Mitohondrijski proteini otkrivaju mehanizam kojim tjelesno vježbanje poboljšava pamćenje, učenje i motoričku aktivnost kod hipoksične ishemijske encefalopatije Model štakora 3. dio

4. Materijali i metode

4.1. Životinje i pokusne skupine

Za ovu studiju korišteno je trideset šest Sprague-Dawley štakora. Životinje su držane na 22 ± 1 °C s ciklusima svjetlo/tama od 12 sati i imale su slobodan pristup hrani i vodi. Eksperimentalni postupci su provedeni uz odobrenje Etičkog institucionalnog odbora za brigu o životinjama i istraživanje Sveučilišta Zhengzhou.

Tamni ciklus odnosi se na razdoblje kada ljudi spavaju noću, a usko je povezan s pamćenjem. Za većinu ljudi dobar san poboljšava fizičko zdravlje i rad mozga. U isto vrijeme, spavanje je također povezano s procesom pamćenja mozga.

Kada spavamo, naša tijela ulaze u različite faze sna, uključujući spavanje s brzim pokretima očiju (REM) i spavanje bez brzih pokreta očiju (NREM). Ove faze igraju važnu ulogu u regulaciji moždane integracije informacija i konsolidacije pamćenja.

Većina ljudi osjeća pozitivne učinke sna na koncentraciju i pamćenje. Istraživanja pokazuju da nam san može pomoći da konsolidiramo i ojačamo svoja sjećanja, pa čak i da poboljšamo našu sposobnost učenja. Tijekom sna, mozak integrira nove informacije s postojećim znanjem, čime se poboljšava sposobnost pohranjivanja i korištenja pamćenja.

Nasuprot tome, nedostatak dovoljnog sna može dovesti do gubitka pamćenja i poteškoća u učenju. Dugotrajna nesanica može uzrokovati razne probleme u tijelu i mozgu, što utječe na svakodnevni život i radnu sposobnost. Stoga su ispravna strategija spavanja i razuman način života presudni za očuvanje dobrog pamćenja.

Općenito, postoji veza između tamnih ciklusa i sjećanja. Adekvatan san može pospješiti integraciju informacija u mozak i konsolidaciju pamćenja, dok dugotrajni poremećaji spavanja mogu utjecati na rad mozga i pamćenje. Stoga bismo trebali obratiti pozornost na kvalitetu sna u svakodnevnom životu i održavati zdrav stil života, kako bismo učinkovito podržali i poboljšali svoje pamćenje i sposobnosti učenja. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola također može regulirati ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta. Te su tvari vrlo važne za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche deserticola također može poboljšati protok krvi i pospješiti opskrbu kisikom, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite na 10 načina za poboljšanje pamćenja

Uloženi su svi napori da se smanji broj životinja i minimizira patnja životinja tijekom pokusa. Životinje su nasumično podijeljene u četiri skupine (Slika 8). (1) HIE, NT (skupina hipoksije-ishemijske encefalopatije bez vježbanja) sastojala se od životinja koje su modelirane za hipoksijsko-ishemijsku encefalopatiju 7. dana postnatalnog anestezijom mladunaca izofluranom (5% indukcija, 1,5% održavanje).

Lijeva zajednička karotidna arterija zatim je trajno podvezana, a mladunci su stavljeni na topli ležaj za oporavak 30 minuta prije nego što su prebačeni u hipoksičnu komoru s kontinuiranim protokom smjese hipoksičnog plina od 92% N2 i 8% O2 tijekom 90 minuta, a zatim vraćeni u kaveze do 10. tjedna bez podvrgavanja vježbama plivanja. (2) HIE, T (skupina hipoksijsko-ishemijske encefalopatije s treningom vježbanja) sastojala se od životinja koje su modelirane za hipoksijsko-ishemijsku encefalopatiju kao u (1) i vraćene u kaveze do 6. tjedna života, a zatim podvrgnute 90 minuta plivanje dnevno tijekom pet dana s 2 dana odmora tjedno tijekom 4 tjedna, (3) SHAM, NT (kontrolna skupina) uključivala je životinje koje nisu bile podvrgnute nikakvom tretmanu, ali su živjele normalnim životom u kavezima od 1. postnatalnog dana do 10. tjedna bez trening vježbanja i (4) SHAM, T se sastojao od životinja koje nisu bile podvrgnute nikakvom tretmanu, ali su živjele normalan život u kavezima od postnatalnog dana1 do 6 tjedana, nakon čega su bile podvrgnute vježbama plivanja tijekom 4 tjedna.

Mozgovi životinja iz različitih skupina zatim su prikupljeni i pripremljeni za Western blotting (hipokampus i cerebralni korteks) i imunofluorescenciju (motorni korteks).

4.2. Paradigma vježbe

Životinje su bile smještene s hranom i vodom ad libitum i održavane na ciklusu 12-svjetlo/tama. Podijeljeni su u dvije skupine: sjedilačke životinje (HIE, NT i SHAM, NT) i životinje koje vježbaju (HIE, T i SHAM, T). Životinje koje su vježbale bile su podvrgnute vježbanju plivanja nakon 6. tjedna postnatalnog razdoblja tijekom 4 tjedna; bili su podvrgnuti vježbama plivanja 5 dana u tjednu s 2 dana odmora. Svaka sesija plivanja trajala je 90 min. Bazen je napunjen do dubine od 50 cm kako bi se spriječilo da životinje dodiruju dno spremnika.

Životinje su puštene da slobodno plivaju, bez dodatnog opterećenja, te su tijekom plivanja lagano stimulirane. Štakori su nakon vježbe pažljivo osušeni i vraćeni u kaveze.

4.3. Vertica! Test motociklizma

Životinje u svakoj skupini su jedna po jedna postavljene licem prema gore na stup obložen platnenom trakom (promjera 3.0 cm i duljine 150 cm), koji je držan u vodoravnom položaju, a zatim je postupno podignut na okomitom položaju, a vrijeme boravka štakora na stupu zabilježeno je najviše 2 minute (120 s). U ovom testu, životinja s nedostatkom motoričke koordinacije i ravnoteže pada s motke.

4.4. Morrisov test vodenog labirinta (MWM)

Štakori (stari 10 tjedana) bili su podvrgnuti MWM-u nakon što su prošli 4 tjedna protokola vježbanja (SHAM, 'T i HlE, T). Svi podaci o vodenom labirintu snimljeni su pomoću sustava za video praćenje Panjab SMART (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Šangaj, Kina). MWM je korišten kako je opisano u 132]. Ukratko, štakori su koristili vizualne znakove postavljene na rubove bazena kako bi došli do skrivene platforme i pobjegli iz vode. Učenje je ocjenjivano kroz 7 dana. Prije procjene učenja, štakori su uvedeni u bazen koji je sadržavao čistu vodu i vidljivu platformu. Tijekom treninga, štakori su dobili probne vježbe plivanja kako bi se upoznali sa zadatkom.

Tijekom faze učenja štakori su namazani crnom bojom radi lakšeg video praćenja, a platforma je potopljena. Svaki je štakor bio podvrgnut četirima pokusima s različitih početnih točaka (kvadranata). Latenciju ili vrijeme potrebno za dolazak do platforme svakodnevno je bilježio Panlab SMART Video Tracking System. Posljednjeg dana pokusa platforma je uklonjena i svaki je štakor ponovno uveden u vodu koliko su puta životinje prešle mjesto skrivene platforme u kvadrantu koji je prethodno sadržavao platformu (ciljani kvadrant).

4.5. Western Blotting

Šest štakora nasumično je odabrano iz svake skupine za eksperiment na razini proteina. Proteini su ekstrahirani iz hipokampusa i korteksa i homogenizirani u RIPA-inom reagensu (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, SAD) i razdvojeni u citoplazmatske i nuklearne proteine. Koncentracije proteina određene su pomoću testa bicinhoninske kiseline (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, SAD), a ukupno 20 g proteina odvojeno je elektroforezom na univerzalnim SDS-PAGE gelovima (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Kina.

Proteini su zatim preneseni na membrane od poliviniliden fluorida, (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, SAD). Membrane su blokirane 2 h s 5% goveđeg serumskog albumina (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Peking, Kina) na sobnoj temperaturi i inkubirana sa sljedećim primarnim antitijelima iz Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD): AIF (D39D2, 1:1000), citokrom C (136F3, 1:1000), cijepana kaspaza{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) i OPA1 (D7C1A, 1:1000).

GAPDH tvrtke Servicebio, Wuhan, Kina (GB11002, 1:2000) i H3 tvrtke Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) na 4 ◦C preko noći nakon čega slijedi HRP-konjugirano sekundarno protutijelo SA00001-2 tvrtke Proteintect (1:5000) inkubacija 2 h na sobnoj temperaturi. Proteinske trake su vizualizirane pomoću kompleta za poboljšanu kemiluminiscenciju #KF005 tvrtke Affinity Biosciences i snimljene pomoću sustava za analizu bio-slike (Sveučilište Zhengzhou, Zhengzhou, Kina). Omjeri intenziteta proteinskih traka prema GAPDH (citoplazmatski proteini) i H3 (nuklearni proteini) kao interne reference određeni su korištenjem ImageJ.

4.6. Imunofluorescencija

{{0}}µm koronalni rezovi moždanog tkiva dobiveni su uporabom mikrotoma za zamrzavanje (Leica, Njemačka) za imunofluorescenciju. Stakalca su blokirana 2 sata s PBS-om s 10% fetalnog goveđeg seruma, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Peking, Kina) i 0,3% Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estonija na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirano s primarnim antitijelima iz Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD): anti-AIF, D39D2 (razrjeđenje 1:400), anti-citokrom C, 136F3 (razrjeđenje 1:200), anti-cijepana kaspaza-3 , Asp175 (razrjeđenje 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (razrjeđenje 1:200) i anti-OPA1, D7C1A (razrjeđenje 1:400) preko noći na 4 ◦C.

Zatim su stakalca isprana 3 puta u trajanju od 10 minuta u PBS-u, a zatim inkubirana sa sekundarnim antitijelima (ab150077 iz Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, UK) 2 sata na sobnoj temperaturi u mraku. DAPI, #C0065 iz Solarbio Life Sciences, Peking, Kina (1:100 PBS) dodan je 5 minuta i izliven, ispran u PBS 3 puta u trajanju od 5 minuta, osušen, dodan je agens protiv gašenja (#P0126, Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina), staklo stakalce su fiksirane na stakalce, a uzorci su pohranjeni na -20 ◦C 2 sata i uzeti za mikroskopsko snimanje. Slike tkiva su snimljene konfokalnim fluorescentnim mikroskopom (Ni-U942877, Nikon, Tokio, Japan), a slike koje predstavljaju proteini u motornom korteksu zatim su kvantificirani pomoću FIJI-ImageJ kako je opisano u [33].

4.7. Statistička analiza

GraphPad Prism verzija 8.0.0 za Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD) korištena je za sve analize. Jednosmjerna ANOVA praćena Dunnettovim post hoc testovima korištena je za mjerenje statističke značajnosti. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM, a p < 0.05 smatra se statistički značajnim.

5. Zaključci

Ova studija pokazuje da je vježba plivanja poboljšala motoričku aktivnost, pamćenje i učenje povezano s HIE potiskivanjem mitohondrijske apoptoze putem Cyto.C/cijepane kaspaze-3 i AIF signalnih putova. Osim toga, pokazalo se da intervencija vježbe plivanja stabilizira mitohondrijske kriste i membranski potencijal kao što je prikazano preokretom Smac/Diablo i OPA1 u štakora s HIE. Kao rezultat toga, ovo je privlačan i održiv temelj za dodatna istraživanja za dešifriranje više molekularnih putova kojima bi se moglo manipulirati kako bi se učinkovito upravljalo HIE i rezultirajućim nedostacima. Iako je ova studija uspješno pokazala ulogu tjelovježbe u poništavanju strukturnih i funkcionalnih nedostataka u mitohondrijima uzrokovanim prema HIE, nije iscrpio sve moguće metode za utvrđivanje kako su mitohondrijske kriste stabilizirane; to je kritično za buduća istraživanja ove teme.

Autorski doprinosi: Konceptualizacija, FG, FP, YW i CC; upravljanje podacima, FG, FP, YW, HL i JF; formalna analiza, FG, HL i CC; prikupljanje sredstava, CC; istraga, FG,FP, YW, HL i JF; metodologija, FG, FP, YW i CC; administracija projekta, FG, YW i CC; resursi, CC; softver, FG, FP, JF i CC; nadzor, CC; validacija, FG, FP, YW, HL i CC; vizualizacija, FG, FP, YW, HL i JF; pisanje–izvorni nacrt, FG i YW; pisanje–recenzija i uređivanje FG i HL Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje: Ovu studiju podupire Projekt znanstvenog i tehnološkog istraživanja Odjela za znanost i tehnologiju pokrajine Henan (dotacija br. 212102310217) i potpora iz fondova Nacionalne zaklade za prirodne znanosti Kine (dotacija br. 81401015).

Izjava Institucionalnog odbora za reviziju: Studija je provedena u skladu sa smjernicama Povjerenstva za brigu o istraživačkim životinjama Sveučilišta Zhengzhou; ZZUIRB2022-32.

Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Nije primjenjivo.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Mozak-imunološke interakcije u perinatalnoj hipoksično-ishemijskoj ozljedi mozga. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hipoksično-ishemijska encefalopatija: pregled za kliničare. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Crni, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al.Globalni, regionalni i nacionalni uzroci smrtnosti djece u 2008.: Sustavna analiza. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Farmakološke neuroprotektivne strategije kod neonatalne ozljede mozga. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119-131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Uloga faktora koji inducira apoptozu u perinatalnoj hipoksično-ishemijskoj ozljedi mozga. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Pjesma, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Vježbe na traci za trčanje i vježbe na kotaču poboljšavaju motoričku funkciju potiskivanjem apoptotičke smrti neuronskih stanica kod štakora s upalom mozga. J. Vježba Rehabil. 2018, 14, 911-919.[CrossRef]

7. Kelly, M.; Darrah, J. Vježbe u vodi za djecu s cerebralnom paralizom. Dev. Med. Dijete. Neurol. 2005., 47, 838–842. [CrossRef]

8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Laktat i BDNF: ključni medijatori neuroplastičnosti izazvane vježbanjem? J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cotman, CW Vježbanje djeluje protiv opadanja funkcije hipokampusa kod starenja i Alzheimerove bolesti. Neurobiol.Dis. 2013.; u tisku. [CrossRef]

10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. Blokada BDNF receptora sprječava korisne učinke tjelovježbe kod štakorskog modela Parkinsonove bolesti. Neuroscience 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com