Morin ublažava ozljede jetre i bubrega uzrokovane aflatoksinom B1-inhibicijom otpuštanja izvanstaničnih zamki heterofila, oksidativnog stresa i upalnih odgovora kod pilića

Za više informacija kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

SAŽETAKAflatoksin B1 (AFB1) je sekundarni metabolit koji proizvodi Aspergillus favus i parazitski aspergillus, uglavnom prisutan u žitaricama, kikirikiju, kukuruzu i drugim usjevima, koji ozbiljno ugrožavaju perad, zdravlje ljudi i okoliš. Morin, flavonoidni spoj ekstrahiran iz biljaka Moraceae, posjeduje antioksidativno, antibakterijsko iprotuupalnoučinci. Međutim, ima li morin zaštitni učinak na AFB1-induciranjetraioštećenje bubregau pilića nije posebno prijavljeno. U ovoj smo studiji uglavnom potvrdili zaštitni učinak morina na oštećenje jetre i bubrega izazvano AFB1-u pilića i razjasnili njegov mehanizam. Utvrđeno je da morin može značajno smanjiti jetrene biokemijske pokazatelje alanin aminotransferaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST) i bubrežne pokazatelje kreatinina (CRE) i razine dušika iz uree (BUN). U međuvremenu, histopatološki pregled pokazao je da morin učinkovito ublažava AFB1-izazvano oštećenje jetre, uključujući poremećaj hepatocita, oticanje i upalnu infiltraciju stanica, te učinkovito ublažava oštećenje bubrega, uključujući nekrozu bubrežnih stanica, eksfolijaciju i vakuolizaciju. Daljnje istraživanje njegovog mehanizma pokazalo je da morin značajno inhibira AFB1-izazvano oslobađanje heterofilnih izvanstaničnih zamki (HETs) i smanjuje razinu malondialdehida (MDA), ali povećava razine superoksid dismutaze (SOD), glutation peroksidaze (GSH- Px), i katalaze (CAT) in vivo. Štoviše, kvantitativna PCR (qRT-PCR) analiza u stvarnom vremenu pokazala je da je morin također značajno smanjio AFB1-induciranu ekspresiju mRNA faktora tumorske nekroze- (TNF-), interleukina-6(I{{10} }) i interleukin-1 (IL-1), inducibilna sintaza dušikovog oksida (iNOS), ciklooksigenaza-2 (COX-2), kaspaza-1, kaspaza{ {16}} i kaspaza-11. U zaključku, svi rezultati potvrdili su da morin može zaštititi AFB1-izazvana oštećenja jetre i bubrega inhibiranjem otpuštanja HET-a, reguliranjem oksidativnog stresa i inhibicijom upalnog odgovora, što sugerira da morin se može koristiti kao potencijalni lijek za prevenciju i liječenje aflatoksikoze u industriji uzgoja peradi.

Ključne riječi:morin, aflatoksin B1, izvanstanične zamke heterofila, upalni odgovor, oksidativni stres

UVOD

Aflatoksin je vrsta sekundarnog metabolita s visokom toksičnošću i niskom molekularnom težinom koju proizvode gljivice kao što su Aspergillus flavus, parazitski aspergillus i specifični aspergillus, koji imaju jaku toksičnost, mutagenost i kancerogenost, među kojima aflatoksin B1 (AFB1) ima najjaču toksičnost (Rawal et al, 2010). Zagađenje AFB1 povezano je sa sigurnošću prehrane, proizvodnjom životinja i sigurnošću hrane, pa čak prijeti i ljudskom zdravlju. Stoga je važno riješiti kontaminaciju AFB1 u hrani za životinje i preostale probleme kod životinja i stočnih proizvoda. Izloženost aflatoksinima tijekom trudnoće predstavlja prijetnju zdravlju fetusa, koji se može prenijeti s majke na fetus krvlju iz pupkovine i majčinim mlijekom (Denning i sur., 1990.). Zabilježeno je da je razina AFB1 u serumu žutice s nedostatkom 6-fosfoglukoza dehidrogenaze u novorođenčadi, te je utvrđeno da je 58 posto novorođenčadi i 75 posto majki bilo pozitivno (Raafat et al, 2021.). Kao najvažniji hepatocelularni karcinogen, AFB1 je glavni uzrok hepatocelularnog karcinoma (HCC) u svijetu, a studije su otkrile da AFB1 i virus hepatitisa B (HBV) djeluju zajedno kako bi dodatno povećali učestalost HCC-a (Rushing i Selim, 2019. ).AFB1-induciranoksidativni stresjedan je od važnih načina na koji se ispoljava njegova toksičnost (Abdel-Wahhab i Aly, 2003). Ali dublje mehanizme koji leže u pozadini aflatoksikoze i učinkovitije lijekove za prevenciju i liječenje tek treba istražiti.

Morin (kemijska struktura prikazana je na slici 1), je vrsta prirodnog pigmenta ekstrahiranog iz biljaka Moraceae, koji pripada flavonoidima i ima biološka svojstva, uključujući protuupalna (Wei et al), (Li et al, 2020), i antioksidans 2015.), antibakterijski (Wei i sur., 2015.), antiaterosklerozni (Zhou i sur., 2017.), snižava šećer u krvi i djeluje protiv stresa, a široko se koristi u kliničkom liječenju koronarne bolesti srca, dijabetesa i raka. Zabilježeno je da morin može imati antibakterijske učinke na Staphylococcus aureus, Bacillus i Micrococcus flavus ometanjem bakterijske sinteze DNA i inhibicijom aktivnosti adenozin trifosfata (ATPaze) (Xu et al. 2001). Neke studije pokazuju da morin može inhibirati TLR4/NF-xB i aktivirati Nrf2 i HO-signalne puteve za zaštitu LPS-om izazvanog akutnogozljeda jetrekod miševa (Tian et al, 2017). Morin također može učinkovito poboljšati fibrozu jetre izazvanu dietil-amonijevim nitratom kod štakora moderiranjem prijenosa signala Hippo/YAP i TGF- 1/Smad (Perumal et al, 2017). Trenutačno je objavljeno da različiti spojevi kao što su vitamini A, Cand E (Alpsoy i Yalvac, 2011.) i eugenol mogu odoljetioksidativni stresodgovor AFB1. Međutim, kao tradicionalni antioksidativni lijek, može li morin također igrati zaštitnu ulogu u jetri iozljeda bubregau pilića s aflatoksikozom nije zabilježena.

Neutrofilne izvanstanične zamke (NET) su prva linija obrane tijela protiv vanjskih patogena otkrivenih posljednjih godina. Mreže su mrežna struktura s DNK kao kosturom i modificiranom citruliniranim histonom 3 (citH3) i elastazom (Wei et al.,

2019b), s antibakterijskim (Brinkmann et al., 2004), antivirusnim (Saitoh et al, 2012) i antiparazitskim (Wei et al, 2016) učincima. Heterofilne izvanstanične zamke (HET) imaju sličnu funkciju kao NET, osim što HET nemaju ekspresiju mijeloperoksidaze (MPO) (Chuammitri et al., 2009). Dokazano je da N. canine može potaknuti oslobađanje psećih NET in vitro kako bi se oduprlo infekciji (Wei et al, 2016). Također je potvrđeno istraživanje koje može smanjiti respiratorne napade kod šarana abamektina (AVM) inhibicijom aktivacije signalnog puta PI3K-ERK, čime se inhibira otpuštanje NET-a kod šarana (Zheng et al, 2020). Slično abamektinu, morin je priznati terapijski lijek, je li njegov terapeutski učinak povezan s otpuštanjem NET-a, to zahtijeva da dodatno istražimo.

Stoga je u našoj studiji istražen mehanizam djelovanja morina na AFB{0}}induciranu ozljedu jetre i bubrega kod pilića te su istraženi njegovi zaštitni učinci. Očekuje se da će osigurati eksperimentalne temelje za veterinarsku kliničku primjenu morina i osigurati eksperimentalne podatke i reference za prevenciju i kontrolu trovanja mikotoksinima.

MATERIJALI I METODE Reagensi i materijali

AFB1 (A6636, čistoća veća ili jednaka 98 posto, Sigma-Aldrich [Shang-hail Trading Co., Ltd., Šangaj, Kina). Morin (čistoća veća ili jednaka 98 posto) kupljen je od Chengdu Pusi Biological Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Pico Green dsDNA test kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Komplet AST, ALT, BUN i CRE nabavljen je od Instituta za biološko inženjerstvo Nanjing Jiancheng (Nanjing, Kina). Komplet GSH-Px SOD, CAT i MDA nabavljen je od Instituta za biološko inženjerstvo Nanjing Jiancheng (Nanjing, Kina). RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit je dobiven od Thermo. QPCR master mix je dobiven od Roche (Mannheim, Njemačka).

Uspostavljanje životinjskih modela

Dvadeset i pet jednodnevnih pilića kupljeno je s farme za uzgoj Foshan (Foshan, Guangdong), a pilići su hranjeni adaptivno jedan dan. Uspostavljanje modela zaražene piletine započelo je drugog dana. Testni pilići nasumično su raspoređeni u 5 skupina: kontrolna skupina, AFB1 skupina (5 mg/kg), skupina za liječenje morinom (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg). Prvog dana modeliranja, tretman skupini je intraperitonealno ubrizgan morin za prevenciju i ponovno je ubrizgan 16 sati kasnije. Krv je sakupljena 24 sata kasnije, pilići su ubijeni i uzeta su tkiva jetre i bubrega. Sva provedba eksperimenta provedena je u skladu sa smjernicama Etičkog odbora za istraživanje životinja Sveučilišta Foshan (FSUeae2019112501).

Detekcija HET u serumu

Sakupljena krv je bila nepomična, centrifugirana na 12,000 okretaja u minuti 10 minuta, a gornji serum je ekstrahiran, 5-razrijeđen TE bojom, a zatim je dodana ista količina Pico Greena. Na kraju, eksperimentalni rezultati promatrani su fluorescentnim čitačem mikropločica.

Detekcija ALT i AST u serumu

Mjerenje razina ALT i AST u serumu s priborom i eksperimentalni rezultati detektirani su na valnoj duljini od 510 nm pomoću čitača mikropločica.

Detekcija BUN i CRE u serumu

Razine CRE i BUN u serumu ispitane su odgovarajućim priborom, a eksperimentalni rezultati detektirani su čitačem mikropločica na valnoj duljini od 510 nm.

Histopatološka procjena jetrenog i bubrežnog tkiva

Sakupljeni uzorci tkiva jetre i bubrega fiksirani su u 10 postotnom formalinu. Zatim je tkivo dehidrirano, ugrađeno i obojeno hematoksilinom i eozinom (Wet al, 2021). Naposljetku, za promatranje patoloških promjena korišten je revolveov hibridni mikroskop.

Detekcija aktivnosti oksidaze i aktivnosti antioksidativnog enzima

Razine oksidaze MDA i antioksidativne oksidaze GSH-Px, SOD i CAT otkrivene su ispitane odgovarajućim kompletima (Guo et al, 2021). Između ostalog, SOD i CAT su izmjereni serumom, a MDA i GSH-Px izmjereni su tkivom jetre. Osim toga, trebamo koristiti TBD reagense za kvantitativnu analizu koncentracije proteina u uzorcima (Cao et al., 2020).

Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenu

QRT-PCR je korišten za otkrivanje ekspresije mRNAupalničimbenici TNF-a, IL-1, IL-6, posrednik upale COX-2, iNOS i kaspaza signalni put ključni čimbenici kaspaza-1,kaspaza{{6} } i kaspaza-11. Za kvantifikaciju PCR fluorescencije u stvarnom vremenu korišten je instrument CFX Connect Real-Time System. Prajmeri ciljnog gena su u tablici 1. qRT-PCR detekcija usvaja Rocheov sustav od 25 μL, uvjet je bio 50 stupnjeva, 2 min; 95 stupnjeva, 10 min; 95 stupnjeva, 15 s; 60 stupnjeva, 60-ih, ukupno 40 ciklusa. GAPDH je kao interna referenca, a bio je i metoda za obradu podataka, koristio 2-AACT (Qianru et al., 2021.).

Statistička analiza

Svi podaci izračunati su pomoću softvera GraphPad Prism 5.0 korištenjem jednosmjerne analize varijance (ANOVA) s Tukey testom višestruke usporedbe. Razlike među skupinama smatrane su statistički značajnima na razinama P<>

REZULTATI

Promjena tjelesne mase i jetrenog koeficijenta u pilića

Zabilježena je tjelesna težina svakog pilića i izračunat jetreni koeficijent (jetreni koeficijent =težina jetre/tjelesna težina] × 100). Rezultati su pokazali da je stopa rasta tjelesne težine u skupini liječenoj morinom (20 mg/kg, 80 mg/kg) značajno povećana u usporedbi sa skupinom AFB1 (Slika 2A), potvrđujući da morin ima određeni učinak na težinu pilići. Međutim, jetreni koeficijent svake skupine pilića nije se značajno promijenio (Slika 2B).

Morin značajno smanjuje razine ALT i AST u serumu

ALT i AST su pokazatelji oštećenja jetre. Podaci su pokazali da AFB1 značajno povećava razine ALT i AST, dok je morin pokazao potpuno suprotan trend u usporedbi s AFB1 (Slika 3A i B), što preliminarno sugerira da morin ima povoljan učinak na AFB{3}}induciranu ozljedu jetre kod pilića .

Morin značajno ublažava AFB1-izazvano oštećenje jetre kod pilića

Kako bi se dodatno potvrdili učinci morina na ozljedu jetre1-izazvanu AFB-om, provedeno je histopatološko ispitivanje. Kao što je prikazano na slici 4, liječenje AFB1 izazvalo je oticanje hepatocita, fragmentaciju i upalnu staničnu infiltraciju u jetri, ali morin (20, 40, 80 mg/kg) učinkovito je ublažio oštećenje jetrenog tkiva, što je dodatno potvrdilo da morin ima ublažavajući učinak na oštećenje jetre izazvano AFB1-u pilića.

Morin značajno smanjuje razine BUN i CRE u serumu

BUN i CRE kao važni pokazatelji oštećenja bubrega, otkrili smo da je AFB1 značajno povećao razine BUN i CRE u usporedbi s kontrolnom skupinom, dok je morin pokazao potpuno suprotan trend u usporedbi s AFB1 (Slika 5A i B), što također preliminarno sugerira da morin ima povoljan učinak na AFB1-izazvanu ozljedu bubrega kod pilića.

Morin značajno ublažava AFB1-izazvanu ozljedu bubrega kod pilića

Kako bi se dodatno potvrdili učinci morina na AFB1-izazvanu ozljedu bubrega, provedeno je histopatološko ispitivanje. Bubrezi liječene AFB1 skupinom pokazali su nekrozu bubrežnih stanica, eksfolijaciju i vakuolizaciju, dok je skupina liječena morinom, s povećanjem koncentracije morina (20,40,80 mg/kg), učinkovito ublažila oštećenje bubrežnog tkiva (Slika 6. ), što je dodatno potvrdilo da morin ima ublažavajući učinak na AFB1-izazvanu ozljedu bubrega kod pilića.

MorinZnačajno smanjena razina HET-a izazvanih AFB1-u serumu

Kako bi se istražio mehanizam koji je u osnovi zaštite morina od AFB1-inducirane ozljede tkiva, Pico Green je otkrio HET-ove otpuštene u serumu. Prikupljeni su uzorci krvi kako bi se otkrila razina HET-aserum. Eksperimentalni rezultat pokazao je da je AFB1 značajno inducirao stvaranje HET-a u serumu, dok je morin značajno inhibirao stvaranje HET-a u usporedbi sa skupinom AFB1 (Slika 7). Stoga smo prvo potvrdili da je morin ublažio AFB1-koji je uzrokovao oštećenje jetre i bubrega inhibiranjem otpuštanja HET-a.

Morin značajno ublažava oksidativni stres1-izazvan AFB kod pilića

Zabilježeno je da je oksidativni stres ključni mehanizam u toksičnim učincima AFB1, otkrivena je funkcija morina na oksidativni stres uzrokovan AFB1-. Rezultat je pokazao da je AFB1 značajno povećao razinuoksidaze MDA, dok značajno smanjuje razine antioksidativnog enzima GSH-Px, SOD i CAT. Međutim, u usporedbi s AFB1, morin je učinkovito ublažio neravnotežu između enzima oksidaze i antioksidansa (Slika 8).

Kako bi se istražio mehanizam koji je u osnovi zaštite morina od AFB1-inducirane ozljede tkiva, Pico Green je otkrio HET-ove otpuštene u serumu. Prikupljeni su uzorci krvi kako bi se otkrila razina HET-a

Morin je značajno inhibirao razine mRNA upalnih medijatora i čimbenika upale izazvanih AFB1-u jetri

Theupalniodgovor je važan mehanizam u toksičnim učincima AFB1; ispitan je učinak morina na upalne reakcije uzrokovane AFB1-. qRT-PCR analiza korištena je za otkrivanje ekspresije upalnih medijatora COX-2 i iNOS, te upalnih čimbenika TNF-. IL-1 . IL-6. Eksperimentalni rezultati pokazali su da je AFB1 značajno poboljšao razinu ekspresije ovih citokina, dok je morin značajno inhibirao ekspresiju ovih citokina (Slika 9).

Morin je značajno inhibirao AFB1-Izazvao ekspresiju mRNA kaspaze-1, kaspaze-3 i kaspaze-11

Zabilježeno je da je signalni put kaspaze također uključen u proces oksidativnog stresa i upalnih odgovora. ROS može izazvati oštećenje mitohondrijske membrane, što dovodi do istjecanja citokroma c i aktiviranja signalnog puta kaspaze. Stoga smo otkrili ekspresiju mRNA ključnih čimbenika signalnog puta kaspaze. Rezultat je potvrdio da je AFB1 značajno povećao ekspresiju mRNA kaspaze-1, kaspaze-3 i kaspaze-11, dok je morin značajno smanjio ekspresiju ovih faktora (Slika 10).

RASPRAVA

AFB1 je najotrovniji mikotoksin koji je glavni uzročnik aspergiloze. Bilo je mnogo studija o toksičnosti AFB1, uključujući hepatotoksičnost, neurotoksičnost i kancerogenost. Jetra, kao glavni organ detoksikacije i glavno mjesto transformacije metabolizma tvari u životinja, izuzetno je osjetljiva na oštećenje AFB1, koje uglavnom posreduju 4 mehanizma: enzimski sustav citokroma P450 (CYP450), mitohondriji, imunološki sustav i slobodni radikali . Nakon što AFB1 uđe u tijelo, apsorbira se iz duodenuma probavnog trakta i ulazi u jetru kroz portalnu venu, gdje se transformira u AFBO pomoću CYP1A2 i CYP3A4 u fazi I metabolizma enzima CYP450 enzimskog sustava u hepatocitima (Yang et al. ..2013). Gornji proces je najznačajniji razlog zašto AFB1 uzrokuje tjelesne poremećaje i proizvodi toksičnost i kancerogene učinke. AFB1 također može inducirati apoptozu hepatocita pojačanom regulacijom ekspresije receptora smrti F AS i TNFR1 i nižom regulacijom ekspresije antiapoptotskih receptora XIAP i Bcl-2(Mughal et al., 2017). U prethodnim eksperimentima , potvrdili smo da AFB1 može uzrokovati oštećenje jetre i bubrega kod pilića i preliminarno razjasnili mehanizam.

Morin je vrsta prirodnog flavonoida, koji ima prirodnu antioksidacijsku strukturu. Kinon nastao njegovom oksidacijom ima snažno antioksidativno djelovanje, koje može zaštititi nezasićene masne kiseline na staničnoj membrani od oksidacije (Xie et al, 2003). Studije su potvrdile da morin može imati određenu zaštitnu ulogu kod oštećenja jetre kod miševa izazvanih IFOS-om inhibicijom oksidativnog stresa. upala kao i stanična apoptoza (Ozdemir et al2020). Morin također može ublažiti mastitis uzrokovan LPS-om inhibicijom PI3K/AKT, MAPK, NF-kB. i NLRP3 signalni putovi (Jiang et al..2020). Međutim, povezani zaštitni učinci morina na štetu uzrokovanu AFB1-i dalje su nepoznati. Stoga je ovaj eksperiment uglavnom istraživao zaštitne učinke morina na AFB1-izazvana oštećenja jetre i bubrega i razjasnio njegov mehanizam.

Na temelju točnije procjene doziranja i učinaka morina odabrana je intraperitonealna injekcija. Štoviše, metoda primjene morina bila je u skladu s onom kod miševa i štakora (Jiang et al., 2020;

Khamchai et al, 2020). Prvo su ispitane razine AST, ALT, BUN i CRE u serumu kako bi se potvrdilo da je model toksičnosti AFB1 uspješno uspostavljen. Indeksi oštećenja jetre i bubrega skupine AFB1 značajno su povećani, dok su skupine morina izrazito inhibirale ekspresiju ovih enzima, što je preliminarno potvrdilo ulogu morina u zaštiti od oštećenja jetre i bubrega uzrokovanih AFB1-u pilića. U isto vrijeme, otkrili smo da iako nije bilo značajne razlike u indeksu jetre između skupina, stopa rasta težine je značajno poboljšana u skupini koja je primala morin (20 mg/kg, 80 mg/kg), potvrđujući učinak morin na težinu pilića. Nadalje, histopatološki pregled potvrdio je da morin učinkovito ublažava AFB1-koji uzrokuje poremećaj hepatocita, oticanje, upalnu infiltraciju stanica i nekrozu bubrežnih stanica, ljuštenje i vakuolizaciju, što dodatno potvrđuje zaštitne učinke morina na oštećenje jetre i bubrega u pilića . Zatim smo istražili zaštitni mehanizam morina protiv AFB1-izazvanog oštećenja jetre i bubrega kod pilića.

NET, kao prva linija obrane urođenog imuniteta, dvosjekli je mač za organizam. S jedne strane, igra važnu ulogu u obrani organizma od patogena. S druge strane, uzrokovat će oštećenje tkiva i sudjelovati u nastanku nekih bolesti, poput ateroskleroze i tromboze (Moschonas i Tselepis, 2019.). Studija je potvrdila da NET i histoni igraju važnu ulogu u ozljedi epitelnih stanica goveđe dojke (BMEC), a inhibicija stvaranja prekomjernih NET može ublažiti ozljede povezane s mastitisom (Wei et al. 2019a). Također smo otkrili da bi AFB1 mogao uzrokovati oštećenje jetre i bubrega kod pilića induciranjem otpuštanja HET-a. Je li zaštitni učinak morina na AFB1 uzrokovan ozljedama kod pilića povezan s HET-ima također je važan cilj našeg eksperimenta. HET djeluju kao vitalni urođeni imunološki odgovori pilića, a najbolje vrijeme za otkrivanje HET u serumu je unutar 24 sata, stoga je odabrano vrijeme istraživanja. Utvrđeno je da je morin značajno smanjio stvaranje HET-a u serumu, a prvi put je potvrđeno da je morin ublažio AFB1-izazvane ozljede kod pilića inhibicijom oslobađanja HET-a.

U normalnom metaboličkom procesu tijela, redoks je u dinamičkoj ravnoteži, ali kada proizvodnja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) u tijelu premaši količine antioksidansa, doći će do oksidativnog stresa. Oksidativni stres je uključen u mnoge bolesti jetre, kao što je fibroproliferativna bolest jetre, alkoholna bolest jetre i nealkoholna masna bolest jetre (Cichoz-Lach i Michalak, 2014.). MDA je konačni produkt lipidne peroksidacije koju proizvodi ROS, a može neovisno odražavati stupanj oštećenja membranskog sustava i stupanj napada slobodnih radikala na stanice, pa se smatra dobrim markerom za procjenu oksidativnog stresa (Wang et al. , 2019). SOD je specifičan antioksidativni enzim koji čisti superoksidni anion u ROS slobodnim radikalima, koji neizravno gledaju na sposobnost tijela da ukloni radikale bez kisika, i ima izuzetno ključnu funkciju u proučavanju oštećenja jetre (Zhang et al..2018) . GSH-Px je važan pokazatelj za mjerenje redoks stanja stanica, koji se može suprotstaviti toksičnosti kisikovih radikala izravnim opskrbljivanjem H plus i smanjenjem

oksidativno oštećenje jetre. CAT, postoje u različitim tkivima životinja, posebno u jetri u visokim koncentracijama, koje mogu učinkovito razgraditi vodikov peroksid u ugljični dioksid i vodu kako bi zaštitile stanice od oksidativnog oštećenja (Alfonso-Prieto et al., 2009). Rezultat je pokazao da je AFB1 značajno smanjio razinu antioksidativnih enzima GSH-Px, SOD i CAT, također povećao razinu antioksidativnih enzima MDA, dok je morinska skupina pokazala suprotan trend, učinkovito ublažavajući neravnotežu između oksidaze i antioksidativnih enzima, što ukazuje na da morin može učinkovito inhibirati oksidativni stres uzrokovan AFB1-.

Zabilježeno je da ROS može uzrokovati ekspresiju upalnih citokina i aktivaciju nuklearnog faktora kappa B (NF-xB) i puteva protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) (Li et al. 2014). NF-xB protein obično tvori homo/heterodimere iz p65 i p50 i nalazi se u neaktivnom stanju u citoplazmi zbog stvaranja trimer kompleksa s inhibicijskim proteinom IkB (Pantano et al., 2006). Nakon što ga je stimulirao patogen, IkB se odvaja od trimera, a dimer NF-kB izlaže nuklearnim lokalizacijskim sekvencama (NLS), koje brzo ulaze u jezgru iz citoplazme i vežu se na specifične sekvence na jezgrinoj DNA, potičući transkripcija srodnih gena (Zhang i Ghosh, 2001). TNF- je najvažniji proupalni citokin uključen u aktivaciju NF-B, inducirajući ekspresiju IL-18, IL-6, COX -2, iNOS i drugi nizvodni upalni medijatori (Rajendran et al 2018). Naši su rezultati pokazali da AFB1 značajno potiče ekspresiju mRNA upalnih čimbenika TNF-, IL-1, IL-6 i upalnih medijatora COX-2 i iNOS, ali morinska skupina značajno inhibira ekspresiju ovih čimbenika, što ukazuje da morin može učinkovito inhibirati upalni odgovor izazvan AFB1-u pilića.

Studije su pokazale da je oksidativni stres jedan od čimbenika koji inducira apoptozu (Chandra et al., 2000), a mnoge tvari koje induciraju apoptozu općenito su oksidansi ili stimulansi u staničnom oksidativnom metabolizmu. Aktivacija NF-kB može potaknuti transkripciju gena proapoptotskog faktora ili inhibirati ekspresiju anti-apoptotskih proteina. U međuvremenu, signalni put kaspaze i upalni odgovor su u tandemu. Kaspaza-1 igra važnu ulogu u lučenju Il-1, a kaspaza-11 je homologija ljudske upalne kaspaze-4 i kaspaze-4 kaspaze{{9} članova obitelji }} (Van Opdenbosch i Lamkanfi, 2019.). Potvrdili smo da AFB1 značajno pojačava ekspresiju kaspaze-1, kaspaze-3 i kaspaze-11, dok je morin značajno smanjio ekspresiju ovih faktora, potvrđujući da morin može učinkovito inhibirati aktivaciju AFB1-inducirani signalni put kaspaze u pilića.

Na temelju gornjih rezultata, potvrdili smo da morin može učinkovito ublažiti oštećenje jetre i bubrega uzrokovano AFB1-u pilića, što može pružiti eksperimentalnu osnovu i teoretsku referencu za praktičnu primjenu morina. U idućim istraživanjima treba odabrati način hranidbe morinom, kao što je voda za piće, a potrebno je više pilića i starijih pilića kako bi se potvrdio učinak morina u peradarstvu.

ZAKLJUČAK

Morin, kao prirodni spoj koji se obično nalazi u kineskim biljnim lijekovima i dodacima prehrani, u potpunosti je istražen i potvrđena njegova sigurnost te je dobio zadovoljavajuće rezultate. Naši eksperimenti nadalje su pokazali da morin može učinkovito ublažiti oštećenje jetre i bubrega uzrokovano AFB1-inhibicijom otpuštanja HET-a, oksidativnog stresa, upalnog odgovora. Stoga ova studija pokazuje da morin ima potencijal kao dodatak stočnoj hrani za zaštitu jetre i bubrega peradi, sprječavanje štetnih tvari u stočnoj hrani i poboljšanje performansi peradi.