Nanozyme Hydrogel za poboljšano stvaranje alkil radikala i snažnu antitumorsku terapiju†

Alkilni radikali (Rc), koji se ne oslanjaju na stvaranje kisika za uzrokstanični stres, primijenjeni su uliječenje tumora, ali velika količina glutationa (GSH) u tumorskim stanicama reagira s alkilnim radikalima, čimesmanjujući njihov antitumorski učinak. U ovoj studiji, poboljšani sustav za stvaranje alkilnih radikala koji reagira nablisko infracrveno svjetloje dizajniran. Okidač alkilnog radikala 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-il) propan]-dihidroklorid (AIPH) i enzim pirit (FeS2) inkapsulirani su u agarozni hidrogel za pripremu AIPH–FeS2–hidrogel (AFH) sustav. FeS2 se može koristiti kao fototermalno sredstvo za pretvaranje energije bliske infracrvene svjetlosti u toplinsku energiju, što dovodi do otapanja hidrogela. AIPH je istovremeno induciran da proizvodi alkilne radikale. FeS2 se također može koristiti kaopojačivač oksidativnog stresaza smanjenje unutarstaničnog sadržaja GSH, čime se pojačava terapeutski učinak alkilnih radikala. Naposljetku, slobodni radikali neovisni o kisiku koje stvara AFH sustav pod bliskim infracrvenim laserskim zračenjem i fototermalnim tretmanom moguubiti stanice rakakroz sinergijskooksidacija/fototermalni učinak. AFH sustav koji je ovdje razvijen pruža nove uvide u poboljšanje terapeutskog učinka alkilnih radikala.

KLIKNITE OVDJE DA ZNATE KAKO CISTANCHE ZA PROTIV RAKA

Uvod

Posljednjih su godina tretmani temeljeni na slobodnim radikalima poput fotodinamičke terapije, nedinamičke terapije i elektrodinamičke terapije postali popularni izbori za liječenje raka dojke.1–3 Vanjski podražaji (laser, ultrazvuk, električna polja) potiču proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) koje induciraju staničnu smrt uzrokujući ozbiljna oksidativna oštećenja ili disfunkciju metabolizma stanice.4-6 Nažalost, hipoksična tumorska okolina i brza proliferacija tumorskih stanica smanjuju terapijske ishode takvih tretmana koji se oslanjaju na proizvodnju ROS-a, posebno u liječenje solidnih tumora.7-10 Alkilni radikali nova su vrsta slobodnih radikala koji ne ovise o stvaranju kisika za ubijanje stanica i pokazali su se učinkovitima u liječenju tumora u normoksičnim i hipoksičnim okruženjima.11 Oslobođeni alkil radikali mogu inducirati apoptozu stanica raka povećanjem oksidativnog stresa, što dovodi do oštećenja lipida i DNA u stanici. Kao tipični inicijator slobodnih radikala, 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propan]-dihidroklorid (AIPH) može generirati alkilne radikale na visokim temperaturama. 12 To čini čak i u nedostatku kisika. Stvoreni slobodni radikali otrovni su za stanice i odmah će oksidirati stanične elemente ili stupiti u interakciju s kisikom kako bi se proizvele sekundarne toksične tvari.13 Čak i u mikrookruženju hipoksičnog tumora, AIPH može proizvesti alkilne radikale za povećanje intracelularnog lipidnog hidroperoksida i dodatno potaknuti apoptozu tumorskih stanica.14 Sve ovo ukazuje da je Rc obećavajući lijek za liječenje raka.

Svjetlo ili toplina koriste se kao vanjski podražaji u fototermalnoj terapiji.15-17 Fototermalna terapija (PTT) temeljena na laserskom zračenju blizu infracrvenog (NIR) koristi se za sprječavanje agregacije tumorskih stanica; oslanja se na lokalne toplinske učinke za uklanjanje tumora.18-20 Nekoliko fototermalnih sredstava (PTA) kao što su nanokristali zlata i molibden disulfid koriste se u kombinaciji s AIPH za oslobađanje alkilnih radikala kao odgovor na infracrveno lasersko zračenje.19,21-23 Međutim , tumorsko mikrookruženje (TME) obično ima visoku razinu ekspresije glutationa (GSH) u solidnim tumorima jer GSH igra važnu ulogu u otpornosti na radioterapiju kroz spontanu reakciju ili reakciju kataliziranu GSH S transferazom s ksenogenima.24,25 Osim toga, kao redukcijsko sredstvo, GSH može izravno ukloniti alkilne radikale.21,26 To smanjuje učinkovitost terapija temeljenih na alkilnim radikalima. Nanoenzim pirit (FeS2), kao novi fototermalni nanomaterijal, ne samo da ima dobar fototermalni učinak pod NIR svjetlom, već ima i nanoenzimsku aktivnost.27 FeS2 nanaza je pokazala sličnu aktivnost kao glutation oksidaza (GSH OXD), oksidirajući GSH u oksidirani glutation (GSSG).28 U TME je utvrđeno da smanjenje GSH remeti REDOX ravnotežu stanica i uzrokuje oksidativni stres.29 Stoga se očekuje da će FeS2 postići dobar sinergistički učinak s AIPH.

Minimalno invazivni fotoreaktivni hidrogelovi nedavno su postali popularni kao platforma za kontrolirano otpuštanje lijeka.30-32 Hidrogelovi koaguliraju dok se ubrizgavaju u tumorsko tkivo i služe kao dugotrajni depo.33 Ovaj lokalni oblik primjene može se ponoviti nakon jednog ubrizgavanje. Osim toga, parametri poput snage lasera i vremena zračenja mogu se modificirati kako bi se promijenila brzina otpuštanja lijeka, čime se proširuje primjenjivost ove metode liječenja.34,35 S obzirom na te prednosti, pretpostavljeno je da bi upotreba hidrogelova za isporuku FeS2 i AIPH na TME poboljšao bi učinkovitost terapija temeljenih na slobodnim radikalima.

U ovoj studiji dizajnirana je metoda koja koristi intratumorsku dostavu injekcijskog hidrogela koji sadrži enzim FeS2 i inicijator slobodnih radikala AIPH. Prvo je pripremljen hibridni sustav AIPH-FeS2-hidrogela (AFH) unošenjem nanočestica FeS2 i AIPH u agarozni hidrogel. Hidrogel je čvrst na sobnoj temperaturi, a FeS2 i AIPH su inkapsulirani unutar njegove matrice. Nakon što je ozračen bliskim infracrvenim (NIR) svjetlom, FeS2 pretvara NIR svjetlosnu energiju u toplinsku energiju, što uzrokuje zagrijavanje AFH sustava, a zatim se hidrogel topi i oslobađa FeS2 i AIPH. Na visokim temperaturama, AIPH se razgrađuje i proizvodi alkilne radikale. Nakon toga, enzim FeS2, koji oponaša aktivnost GSH-OXD, smanjuje unutarstanični sadržaj GSH. Uništavanje GSH će pospješiti učinak ubijanja alkilnih radikala. Budući da AFH može ostati na mjestu tumora dugo vremena, AFH sustav može omogućiti preciznu kontrolu nad otpuštanjem alkilnih radikala promjenom intenziteta lasera i vremena zračenja. Konačno, slobodni radikali neovisni o kisiku koje stvara AFH sustav pod NIR zračenjem i foto-termalnim tretmanom mogu sinergistički ubiti stanice raka kroz sinergistički oksidacijski/fototermalni učinak, a rast tumora tijekom ciklusa tretmana dobro je naseljen. Ukratko, ovdje osmišljen sustav AFH dodatno pojačava terapeutski učinak AIPH promjenom redoks homeostaze (Shema 1).

Rezultati i rasprava

Za pripremu kompozitnog hidrogela koji sadrži FeS2 i AIPH korišten je agarozni hidrogel niskog tališta. FeS2 je pomiješan s vodenom otopinom agaroze na 60 C i zatim je napunjen okidačem alkil radikala AIPH, nakon čega je uslijedilo brzo hlađenje na sobnu temperaturu. Tako je nastala matrica AFH hidrogela. Za karakterizaciju morfologije FeS2 korištena je transmisijska elektronska mikroskopija (slika 1A). FeS2 nano zim pokazao je kuglastu morfologiju s prosječnom veličinom čestica od oko 148 nm (Sl. S1†). UV-vis apsorpcijski spektri FeS2 (slika 1B) pokazali su da je FeS2 snažno apsorbiran u NIR rasponu na 808 nm. Ovo svojstvo čini FeS2 dobrim PTA. Fototermalna izvedba enzima FeS2 pri različitim koncentracijama (0, 25, 50 i 100 mg mL 1 ) proučavana je ozračivanjem otopine laserskim sustavom od 0,5 W cm 2 808 nm (slika 1C). Učinak zagrijavanja otopine bio je izravno proporcionalan koncentraciji FeS2. Temperatura otopine 100 mg mL 1 FeS2 porasla je za oko 17,5 C u samo 5 minuta laserskog zračenja, pokazujući dobru fototermalnu izvedbu FeS2. Skenirajuća elektronska mikroskopija također je pokazala da AFH hidrogel ima složenu mrežu strukture pora i raspodjelu veličine pora (Sl. 1D), što hidrogel čini pogodnim za punjenje lijeka za isporuku. Fototermalna stabilnost također je važan kriterij za procjenu kvalitete PTA.36 Otopina od 200 mg mL 1 FeS2 zagrijavana je 808 nm NIR laserom 5 minuta, zatim je laser isključen, a otopina FeS2 ostavljena da se ohladi. prirodno do sobne temperature. Ovaj proces je ponovljen nekoliko puta kako bi se procijenila fototermalna stabilnost FeS2 (slika 1E). Nije bilo očite promjene u krivulji zagrijavanja svakog fototermalnog ciklusa, a primijećena je samo mala razlika u vršnoj temperaturi postignutoj nakon 5 minuta zračenja, što potvrđuje fototermalnu stabilnost FeS2. Reološka analiza je također otkrila visok modul skladištenja pripremljenog hidrogela u krutom stanju na sobnoj temperaturi (slika 1F). Kako se temperatura povećavala, hidrogel se postupno socenzirao i otapao, a modul pohrane postupno se smanjivao. Zatim je proveden eksperiment fototermalnog otapanja na FeS2 hidrogelu. Očvrsli AFH (FeS2 sadržan u hidrogelu) stavljen je u staklenu posudu koja sadrži deioniziranu vodu. Na sobnoj temperaturi, pripremljeni AFH hidrogel zadržao je svoj skrutnuti oblik, ali nakon 10 minuta zračenja laserom od 808 nm, hidrogel se gotovo potpuno otopio, a nanomaterijal FeS2 je otpušten i otopljen u vodi u staklenoj posudi (Sl. 1G). Termalna infracrvena kamera također je potvrdila značajno povećanje temperature AFH tijekom zračenja (slika 1H). Spektar rendgenske fotoelektronske spektroskopije (XPS) FeS2 nakon reakcije s hidrogelom pokazao je da FeS2 sadrži Fe i S elemente (Sl. S2†). Kao što je prikazano na slici S3,† sadržaj GSH značajno je smanjen nakon koinkubacije FeS2 i GSH, ima pozitivnu krivulju korelacije s vremenom i koncentracijom. Nadalje, POD-slična aktivnost FeS2 ovisi o veličini. Nanozimi veličine 150 nm pokazali su veću aktivnost od onih veličine 280 i 687 nm (Sl. S4†).

Na temelju karakteristika visoke učinkovitosti AFH-a procijenjeni su njegovi antitumorski učinci. U početku je kit za bojenje živih/mrtvih stanica fluorescein diacetat/propidijev jodid korišten za istraživanje ubijajućeg učinka pripremljenog AFH hidrogela u kombinaciji s NIR zračenjem. PBS plus NIR skupina i skupina samo AFH pokazale su snažnu zelenu fluorescenciju, dok AIPH jedva da je pokazao bilo kakav učinak ubijanja (slika 2A). Pripremili smo hidrogel koji sadrži samo FeS2 (FH) kako bismo potvrdili relativne rezultate pokusa. Pripremljeni hidrogel koji je sadržavao samo FeS2 (FH) u kombinaciji s NIR imao je umjeren učinak ubijanja. Značajno je da je tretman AFH plus NIR imao najbolji citotoksični učinak.

Proba diklorofluorescein diacetata korištena je za otkrivanje sposobnosti AIPH da proizvodi ROS. AIPH je pokazao slabiju sposobnost induciranja ROS-a u odsutnosti laserskog zračenja, dok je FH napunjen FeS2 pokazao umjereni stupanj proizvodnje ROS-a nakon NIR zračenja (slika 2B). Svijetlozelena fluorescencija opažena u skupini koja je primala AFH plus NIR mogla bi se pripisati otpuštanju FeS2 i AIPH nakon laserskog zračenja (slika 2C). Nadalje, skupine AIPH i AIPH plus NIR pokazale su vrlo malo zelene fluorescencije (Sl. S5†). Test CCK-8 također je pokazao iste rezultate. Stanična održivost skupine AFH plus NIR bila je oko 8,5 posto, što se značajno razlikovalo od ostalih skupina (slika 2D). Visoka temperatura će pospješiti razgradnju AIPH da bi se proizveli alkilni radikali. U isto vrijeme, FeS2 može ispoljiti aktivnost GSH-OXD za smanjenje unutarstaničnog GSH. GSH, kao sveprisutni tripeptid koji sadrži tiol, sintetizira se iz svojih sastavnih aminokiselina (glutaminske kiseline, cisteina i glicina) u mnogim stanicama. GSH se u izobilju proizvodi u raznim vrstama stanica raka. GSH u stanicama općenito postoji u reduciranom obliku, koji može reagirati s oksidirajućim tvarima kao što su alkilne skupine dok se oksidira u svoj oksidirani oblik glutation disulde (GSSG), čime se smanjuje antitumorski učinak temeljen na slobodnim radikalima.37 Iscrpljenost GSH poremetit će redoks ravnotežu stanica, izazvati oksidativni stres i konačno dovesti do stanične apoptoze.38 Ellmanov reagens korišten je za testiranje sposobnosti svake skupine da smanji GSH. AFH kombinirana NIR skupina pokazala je najbolju sposobnost smanjenja GSH (Slika 2E).

Shema 1 Nanozyme hidrogel za pojačano stvaranje alkilnih radikala i moćnu antitumorsku terapiju

Slika 1 (A) TEM slika FeS2. (B) UV-Vis-NIR spektar apsorbancije otopine FeS2. (C) Krivulje zagrijavanja za različite koncentracije otopina nanočestica FeS2 nakon laserskog zračenja na 808 nm (0,5 W cm 2 ) tijekom 5 minuta. (D) SEM slika hidrogela. (E) Promjena temperature otopine FeS2 pod cikličkim laserskim zračenjem. (F) Reološka i temperaturna krivulja (crvena i crna, redom) za pripremljeni AFH kao odgovor na 0.5 W cm 2 808 nm lasersko zračenje. (G) Morfologija pripremljenog AFH prije i nakon 0,5 W cm 2 808 nm laserskog zračenja tijekom 10 minuta i (H) infracrvene toplinske slike pripremljenog AFH nakon zračenja.

S obzirom na njegovu dobru izvedbu in vitro kao enzima koji oponaša PTA i GSH OXD, učinak AFH na NIR pretvorbu svjetlosti u toplinu proučavan je in vivo. BALB/c miševima supkutano su ubrizgane 4T1 stanice da se formiraju tumori. Slika 3A prikazuje krivulju promjene temperature PBS skupine i AFH skupine nakon 808 nm NIR laserskog zračenja 0,5 W cm 2 tijekom 10 minuta. Temperatura skupine AFH porasla je za oko 17,6 C nakon zračenja, dok se temperatura skupine PBS gotovo nije povećala. Visoka temperatura može promijeniti vlažnost stanične membrane tumora, čime se povećava propusnost stanične membrane, što zauzvrat uzrokuje toplinsko oštećenje proteina.39,40 Na kraju, stanice raka gube sposobnost proliferacije. Zatim je procijenjena antitumorska aktivnost posredovana AFH u 4T1 miševa s tumorom. Miševi s tumorom podijeljeni su nasumično u pet skupina. Volumen tumora miševa u skupini PBS plus NIR i skupini AIPH brzo se povećao tijekom dvotjednog perioda liječenja, a skupina AFH pokazala je blagi učinak supresije tumora (Slika 3C). To je bilo zato što se agaroza sporo metabolizirala, a neki lijekovi su se sporo oslobađali. Grupa AFH plus NIR imala je najjači učinak na rast tumora. Tijekom tretmana, volumen tumora miševa značajno je smanjen. Nakon perioda tretmana, miševi su žrtvovani, a tumori su izolirani i izvagani. Rezultati za težinu tumora bili su u skladu s rezultatima za volumen tumora (slika 3D).

Važno je da tijekom cijele studije nisu primijećene promjene u tjelesnoj težini u liječenoj skupini, što ukazuje na to da liječenje nije izazvalo nikakvu značajnu sistemsku toksičnost kod miševa (slika S6†). Ovaj je rezultat vrlo ohrabrujući jer iako su mnogi materijali pokazali dobre eksperimentalne rezultate, oni su također uzrokovali ozbiljne nuspojave, koje ozbiljno ometaju njihove kliničke izglede.41,42 20,70 - Diklorouorescin diacetat korišten je za mjerenje intra - tumorsko stvaranje ROS-a u tretiranih miševa. Bojenje je značajno pojačano u tumorima podvrgnutim kombiniranoj terapiji AFH plus NIR (slika 3E). Povećana proizvodnja slobodnih radikala dovela je do poboljšanog terapeutskog učinka u životinjskom modelu. TUNEL i Ki-67 analize bojanja korištene su za provjeru stanične apoptoze i proliferacije (slika 3E). Tumorska tkiva u skupini AFH plus NIR bila su masivno nekrotična bez značajne proliferacije.

Slika 3 (A) Infracrvene toplinske slike tumora nakon zračenja s 808 nm laserom (0,5 W cm 2 ) tijekom 10 min u naznačenim skupinama liječenja. (B) Povećanje temperature kod miševa kojima su implantirani 4T1 tumori nakon 808 nm laserskog zračenja (0,5 W cm 2 ) tijekom 10 minuta u naznačenim skupinama za liječenje. (C) Volumen tumora se mijenja tijekom vremena u skupinama tretiranim kako je naznačeno. (D) Prosječna vrijednost težine tumora povezana s navedenim tretmanima. (E) ROS, Ki-67 i TUNEL obojeni tumorski dijelovi iz naznačenih skupina za liječenje. **P <0,01, ***P <0,005; Studentov t-test.

Nakon tretmana vitalni organi (srce, jetra, slezena, pluća i bubrezi) nisu imali upale niti oštećenja. Indeksi jetre i bubrega bili su normalni (sl. 4A–D i S7†). Opsežni in vivo eksperimentalni podaci pokazuju da sinergistička terapija AFH i PTT ima dobre terapijske učinke i biokompatibilnost. Ima dobre izglede za kliničku medicinsku primjenu u budućnosti.

Slika 4. Rezultati in vivo sigurnosnih eksperimenata. Podaci o biokemiji krvi uključujući markere funkcije bubrega: (A) markeri funkcije jetre: CRE, (B) BUN i (C) ALT nakon različitih tretmana. (D) Rezultati histopatološke analize (slike obojene H&E) glavnih organa, srca, pluća, jetre, bubrega i slezene, miševa koji su bili izloženi različitim tretmanima 16 dana nakon injekcije. Mjerne trake: 100 mm.

Zaključak

Dizajnirali smo injekcijski foto-reagirajući hidrogel koji može istovremeno postići terapiju slobodnih radikala i PTT inkapsulacijom enzima FeS2 i izvora alkilnih radikala AIPH u agarozni hidrogel. Pod laserskim zračenjem od 808 nm, PTA FeS2 potiče zagrijavanje AFH sustava i dovodi do oslobađanja AIPH i njegove razgradnje da bi se proizveli alkilni radikali. U isto vrijeme, FeS2 može smanjiti unutarstanični sadržaj GSH, čime dodatno uništava redoks homeostazu. Brzina otapanja hidrogela može se mijenjati pomoću parametara kao što su gustoća snage lasera i veličina točke. I in vivo i in vitro studije pokazale su da kombinacija AFH s NIR zračenjem može postići snažne učinke ubijanja tumora s beznačajnim štetnim učincima. Sustav hidrogela dizajniran u ovoj studiji pruža strategiju za poboljšanje terapijskih sustava temeljenih na alkilnim radikalima.

Reference

1 D. Zhu, J. Zhang, G. Luo, Y. Duo i BZ Tang,Adv. Sci., 2021, e2004769.

2 C. Huang, S. Ding, W. Jiang i F.-B. Wang,Nanosmjera, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu, Y. Qu, K. Shi, B. Chu, Y. Jia, X. Xiao, Q. He i Z. Qian,Brada. Chem. Lett., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning, Y. Zheng, K. Qiao, G. Li, Q. Bai i S. Xu,J. Nanobiotechnol., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu, T. Zhang, Y. Li, C. Huang, M. Suo, L. Xia, Y. Xu, G. Li i BZ Tang,Biomaterijali, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu, R. Ling, H. Chen, M. Lyu, H. Qian, K. Wu, G. Li i X. Wang,Nano Res., 2022, DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu, M. Lyu, W. Jiang, M. Suo, Q. Huang i K. Li,J. Mater. Chem. B, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo, PA Gurr, DE Dunstan i GG Qiao,ACS Nano, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu, Z. Liu, Y. Li, Q. Huang, L. Xia i K. Li,Biomaterijali, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li, R. Luo, X. Liang, Q. Wu i C. Gong,Brada. Chem. Lett., 2021., DOI:10.1016/j.cclet.2021.11.048.