Monoterpenski sastojci iz Cistanche Tubulosa—Kemijske strukture kankanozida A—E i Kankanola—

Cistanche (SCHRENK) R. WNOĆNO(Orobanchaceae) je višegodišnja parazitska biljka koja raste na korijenuSalvadorailiKalotropisvrsta i rasprostranjena u sjevernoj Africi, Arabiji i azijskim zemljama.1) Stabljike ove biljke (Kanka-nikujuyou na japanskom) tradicionalno se koriste za liječenje impotencije, steriliteta, lumbaga i tjelesne slabosti.2) Prethodno je nekoliko iridoida, monoterpenoida,feniletanoidi, a lignani su izolirani iz Kine i PakistanaC. tubulosa. 1,3–7) Tijekom naših serijskih studija bioaktivnih sastojaka iz kineskih prirodnih lijekova,8–18) četiri nova iridoidna glikozida, kankanozidi A (1), B (2), C (3), i D (4), klorirani iridoid, kankanol (5), i aciklički monoterpenski glikozid, kankanozid E (6), izolirani su iz metanolnog ekstrakta ovog biljnog lijeka zajedno sa 16 poznatih spojeva uključujući 12 monoterpena (7-18). Ovaj se rad bavi izolacijom i razjašnjenjem strukture novih monoterpenskih sastojaka (1-6).

TCM Cistanche tubulosa

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metanolni ekstrakt iz osušenih stabljika C. tubulosa (26,8% iz ovog biljnog lijeka) podvrgnut je kromatografiji na stupcu silikagela normalne faze i reverzne faze i ponovljenoj HPLC da se dobiju kankanozidi A (1, 0.{{7} }{{10}}54%), B (2, 0.030%), C (3, 0.{ {32}}027%), i D (4, {{40}}.0015%), kankanol (5, {{57 }}.0034%) i kankanozid E (6, 0.027%) zajedno s musaenozidnom kiselinom19) (7, 0 .020%), genipozidna kiselina19) (8, 0,030%), 8-epiloganska kiselina7) (9, 0,033%), glurozid19) (10, 0,14%), antirhid20) (11, 0,0079 %), ajugol19) (12, 0,011%), barciozid19) (13, 0,21%), 6-deoksikatalpol19) (14, 0,11%), argiol21) (15, 0,0030%), cistanin22,23) (16 , 0,0040%), cistaklorin22) (17, 0,0035%), (2E,6Z)-8-bD-glukopiranosiloksi-2,6-dimetil-2,6- oktadienska kiselina24) (18, 0,0028%), Dmanitol25) (4,19%), uridin25) (0,0069%), (3R)-3-hidroksi-2- pirolidinon26,27) (0,0020%) i (3R )-3-hidroksi-1-metil- 2-pirolidinon27) (0,0059%).

Struktura Kankanosida A (1)

Kankanozid A (1) dobiven je kao amorfni prah i pokazao je negativnu optičku rotaciju ([a]D 25 - 107.4 stupnja u MeOH). IR spektar 1 pokazao je apsorpcijsku vrpcu na 1647 cm- 1 koja se može pripisati olefinskoj funkciji uz jake apsorpcijske vrpce na 3410 i 1076 cm- 1 što ukazuje na glikozidnu skupinu. U bombardiranju pozitivnim i negativnim ionima brzim atomima (FAB)-MS od 1, vršne vrijednosti kvazimolekularnih iona opažene su pri m/z 369

(M Na) i 345 (M-H)-, a FAB-MS analiza visoke razlučivosti otkrila je da je molekularna formula 1 C16H26O8. Kisela hidroliza 1 s 1.0 M klorovodične kiseline (HCl) oslobodila je D-glukozu, koja je identificirana HPLC analizom pomoću detektora optičke rotacije.8,10-12,15-18) 1H-(CD3OD, tablica 1) i 13C-NMR (tablica 2) spektri 1, koji su pripisani različitim NMR eksperimentima,28) pokazali su signale koji se mogu pripisati dvama metilima [d 1,31 (s, 10-H3) , 1,51 (br s, 11-H3)], dva metilena [d 1,49, 2,02 (oba m, 6a- i 6b-H), 1,64, 1,67 (oba m, 7b- i 7a-H)], dva metina [d 2,21 (dd, J= 2.7, 9,5 Hz, 9-H), 2,71 (m, 5-H)], i a,b-nezasićena acetalna skupina [d 5,33 (d, J= 2,7 Hz, 1-H), 5,95 (br s, 3-H)] zajedno s b-glukopiranozilnom ostatkom [d 4,62 (d, J= 7.9 Hz, 1' -H)]. Kao što je prikazano na slici 1, eksperiment 1 H–1 H korelacijske spektroskopije (1 H–1 H COSY) na 1 pokazao je prisutnost djelomičnih struktura napisanih podebljanim crtama. U eksperimentu heteronuklearne korelacije višestrukih veza (HMBC) na 1, uočene su korelacije dugog dometa između sljedećih protona i ugljika (3-H, 1' -H i 1-C; {{88} }H3 i 3-C 3-H, 5-H, 6-H2, 9-H, 11-H3 i 4- C; 11-H3 i 5-C; 10-H3 i 1-H, 7-H , 10-H3 i 8-C; 10-H3 i 9-C; 7-H2 i 10-C) kao što je prikazano na slici 1. Enzimska hidroliza 1 s b-glukozidazom dala je aglikon, kankagenin a (1a) kao što je prikazano na slici 3. Usporedba 13CNMR spektra za 1 s onima za 1a otkrila je pomak glikozilacije oko 1-položaja u 1 [ 1: d C 94,1 (1-C), 134,6 (3-C), 53,3 (9-C); la: d C 92,9 (1-C), 135,3 (3-C), 54,7 (9-C)]. Stoga je također pojašnjeno da je povezanost bD-glukopiranozilnog dijela u 1 na 1-položaju 1a. Zatim je relativna stereostruktura 1 karakterizirana pokusom nuklearne Overhauserove pojačane spektroskopije (NOESY), koji je pokazao NOE korelacije između sljedećih

niži parovi protona ({{0}}H i 10-H3; 3-H i 11-H3; 5-H i 6b-H, {{9 }}H; 6b-H i 10-H3; 9-H) kao što je prikazano na slici 2. 22}}položaj u 1 određen je primjenom 13CNMR pravila pomaka glikozilacije 1,1'-disaharida,29) za koje je utvrđeno da se primjenjuje na poluacetalne spojeve.30,31) Stereostruktura 1-položaja u 1 potvrđeno je da se održava u 1a usporedbom 1H-NMR analize uključujući NOESY eksperiment. Utvrđeno je da su vrijednosti pomaka glikozilacije [Dd 1,2 ppm (1' -C) i 0,9 ppm (1- C), u piridinu-d5] karakteristične za kombinaciju R, Rdihemiacetala, što odgovara apsolutnoj stereostrukturi 1 kao što je prikazano na slici 3. Posljedično, utvrđeno je da je apsolutna konfiguracija na 1-položaju 1 S konfiguracija i apsolutna stereostruktura 1 razjašnjena je kao što je prikazano.

Natural cistanche tubulosa

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA KINESKI TRADICIONALNI LIJEKOVI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Strukture kankanozida B (2) i C (3)

Kankanozid B (2) također je izoliran kao amorfni prah s negativnom optičkom rotacijom ([a]D 26 - 118.7 stupnjeva u MeOH). IR spektar 2 pokazao je apsorpcijske trake na 3410, 1647 i 1085 cm- 1 koje se mogu pripisati hidroksilnim, olefinskim i eterskim funkcijama. Molekularna formula C15H24O10 od 2 određena je kvazimolekularnim ionskim vrhovima u FABMS s pozitivnim ionima i FAB-MS visoke rezolucije. Kisela hidroliza 2 s 1.0 M HCl oslobodila je D-glukozu, koja je identificirana HPLC analizom pomoću detektora optičke rotacije.8,10-12,15-18) 1H- ( CD3OD, Tablica 1) i 13C-NMR (Tablica 2) spektri28) od 2 pokazali su signale koji se mogu pripisati dvama metilenima [d 1,40 (ddd, J= 5.2, 7,3, 13,5 Hz, 6a-H), 2,52 ( ddd, J= 7.0, 9.2, 13.5 Hz, 6b-H), 3.85, 3.99 (oba d, J= 11.9 Hz, 10-H2)], četiri metina [ d 2,21 (dd, J= 6,4, 8,6 Hz, 9-H), 2,83 (m, 5-H), 4,02 (dd, J= 5,2, 7,0 Hz, 7-H), 5,49 (d, J= 6.4 Hz, 1-H)], i cis-olefinski par [d 4,95 (dd, J{{84) }}.0, 6,1 Hz, 4-H), 6,22 (dd, J= 1.8, 6,1 Hz, 3-H)], zajedno s b-glukopiranozilnim dijelom [d 4,72 (d, J= 7.9 Hz, l'-H)]. Signali protona i ugljika u 1H- i 13C-NMR podacima 2 bili su slični onima za 6-deoksikatalpol (14), osim signala uzrokovanih 7- i 8- pozicije. Kao što je prikazano na slici 1, eksperiment 1 H–1 H COSY na 2 ukazao je na prisutnost parcijalnih struktura napisanih podebljanim crtama, a u eksperimentu HMBC uočene su korelacije dugog dometa između sljedećih parova protona i ugljika ({ {117}}-H i 1-H i 10-H2 i {{126}; }H, 7-H, 9-H, 10-H2 i 8-C 7-H, 10-H2 i 9- C; 7-H i 10-C). Relativna stereostruktura 2 karakterizirana je NOESY eksperimentom, koji je pokazao NOE korelacije između sljedećih parova protona (1-H i 10-H2; 3- H i 4-H; { {144}}H i 6b-H, 9-H; 7-H; 7-H i 9-H) kao što je prikazano na slici 2. Na kraju , alkalna obrada 14 s 5% vodenom otopinom kalijevog hidroksida (KOH) dala je 2 i 19, 32) tako da je stereostruktura 2 razjašnjena.

KankanosidC (3) izoliran je kao amorfni prah s negativnom optičkom rotacijom ([a]D 26 - 34.0 stupanj u MeOH). U FAB-MS s negativnim ionima od 3, par pikova izotopa kvazimolekularnih iona opažen je pri m/z 399 i 401 (M-H)-. FAB-MS mjerenjem visoke rezolucije utvrđeno je da je molekularna formula 3 C15H25ClO10. Kisela hidroliza 3 s 1,0 M HCl oslobodila je D-glukozu, koja je identificirana HPLC analizom pomoću detektora optičke rotacije.8,10-12,15-18) 1H- (CD3OD, Tablica 1) i 13C-NMR (Tablica 2) spektri28) od 3 pokazali su signale koji se mogu pripisati trima metilenima [d 1,70 (br dd, J= ca. 3, 13 Hz, 4a-H), 2,70 (br dd, J{{ 41}} ca. 6, 13 Hz, 4b-H), 1,68 (br d, J= ca. 13 Hz, 6aH), 2,44 (m, 6b-H), 4,01, 4,04 (oba d, J= 11,3 Hz, 10-H2)], pet metina [d 2,47 (dd, J= 2,5, 7,9 Hz, 9-H), 2,61 (m , 5- H), 3,94 (br s, 7-H), 5,10 (br d, J= oko 3 Hz, 3-H), 5,48 (d, J= 2.5 Hz, 1-H)], i b-glukopiranozilni dio [d 4.60 (d, J= 8.0 Hz, 1'-H)]. Signali protona i ugljika u 1H- i 13C-NMR spektrima 3 mogli su se preklopiti s onima od 2, osim signala zbog položaja 3- i 4-. Položaj bD-glukopiranozila i klorne funkcije u 3 razjašnjen je iz H–H COSY i HMBC eksperimenata kao što je prikazano na slici 1. Posljedično, planarna struktura 3 konstruirana je da bude kao što je prikazano. Relativna stereostruktura 3 određena je NOESY eksperimentom, u kojem su uočene NOE korelacije između sljedećih parova protona (1-H i 3-H, 10-H2; 3- H i 4b-H i 5-H i 7-H; }H i 9-H) kao što je prikazano na slici 2.

Cistanche tubulosa extract

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Strukture Kankanosida D (4) i Kankanola (5)

Kankanozid D (4) izoliran je kao amorfni prah s negativnom optičkom rotacijom ([a]D 25 - 30.6 stupnjeva u MeOH). IR spektar 4 pokazao je apsorpcijsku vrpcu na 1655 cm- 1 koja se može pripisati olefinskoj funkciji i jake apsorpcijske vrpce na 3410 i 1078 cm- 1 što ukazuje na njegovu glikozidnu struktura. U FAB-MS s pozitivnim ionima od 4, kvazimolekularni ionski vrh opažen je pri m/z 341 (M Na). Molekularna formula C15H26O7 od 4 određena je FAB-MS mjerenjem visoke rezolucije. Kiselom hidrolizom 4 s 1,0 M HCl oslobođena je D-glukoza,8,10-12,15-18), dok je (R)-rotundiol (4a) 33,34) dobiven enzimatskom hidrolizom 4 s b- glukozidaza. 1H-NMR (tablica 3, CD3OD) i 13C-NMR (tablica 4) spektri28) od 4 pokazali su signale koji se mogu pripisati metilu [d 1,69 (s, 10-H3)], tri metilena [d 1,41, 2,06 (oba m, 4-H2), 1,51, 2,01 (oba m, 6a- i 6b-H), 2,23 (br dd, J= oko 8, 15 Hz, 7a-H) , 2,37 (br dd, J= ca. 8, 15 Hz, 7b-H)], metin [d 2,90 (m, 5-H)] i dva metilena s kisikovom funkcionalnom skupinom { d [3,56 (ddd, J= 2.8, 7.4, 13.2 Hz), 3.97 (ddd, J= 4.9, 8.0, 13.2 Hz), 3-H2], 4.04, 4,18 (oba d, J= 12.2 Hz, 1-H2)} zajedno s b-glukopiranozilnim dijelom [d 4.25 (d, J= 7.7 Hz, 1' -H )]. Položaj bD-glukopiranozilnog dijela u 4 razjašnjen je pomoću HMBC eksperimenta kao 3-položaj (slika 1). Na temelju ovog dokaza utvrđeno je da je apsolutna stereostruktura 4 prikazana.

Kankanol (5) je dobiven kao amorfni prah s pozitivnom optičkom rotacijom ([a]D 25 11.1 stupanj). Kemijska ionizacija (CI)-MS od 5 pokazala je par pikova izotopa iona na m/z 221 i 223 zbog kvazimolekularnog iona (MH). CI-MS mjerenje visoke rezolucije od 5 otkrilo je da je molekularna formula C9H13ClO4. 1H-NMR (tablica 1, CD3OD) i 13C-NMR (tablica 2) spektri28) od 5 pokazali su prisutnost sljedećih funkcija: tri metilena [d 1,60 (ddd, J= 2 .5, 5,5, 13,1 Hz, 4a-H), 1,80 (br dd, J= oko 3, 13 Hz, 4bH), 1,83 (br d, J= oko 12 Hz, 6a-H), 2,57 (m, 6b-H), 3,75, 3,88 (oba d, J= 9.2 Hz, 10-H2)], pet metina [d 2,76 (dd, J{ {58}}.3, 8,0 Hz, 9-H), 2,50 (m, 5-H), 3,80 (br s, 7-H), 5,17 (br d, J{ {71}} oko 3 Hz, 3-H), 5,26 (d, J= 4.3 Hz, 1-H)]. Planarna struktura 5 potvrđena je 1 H–1 H COSY i HMBC eksperimentima. Odnosno, eksperiment 1 H–1 H COSY na 5 ukazao je na prisutnost parcijalnih struktura napisanih podebljanim crtama, a u eksperimentu HMBC uočene su korelacije dugog dometa kao što je prikazano na slici 1. Relativna stereostruktura 5 bila je utvrđeno eksperimentom NOESY, u kojem su uočene NOE korelacije između sljedećih parova protona (1-H i 9-H; 3-H i 4a-H; 4b-H i {{95 }} H; 5-H i 9-H; 7-H i 9-H) kao što je prikazano u Slika 2. Usporedbom 1H- i 13C-NMR podataka za 5 s onima za 14a, koji je dobiven obradom 14 s 5% vodenom otopinom HCl kao što je prikazano na Grafikonu 1,35) položaj skupine klora u 5 je podržano kao 3-položaj. Nadalje, acetilacija 5 s anhidridom octene kiseline (Ac2O) i piridinom dala je 3,7-oksid (5a), dok je 14a dala diacetat (14b) pod istim uvjetima acetilacije. Ovi dokazi također su nas naveli da potvrdimo da je funkcija klora 3b-položaj (Grafikon 3). Posljedično, utvrđeno je da je stereostruktura 5 kao što je prikazano.

Struktura kankanozida E (6) Kankanozid E (6) izoliran je kao amorfni prah s negativnom optičkom rotacijom ([a]D 25 - 20.0 stupanj u MeOH). IR spektar 6 pokazao je apsorpcijske trake na 3410, 1647 i 1085 cm- 1 koje se mogu pripisati glikozidnim i karbonilnim funkcijama, dok je njegov UV spektar pokazao maksimum apsorpcije na 211 nm (log e 4,63), što ukazuje da prisutnost a,b-nezasićene karboksilne kiseline. Molekulska formula C16H28O8 od 6 karakterizirana je FAB-MS pozitivnim i negativnim ionima i MS mjerenjem visoke rezolucije. Kisela hidroliza 6 oslobađa D-glukozu,8,10-12,15-18) dok (2E,6R)-8-hidroksi-2,6-dimetil{{31 }}oktanska kiselina (6a) 36) dobivena je enzimatskom hidrolizom 6 s b-glukozidazom. 1H-NMR (tablica 3, CD3OD) i 13C-NMR (tablica 4) spektri28) od 6 ukazuju na prisutnost (2E,6R)-8-hidroksi-2,6- dio dimetil-2-oktenske kiseline [d 0,95 (d, J= 6.4 Hz, 10-H3), 1,30, 1,48 (oba m, 5-H2), 1,45, 1,70 (oba m, 7-H2), 1,65 (m, 6-H), 1,81 (s, 9-H3), 2,22 (2H, m, 4-H2) , 3,61, 3,94 (oba m, 8-H2), 6,78 (dd, J= 1.2, 7,3 Hz, 3-H)] zajedno s bD-glukopiranozilnim dijelom [d 4,26 (d, J= 7.6 Hz, 1' -H)]. Usporedbom signala ugljika u 13C-NMR spektru 6 s onima od 6a, glikozilacijski pomak uočen je oko 8-položaja 6. Položaj glukozidne veze također je potvrđen HMBC eksperimentima kao što je prikazano u Slika 1. Posljedično, apsolutna stereostruktura 6 je pojašnjena kao (2E,6R)-8-bD-glukopiranoziloksi-2,6-dimetil-2-oktenska kiselina.