kontroli). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Svi eksperimenti su provedeni tri puta. Vrijednosti s različitim slovima iznad značajno se razlikuju (str<0.05, one-way="">

2.4. Nrf2/ARE signalizacija je odgovorna za antioksidativne učinke posredovane računalima

Kao što je prikazano na slici 4a,b, Nrf2 siRNA inhibira ekspresiju Nrf2. U međuvremenu, liječenje Nrf2 siRNA eliminiralo je zaštitne učinke PC-a protiv oksidativnog oštećenja tretiranog H2O2-, što je dokazano smanjenom vitalnošću stanica u skupini transfektiranoj Nrf2-siRNA (Slika 4c). Istovremeno, djelovanje PC-a na sadržaj MDA i aktivnost SOD poništeno je nokdaunom Nrf2 pod uvjetima oštećenja H2O2- (Slika 4d,e).

Slika 4. Nrf2/ARE signalizacija odgovorna je za PCs-posredovana antioksidativna djelovanja u H2O2-tretiranim PC12 stanicama. (a) Učinkovitost nokauta otkrivena je određivanjem ekspresije proteina Nrf2 korištenjem Western blottinga; (b)Nrf2/ Relativna ekspresija proteina GAPDH (omjer prema kontroli); (c) vitalnost stanica; (d) razine MDA; (e) aktivnost SOD. Podaci su izraženi kao sredina ± SD. Svi eksperimenti su provedeni tri puta. Vrijednosti s različitim slovima iznad značajno se razlikuju, (str<0.05, **p="" <="" 0.01="" relative="" to="" control="" group,="" one-way="">

2.5. Učinci PC-a na pokretljivost ličinki zebrice nakon tretmana H2O2

H2O2-inducirano oksidativno oštećenje smanjilo je ukupnu udaljenost plivanja ličinki zebrice. Liječenje PC-ima (4, 8 i 16 ug/mL) spasilo je lokomotorne nedostatke izazvane H2O2-, što je dokazano povećanom udaljenošću kretanja u odnosu na skupinu s H2O2 (Slika 5a,b,p<0.05 versus="" h2o2-treated="" group).="" nac,="" which="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="" control.="" moreover,="" pcs(16ug/ml)or="" nac（30="" μm）="" alone="" did="" not="" affect="" the="" locomotor="" behavior="" of="" normal="" zebrafish="">

Slika 5. Učinci PC-a na pokretljivost ličinki zebrice tretiranih H2O2-. (a) Tipični obrasci tragova plivanja ličinki zebrice u svakoj skupini; (b) prosječna ukupna udaljenost ličinki zebrice u svakoj skupini. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Svi eksperimenti ponovljeni su tri puta. Vrijednosti s različitim slovima iznad značajno se razlikuju (str<0.05, one-way="">

2.6. Učinci PC-a na oksidativni stres ličinki Zebrajiša tretiranih s H2O2

Tretiranje PC-a (4, 8 i 16 ug/mL) na ličinke zebrice smanjilo je H2O2-inducirana povećanja intracelularnog stvaranja ROS (Slika 6a,b, p<0.05 versus="" h,="" o,-treated="" group).="" lipid="" peroxidation="" assays="" also="" indicated="" that="" pcs(4,8,="" and="" 16="" ug/ml)="" dose-dependently="" blocked="" h2o2-induced="" increases="" in="" mda="" levels="" in="" zebrafish="" larvae="" (figure="" 6c,=""><0.05 versus="" ho2-induced="" group).="" furthermore,="" gsh-px="" activity="" was="" reversed="" by="" pc's="" (4,8,="" and="" 16="" μg/ml）="" treatment="" （figure=""><0.05 versus="" h2o2-treated="" group）.="" additionally,="" pcs（8="" and="" 16="" μg/ml）increased="" h2o2-induced="" reductions="" in="" cat="" and="" sod="" activities（figure="" 6e,f,p=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Slika 6. Učinci PC-a na oksidativni stres u ličinki zebrice tretiranih H2O2-. (a) Reprezentativne fluorescentne fotomikrografije ličinki zebrice; (b) ROS razine mjerene su pomoću softvera za snimanje; (c) razine MDA; (d) aktivnost GSH-Px; (e) aktivnost CAT; (f) aktivnost SOD. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Svi eksperimenti su provedeni tri puta. Vrijednosti s različitim slovima iznad značajno se razlikuju (p < 0.05,="" jednosmjerna="">

2.7. Učinci PC-a na puteve Nrf2/ARE u H2O2-tretiranim laroama zebrica

Zaštitni učinci tretmana PC-ima u ličinki zebrice tretiranih s H2O2- sugeriraju da su možda bili uključeni putevi Nrf2/ARE. Razine ekspresije Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC i GCLM (Slika 7a-e,p<0.05 versus="" h,="" o,-induced="" group)were="" up-regulated="" following="" pcs(16="" ug/ml)="" treatment="" compared="" to="" levels="" after="" h2o,="" treatment="">

Figure 7. Effects of PCs on the Nrf2/ARE pathway in H>O,-tretirane ličinke zebrice. (a) razine Nrf2; (b) razine GCLC; (c) razine GCLM; (d) razine HO-1; (e) razine NQO1. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Vrijednosti s različitim slovima iznad značajno se razlikuju (str<0.05, one-way="" anova="">

Ovaj je članak izvađen iz Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules