Nc886, nekodirajuća RNA, novi je biomarker i epigenetski posrednik staničnog starenja u fibroblastima

Sažetak:

Funkcionalne studije organizama i ljudskih modela otkrile su da epigenetske promjene mogu značajno utjecati na proces starenja. Nekodirajuća RNA (ncRNA), jedan od epigenetskih regulatora, igra važnu ulogu u modificiranju ekspresije mRNA i njihovih proteina. Može posredovati u fenotipu stanica. Zabilježeno je da nc886 (=vtRNA2-1 ili pre-miR-886), duga ncRNA, može suzbiti stvaranje tumora i fotooštećenja keratinocita uzrokovana UVB zračenjem. Ovo je istraživanje imalo za cilj odrediti ulogu nc886 u replikativnom starenju fibroblasta i utvrditi mogu li tvari koje mogu kontrolirati ekspresiju nc886 regulirati stanično starenje.

U replikativnim fibroblastima starenja ekspresija nc886 bila je smanjena dok je metilirani nc886 povećan. Došlo je do promjena u biomarkerima starenja uključujući aktivnost SA- -gal i ekspresiju p16INK4A i p21Waf1/Cip1 u stanicama starenja. Ovi nalazi pokazuju da je smanjenje nc886 povezano sa starenjem povezano sa staničnim starenjem fibroblasta i da povećana ekspresija nc886 ima potencijal za suzbijanje staničnog starenja. Koncentrat AbsoluTea 2.0 (ATC) povećao je ekspresiju nc886 i poboljšao staničnu starenje fibroblasta inhibicijom biomarkera povezanih sa starenjem. Ovi rezultati pokazuju da nc886 ima potencijal kao nova meta za usporavanje starenja i da ATC može biti snažan epigenetski sastojak protiv starenja.

Stanično starenje je širok pojam koji pokriva fenomene kao što su smanjena stanična funkcija, smanjeni proliferativni kapacitet i oštećenje DNK uzrokovano mnogim čimbenicima. Stanično starenje nije pojedinačni, predvidljivi proces, već kombinirani učinak niza različitih fizioloških, genetskih i okolišnih čimbenika. U istraživanju je utvrđeno da se Cistanche može oduprijeti starenju jer je princip protiv starenja Cistanche uglavnom povezan s različitim aktivnim sastojcima koje sadrži. Cistanche je bogata raznim biološki aktivnim tvarima, kao što su polisaharidi, flavonoidi, acetofenoni, itd. Među njima, polisaharid je jedan od glavnih aktivnih sastojaka Cistanche, koji ima različite zdravstvene funkcije kao što su jačanje imuniteta, antioksidacija, reguliranje metabolizma itd. te može ublažiti stupanj starenja tijela.

Click cistanche tubulosa prednosti

Ključne riječi:

fibroblasti; replikativno starenje; epigenetska regulacija; nc886; ekstrakt zelenog čaja.

1. Uvod

Stanično starenje u ireverzibilnom stanju nakon zaustavljanja stanične proliferacije pokazalo se kao potencijalno važan čimbenik disfunkcije tkiva i starenja organizama [1]. Starenje karakterizira visoka aktivnost beta-galaktozidaze (SA- -gal) povezane sa starenjem, povećana ekspresija biomarkera starenja kao što su p16INK4A i p21Waf1/Cip1 te smanjena ekspresija LaminB1 [2]. Dva su osnovna tipa staničnog starenja: replikativno starenje i prerano starenje izazvano stresom. Replikativno starenje se definira kao fenomen kada se normalne stanice prestanu dijeliti nakon što dostignu ograničeni broj dioba. Povezan je s kronološkim starenjem. Kontinuirano nakupljanje oštećenja može potaknuti replikativno starenje fibroblasta, što dovodi do gubitka sposobnosti preoblikovanja i organiziranja izvanstaničnog matriksa (ECM). Glavna obilježja ostarjelog dermisa su smanjena količina kolagenih vlakana i povećana proizvodnja matriksnih metaloproteinaza (MMP), što doprinosi tankoj i neorganiziranoj strukturi dermisa [3,4].

Epigenetski regulacijski mehanizmi ključni su medijatori procesa starenja, prilagodbe stresorima i promjenama vezanim uz dob u genomskom i molekularnom okruženju. Te se epigenetske promjene događaju na različitim razinama, uključujući masivnu redukciju histona u jezgri, deformaciju histona post-translacijskom modifikacijom i metilacijom DNA, zamjenu kanonskih histona varijantama histona i promijenjenu ekspresiju nekodirajuće RNA (ncRNA) tijekom organskog i replikativnog starenja [5]. ,6]. nc886 je ncRNA duga 101 nukleotida koja se može vezati na ciljni protein, posredujući tako u aktivnosti proteina i kontrolirajući ekspresiju gena [7]. nc886 je također predložen kao supresor tumora uglavnom na temelju njegovog uzorka ekspresije i njegove genomske lokacije na ljudskom kromosomu 5q31, lokusu gena supresora tumora. Značajka ekspresije nc886 je često utišavanje zloćudnih bolesti metilacijom CpG DNA u promotorskoj regiji [8]. Na temelju prethodnih studija, otkrili smo da je smanjenje ekspresije nc886 uzrokovano UVB zračenjem povezano s povećanjem COX-2 i MMP-9 putem RNA-aktiviranog protein kinazom (PKR) puta u keratinocitima i da promicanje ekspresije nc886 može biti korisna strategija za razvoj UVB zaštitnih materijala [9,10].

Zeleni čaj je proučavan kao lijek za niz dermatoloških stanja, kao što su akne, rosacea, psorijaza, virusne bradavice, pa čak i rak kože. Fenolni spojevi uključujući galnu kiselinu (GC) i epigalokatehin galat (EGCG) dobro su poznati aktivni spojevi u zelenom čaju. (-)-Epigalokatehin-3-(3"-O-metil) galat (3" Me-EGCG) je jedinstveni O-metilirani oblik EGCG-a i sadržan je u oolong čaju i zelenom čaju. Konkretno, Jangwon br. 3 (amorepacifičke sorte zelenog čaja) sadrži više 3" Me-EGCG nego druge vrste zelenog čaja [11]. Za 3" Me-EGCG je objavljeno da pokazuje antioksidativne i fotozaštitne učinke na keratinocite [12] . U ovoj studiji istraživali smo ulogu nc886 u replikativnom starenju fibroblasta i utvrdili može li visokokoncentrirani pripravak 3" Me-EGCG zelenog čaja (AbsoluTea Concentrate 2.0) koji bi mogao povećati ekspresiju nc886 poboljšati stanično starenje.

2. Rezultati

2.1. Kemijski profil AbsoluTea koncentrata 2.0 (ATC)

Kemijski profil koncentrata AbsoluTea 2.0 (ATC) prikazan je na slici 1B. Rezultati su dobiveni uporabom HPLC za ATC pripremljen kako je opisano u odjeljku Metoda. ATC je sadržavao 30 posto ili više 3" Me-EGCG (Slika 1B). Poznato je da ekstrakt zelenog čaja ne sadrži 3" Me-EGCG ili pokazuje koncentraciju manju od 6 posto [13,14]. I mladi i stari fibroblasti tretirani ATC-om pokazali su veći porast ekspresije nc886 nego oni tretirani 70-postotnim etanolnim ekstraktom zelenog čaja (dodatna slika S1A). Osim toga, razine ekspresije SA- -gal u starim fibroblastima liječenim ATC-om smanjene su više nego u onima liječenim ekstraktom zelenog čaja (dodatna slika S1B).

2.2. nc886 Regulira stanično starenje fibroblasta

Kako bismo promatrali ulogu nc886 u staničnom starenju fibroblasta, upotrijebili smo replikativni model starenja kroz uzgoj i potkulturu. Kao što je prikazano na Dodatnoj slici S2, aktivnost SA- -gal i razine ekspresije senescentnih markera p16INK4A i p21Waf1/Cip1 bile su povećane, a ekspresija Lamina B1 smanjena je u starim fibroblastima u usporedbi s mladim stanicama. Mnoge prethodne studije su pokazale da je starenje uzrokovano oksidativnim stresom. Kako bi se potvrdilo je li ovaj niz oksidativnog stresa uključen u staničnu starenje, izmjerene su razine ROS u mladim (p3) i starim fibroblastima (p30). Rezultati su pokazali da su se razine ROS-a povećale sa starenjem (dodatna slika S2D).

Kako bi se promatrao potencijalni utjecaj nc886 na staničnu starenje u fibroblastima, određena je razina ekspresije gena nc886 u svakom broju prolaza. Razina ekspresije nc886 smanjena je s povećanjem broja prolaza (Slika 2A). Zabilježeno je da je ekspresija nc886 smanjena s metilacijom CpG otoka. Kako bi se utvrdilo je li regulacija nc886 u starim fibroblastima posredovana metilacijom nc886, izveden je PCR specifičan za metilaciju. Kao što je prikazano na slici 2A, metilacija nc886 je povećana s povećanjem broja prolaza (slika 2A). Ovaj rezultat pokazuje da je smanjena ekspresija nc886 u velikom broju prolaza fibroblasta posljedica povećanja metilacije nc886 DNA. Kako bi se potvrdila uloga nc886 u starenju fibroblasta, određene su promjene u markerima starenja u modelima prekomjerne ekspresije i knock-down modela nc886. Rezultati su otkrili da je skupina senescentnih fibroblasta s prekomjernom ekspresijom nc886 pokazala smanjenu aktivnost SA-beta-gal, smanjene razine ekspresije p16INK4A i p21Waf1/Cip1 i povećane razine laminB1.

Uz to, povećanje ROS-a u starim fibroblastima smanjeno je prekomjernom ekspresijom nc886 (Slika 2B). Nasuprot tome, u skupini mladih fibroblasta s nokdaunom nc886, ubrzano je stanično starenje i povećane su razine ekspresije staničnih markera starenja kao što su p16INK4A i p21Waf1/Cip1 (Slika 2C). Ovi rezultati sugeriraju da nc886 može regulirati stanično starenje fibroblasta reguliranjem ekspresije markera starenja (Slika 2B, C).

2.3. ATC ublažava stanično starenje reguliranjem ekspresije nc886

Gore dobiveni rezultati pokazali su da povećanje ekspresije nc886 može poboljšati stanično starenje posredovanjem markera starenja. Kako bi se promatrao učinak ATC na ekspresiju nc886, razina ekspresije i metilacija nc886 u starim fibroblastima procijenjeni su nakon tretmana s ATC u necitotoksičnoj koncentraciji (Slika 3A). Kao što je prikazano na slikama 3B i C, ATC je značajno povećao ekspresiju nc886 i smanjio metilaciju nc886 na način ovisan o koncentraciji. Ovaj rezultat pokazao je da je povećanje ekspresije nc886 pomoću ATC posredovano inhibicijom metilacije nc886. Osim toga, primijetili smo da ATC inhibira aktivnost SA- -gal i smanjuje razine ekspresije senescentnih markera p16INK4A i p21Waf1/Cip1 u senescentnim fibroblastima (Slika 3D, E). Međutim, ekspresija LaminB1 za koju se zna da se smanjuje sa starenjem bila je povećana u starim fibroblastima tretiranim ATC-om (Slika 3E). Ovi rezultati pokazuju da ATC može ublažiti stanično starenje povećanjem ekspresije nc886.

Slika 2. nc886 regulira stanično starenje fibroblasta. (A) Ekspresija nc886 i metiliranog nc886 prema prolazu potvrđena je PCR-om u stvarnom vremenu i normalizirana s 18s rRNA. (B) Fragment nc886 pojačan i pročišćen iz ljudske genomske DNA transfektiran je u stare stanice s lipofektaminom 3000. Prekomjerna ekspresija je potvrđena promatranjem ekspresije nc886 PCR-om u stvarnom vremenu i ekspresije SA- -gal fluorescentnom mikroskopijom i protočnom citometrijom. Ekspresija proteina markera starenja i stvaranje intracelularnog ROS-a uočeno je u modelu prekomjerne ekspresije nc886. (C) Stanice su transfektirane s anti-oligos (si-ctrl i si-nc886) u koncentraciji od 250 ppm korištenjem LipofectaminTM RNAiMAX reagensa. Obaranje nc886 potvrđeno je promatranjem ekspresije nc886 PCR-om u stvarnom vremenu i ekspresije SA- -gal fluorescentnom mikroskopijom i protočnom citometrijom. Ekspresija markera starenja potvrđena je Western blotom. Mjerne trake: 200 µm. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD tri neovisna testa. *, p < 0,05; **, p < 0,01 u usporedbi s kontrolom.

2.4. ATC regulira promjene ECM-a i SASP-a povezane s dobi

Karakteristika starenja fibroblasta je da je aktivnost MMP-1, komponente koja razgrađuje kolagen, povećana, dok je sinteza kolagena smanjena [15,16]. Povećanje MMP-1 i smanjenje kolagena potvrđeno je u starim fibroblastima s velikim brojem prolaza (Slika 4A).

Međutim, ATC je potisnuo ekspresiju MMP-1 i povećao sintezu kolagena u starim fibroblastima. Ovaj rezultat ukazuje da ATC može poboljšati promjene ECM-a povezane sa starenjem regulacijom ekspresije MMP-1 i sinteze kolagena u starim fibroblastima (Slika 4B). Zabilježeno je da sekretorni fenotip povezan sa starenjem (SASP) u kojem stare stanice luče specifične proupalne čimbenike, čimbenike rasta i proteolitičke enzime doprinosi nastanku i napredovanju bolesti povezanih sa starenjem [17-19]. Promatrali smo učinak ATC-a na SASP, posebno proupalne citokine kao što su IL-1, IL_6 i IL-8. Kao što je prikazano na slici 4C, ATC je smanjio razine ekspresije IL-1, IL-6 i IL-8 izazvane starenjem. Ovo sugerira da ATC može imati učinak protiv starenja putem potiskivanja SASP-a.

3. Rasprava

Stare stanice prolaze kroz karakteristične morfološke promjene koje uključuju povećanu i često nepravilnu reorganizaciju jezgre i kromatina. Kada je starenje inducirano oštećenjem DNA, smanjenjem replikacije ili ekspresijom onkogena, Lamin B1 se prvenstveno gubi. Različiti unutarnji ili vanjski uzroci stresa mogu pokrenuti put odgovora na oštećenje DNA (DDR) da aktiviraju put p53 i/ili p16INK4A. p16INK4A može inaktivirati Cdk4/6, rezultirati nakupljanjem fosforiliranog pRb, poremetiti regulaciju transkripcijskog faktora E2F i inducirati zaustavljanje staničnog ciklusa ili starenje [20,21]. Povećana proizvodnja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) koje uglavnom proizvode disfunkcionalni mitohondriji može dovesti do staničnog starenja oštećenjem DNK i transaktivacijom signalnih putova starenja, uključujući p53, p16INK4A i p21Waf1/Cip1 [22].

U ovoj smo studiji otkrili da je ekspresija nc886 smanjena s povećanjem broja prolaza i da je regulacija ekspresije nc886 ublažila staničnu starenje posredstvom proizvodnje LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 i ROS. nc886 se transkribira pomoću RNA polimeraze III (Pol III) i utišava hipermetilacijom CpG DNA u mnogim zloćudnim bolestima [8]. Uočili smo da je ekspresija nc886 smanjena s metilacijom CpG otoka u starim fibroblastima. Ovaj rezultat ukazuje da hipermetilacija CpG otoka smanjuje funkcionalnost nc886 kao supresora staničnog starenja.

Specifični putovi ekspresije gena na koje utječe nc886 nisu jasni. Vjerojatno će uključivati ​​prethodno prijavljene za druge ncRNA. nc886 može igrati kritične uloge u staničnom starenju putem izravnog ili neizravnog posredovanja u signalnom putu starenja na razinama strukture kromatina, aktivnosti faktora transkripcije, posttranskripcijske i posttranslacijske regulacije gena [23]. Na primjer, nc886 može posredovati u putu starenja napredovanja staničnog ciklusa.

Zabilježeno je da je AK156230 kao ncRNA povezana s indukcijom replikativnog starenja fibroblasta kroz svoje uloge u autofagiji i progresiji staničnog ciklusa. Niža regulacija AK156230 potaknula je stanice da pokažu odgovore na starenje aktiviranjem p53 i p21 uz istovremeno smanjenje ciklin-ovisne kinaze 1 (CDK1) [24]. ncRNA1 (SAL-RNA1), MALAT1 i MIAT povezani sa starenjem poznati su kao negativni regulatori staničnog starenja. Oni su smanjeni u senescentnim fibroblastima. Niža regulacija ovih gena može dovesti do povećanja markera starenja kao što su SA-gal, p16, p21 i p53 [25]. Učinak MALAT1 na staničnu starenje postignut je padom onkogenog transkripcijskog faktora b-Myb/Mybl2.

Iako je ekspresija različitih ncRNA pogođena tijekom starenja, samo nekoliko njih je funkcionalno uključeno u starenje. Budući da je lokalizacija ncRNA važna za razumijevanje mehanizama uključenih u funkciju, nuklearne i citoplazmatske ncRNA raspravljaju se odvojeno kada se opisuju molekularni mehanizmi koji utječu na starenje [26]. ncRNA smještena u citoplazmi može funkcionirati kao regulator translacije kroz sparivanje baza s ciljnom mRNA [27]. ncRNA može utjecati na razinu ekspresije proteina povećanjem ili smanjenjem stabilnosti mRNA [28].

Na primjer, tijekom starenja izazvanog RAS-om, citoplazmatski UCA1 doprinosi stabilizaciji p16 mRNA izdvajanjem hnRNPA1 [29]. nc886 sadrži vezno mjesto aktivirano protein kinazom RNA (PKR). Vezanje PKR–nc886 može inhibirati aktivnost PKR. PKR, citoplazmatski receptor za dvolančanu RNA (dsRNA), reguliran je serin/treonin protein kinazom koja se aktivira infekcijom, citokinima, oksidativnim stresom i zračenjem (uključujući UV), što dovodi do naknadne indukcije upale i apoptoze [20]. ,21] [30,31]. nc886 veže se za PKR s afinitetom usporedivim s dsRNA i sprječava aktivaciju PKR-a. Obaranje nc886 rezultira fosforilacijom podjedinice 2 podjedinice eukariotskog inicijacijskog faktora (eIF2) putem PKR puta, što uzrokuje staničnu smrt i inhibira globalnu sintezu staničnih proteina. Zabilježeno je da je proizvodnja COX-2, IL-8 i MMP-a pomoću TNF-a posredovana putem PKR u ljudskim hondrocitima [32].

U prethodnoj studiji također smo pokazali da se upala izazvana UVB zračenjem može regulirati putem nc886-PKR puta u keratinocitima [10]. Štoviše, PKR je povezan s ozljedom izazvanom oksidativnim stresom u neonatalnim srčanim miocitima. Inhibicija PKR-a štiti od ozljeda izazvanih H2O2-atenuacijom apoptoze i upale [33]. Upala i oksidativni stres glavni su čimbenici koji potiču proces starenja. Prema tome, PKR put može posredovati u staničnom starenju fibroblasta izazvanom deplecijom nc886. Da bi se razjasnio detaljan regulatorni mehanizam uključen u učinak nc886 na staničnu starenje fibroblasta, potrebna su daljnja istraživanja.

Učinci ekstrakta zelenog čaja protiv starenja naširoko su opisani u prethodnim studijama. Antioksidativno i protuupalno djelovanje zelenog čaja dobro su poznati mehanizmi koji doprinose njegovom učinku protiv starenja. U preliminarnom testu otkrili smo da je ATC značajno povećao ekspresiju nc886 za više od 70 posto etanolnog ekstrakta zelenog čaja (dodatna slika S1A). Ovaj rezultat sugerira da se koncentrirani katehini, uključujući 3" Me-EGCG, mogu pripisati povećanju ekspresije nc886. Kako bismo odredili može li sredstvo za stimulaciju nc886 spriječiti stanično starenje, promatrali smo učinak ATC-a na stare fibroblaste. ATC je povećao ekspresiju nc886 za inhibirajući razinu metilacije gena nc886 u starim fibroblastima (Slika 3B, C). ATC je također ublažio stanično starenje posredovanjem u biomarkerima starenja kao što je aktivnost SA- -gal, LaminB1, p16INK4A i p21Waf1/Cip1 (Slika 3E ). Štoviše, ATC je obnovio povećanu MMP-1 i smanjenu proizvodnju kolagena izazvanu staničnim starenjem (Slika 4B). Čimbenici SASP neznatno variraju ovisno o vrsti stanice i vrsti stresa izazvanog starenjem, obično su poznati kao ciljni geni za NF-κB koji reguliraju proupalne citokine kao što su IL-6 i IL-8.

U ovoj smo studiji potvrdili da je ATC potisnuo povećanu ekspresiju IL-1, IL_6 i IL-8 u starim stanicama (Slika 4C). Ne možemo isključiti mogućnost da se učinak poboljšanja zelenog čaja na staničnu starenje postiže višestrukim mehanizmima, uključujući regulaciju nc886, antioksidaciju i protuupalno djelovanje. Međutim, naši rezultati sugeriraju da povećani nc886 pomoću ATC igra ključnu ulogu u suzbijanju staničnog starenja, posljedično utječući na ECM proizvodnju fibroblasta.

4. Materijali i metode

4.1. Priprema ATC

Osušeni listovi zelenog čaja (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon br. 3) korišteni za ovu studiju dobiveni su iz biljaka čaja uzgojenih u čajnom vrtu Dolsongi (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Južna Koreja. Suho lišće čaja (170 g) ekstrahirano je sa 70 posto EtOH (v/v) na sobnoj temperaturi 16 h. Ekstrakt je zatim usitnjen u prah pomoću liofilizatora (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Kina). Za pripremu ATC, ekstrakt EtOH je deseterostruko koncentriran rotacijskim isparivačem i napunjen na kolonu napunjenu AB-8 smolom (unutarnji promjer 5 cm, duljina 45 cm). Ispiranje kolone otapalom je izvedeno s 4 puta većim volumenom sloja (BV) od 20 posto, 30 posto i 100 posto EtOH (v/v). U ovoj studiji, zaostala otapala u koloni uklonjena su zračnim kompresorom prije eluiranja. 30-postotni eluat EtOH koncentriran je dvadeset puta i nanesen na poliamidnu kolonu (unutarnji promjer 2,5 cm, duljina 40 cm). Poliamidna kolona je eluirana 5 puta BV od 10 posto i 100 posto EtOH. 100 postotni EtOH eluat je pažljivo koncentriran i liofiliziran.

4.2. Kultura stanica i tretman stanica s ATC

Ljudski dermalni fibroblasti (HDF) kupljeni su od ATCC (Manassas, VA, SAD). Kultura stanica provedena je u kontroliranim uvjetima na 37 ◦C s 5 posto CO2 korištenjem Dulbecco modificiranog Eagleovog medija (WELGENE, Daegu, Koreja) s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i 1 posto penicilina -streptomicin (WELGENE, Daegu, Koreja). Stanice su nasađene u 6-pločice s jažicama u gustoći od 2 × 105 stanica/ploči. Nakon postizanja 60 posto konfluencije, tretirani su naznačenom koncentracijom ATC tijekom 72 sata.

4.3. SA- -Gal bojenje i analiza protočnom citometrijom

Stanice su obojene pomoću SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japan) prema uputama proizvođača. Stanice su analizirane pomoću EVOS® FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i BD FACS Calibur protočnog citometra (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD).

4.4. Intracelularno mjerenje ROS-a

Proizvodnja intracelularnog ROS-a praćena je pomoću C20,70 -diklorodihidrofluorescein diacetata (H2DCFDA; Molecular Probes), fluorescentnog ROS indikatora. Stanice su inkubirane s H2DCFDA (5 µM) 30 minuta na 37 ◦C. Fluorescencija povezana sa stanicom detektirana je protočnim citometrom BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD).

4.5. PCR u stvarnom vremenu i PCR specifičan za metilaciju

Ukupna RNA ekstrahirana je pomoću TRIzola (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Kvantitativno mjerenje RNA provedeno je pomoću spektrofotometra za mikroploču Epoch (BioTek, Winooski, VT, SAD). cDNA je sintetizirana pomoću am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Genomska DNA ekstrahirana je pomoću AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Daejeon, Koreja). Pretvorba bisulfita provedena je pomoću pribora za metilaciju EZ DNA (Zymo Research, CA, SAD). Za izvođenje qRT-PCR-a korišten je AMPIGENE® cDNA Synthesis Kit (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, SAD) i ABI7500 PCR sustav u stvarnom vremenu (Ambion Inc, Austin, TX, SAD). Sekvence primera korištene u ovoj studiji opisane su u tablici 1.

4.6. Određivanje laktat dehidrogenaze

LDH analiza korištena je za određivanje citotoksičnosti mjerenjem aktivnosti laktat dehidrogenaze (LDH) otpuštene iz oštećenih stanica. Ispitivanje je provedeno korištenjem kompleta LDH Cytotoxicity WST Assay (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA) prema uputama proizvođača.

4.7. Transfekcija DNK za prekomjernu ekspresiju nc886 i transfekcija siRNA za obaranje nc886

Da bi se dobila DNK za prekomjernu ekspresiju nc886 u stanicama, DNK je amplificirana s AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Koreja) korištenjem genomske DNK HDF-a kao predloška i sljedećih početnica opisanih u tablici 2.

Amplificirana DNA je pročišćena pomoću QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Njemačka). Pročišćena DNA je transfektirana reagensom LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Za obaranje nc886, stanice su transfektirane s anti-oligos (si-ctrl i si-nc886) u koncentraciji od 250 pM korištenjem Lipofectamine™ RNAiMAX reagensa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).

4.8. Western Blotting

Stanični lizati su pripremljeni s PRO-PREP™ otopinom za ekstrakciju proteina (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Koreja). Ukupni proteini su odvojeni NuPAGE sustavom elektroforeze (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i prebačeni na membrane od poliviniliden difluorida (PVDF). Imunoblotiranje je provedeno pomoću primarnog antitijela protiv p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD), MMP1, Col1A2 i -aktina (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, SAD). Skenirane denzitometrijske vrijednosti traka analizirane su korištenjem ImageJ, verzija softvera 1.52a (Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, MD, SAD).

4.9. Imunoenzimski test

Nakon naznačene inkubacije, kolagen (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan) i MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) u supernatantu kulture izmjereni su pomoću enzimski vezanog imunoeseja (ELISA) prema uputama proizvođača.

4.10. Statistička analiza

Svi rezultati prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Razlike između dvije skupine procijenjene su t-testom ili analizom varijance (ANOVA) pomoću GraphPad Prism. Statistička značajnost naznačena je kao p < 0.05 ili p < 0,01.

5. Zaključci

Zaključno, regulacija ekspresije nc886 može biti potencijalna meta staničnog starenja u fibroblastima, a ATC može biti snažan epigenetski sastojak protiv starenja.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, YK, KH i EJ; metodologija YK, HJ, N.-HP i K.-SL; čuvanje podataka, YK, HJ i EC; istraga, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP i EJ; administracija projekta, WP, DP i EJ; resursi, WP i DP; nadzor, DP i EJ; pisanje— izvorni nacrt, YK; pisanje—recenzija i uređivanje, N.-HP, KH, WP, DP i EJ Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje:

Ovo istraživanje nije dobilo vanjska sredstva.

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:

Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku:

Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka:

Podaci će biti dostupni na zahtjev.

Sukob interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Stanično starenje: kada se loše stvari dogode dobrim stanicama. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007., 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapor, VK; Dureja, J. Starenje: pristupi njegovoj kontroli. Drug Discov. Danas Ther. Strategija. 2010., 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Mehanizmi fotostarenja i kronološko starenje kože. Arh. Derm. 2002., 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Obilježja starenja fibroblasta. Mech. Starenje Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Epigenetika starenja i bolesti povezane sa starenjem. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17-S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Genetika i epigenetika starenja i dugovječnosti. Stanični ciklus 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]

7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I.; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Prekursor miR-886, nova nekodirajuća RNA potisnuta u raku, povezuje se s PKR i modulira njegovu aktivnost. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Pjesma, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; et al. Epigenetska regulacija transkripcija RNA polimeraze III u ranoj tumorigenezi dojke. Oncogene 2017, 36, 6793-6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; ja, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886, nekodirajuća RNA, inhibira UVB-induciranu ekspresiju MMP-9 i COX-2 putem PKR puta u ljudskim keratinocitima. Biochem. Biophys. Res. Komun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. Inhibicija UVB-inducirane upale pomoću ekstrakta Laminaria japonica putem regulacije nc886-PKR puta. Nutrients 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Identifikacija profila epigalokatehin-3-O-(3-Ometil)-galata (EGCG300Me) i aminokiselina u raznim kultivarima čaja (Camellia sinensis L.). Sažetak podataka. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY Antioksidativni i citoprotektivni učinci (-)-epigalokatehin-3-(300-O-metil) galata. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Učinci ekstrakta zelenog čaja na prekomjernu tjelesnu težinu i pretile žene s visokim razinama kolesterola lipoproteina niske gustoće (LDL-C): randomizirano, dvostruko slijepo i unakrsno placebo kontrolirano kliničko ispitivanje. BMC komplement. Alternativa. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Oralne interakcije između ekstrakta flavanola zelenog čaja i ekstrakta antocijanina crnog vina korištenjem novog staničnog modela: Uvid u učinak različitih oralnih epitela. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papismadov, N.; Solomonov, I.; Sagi, I.; Križhanovsky, V. ECM put starenja u starenju: komponente i modifikatori. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Kronično liječenje resveratrolom poboljšava adheziju stanica i ublažava upalni fenotip u ostarjelim ljudskim fibroblastima. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Sun, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Sekretorni fenotipovi povezani sa starenjem otkrivaju stanično neautonomne funkcije onkogenog RAS-a i tumorskog supresora p53. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Chkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Stanično starenje i senescencijski sekretorni fenotip: Terapijske mogućnosti. J. Clin. Istražite. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Stanično starenje: od fiziologije do patologije. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. Bitna funkcija histon deacetilaze 1 u kontroli proliferacije i suzbijanju CDK inhibitora. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Uloga matričnih metaloproteinaza u starenju: remodeliranje tkiva i šire. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017., 1864., 2015.–2025. [CrossRef]

23. Victorelli, S.; Passos, JF Detekcija reaktivnih kisikovih vrsta u starim stanicama. Metode Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNAs regulatorne mreže u staničnom starenju. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, MOJ; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Identifikacija lncRNA, AK156230, kao novog regulatora staničnog starenja u fibroblastima mišjih embrija. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimyan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Drvo, WH, 3.; Becker, KG; et al. lncRNA povezane sa starenjem: duge nekodirajuće RNA povezane sa starenjem. Stanica starenja 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH Nove uloge lncRNA u starenju. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. Duga nekodirajuća antisense RNA kontrolira Uchl1 prijevod putem ugrađenog SINEB2 ponavljanja. Nature 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

29. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. Kontrola diferencijacije somatskog tkiva dugom nekodirajućom RNA TINCR. Nature 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Koordinirana kontrola starenja pomoću lncRNA i novog T-box3 korepresorskog kompleksa. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Lamin Gubitak B1 biomarker je povezan sa starenjem. Mol. Biol. Cell 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Kinaza za pamćenje. Ispred. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, KL PKR aktivacija uzrokuje upalu i izlučivanje MMP-13 u ljudskim degeneriranim zglobnim hondrocitima. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Men, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. Inhibicija PKR-a štiti od H2O2 -induciranih ozljeda na neonatalnim srčanim miocitima slabljenjem apoptoze i upale. Sci. Rep. 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]

Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Nok-Hyun Park 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Wonseok Park 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 i Eunsun Jung 1,*.

1 Biospectrum Life Science Institute, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Koreja; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EZ); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 Odjel za temeljna istraživanja i inovacije, R&D centar Amorepacific Corporation, Youngin-si 17074, Koreja; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

* Correspondence: bioso@biospectrum.com

For more information:1950477648@nn.com