Stabilizacija mitohondrijske membrane polisaharidom Angelica sinensis u mišjoj aplastičnoj anemiji

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Sažetak

Kako bi se istražio mehanizam stabilizacije mitohondrijske membrane polisaharidom Angelica Sinensis (ASP) kod mišjih aplastičnih anemija (AA) ICR miševi su nasumično podijeljeni u kontrolne. Skupine tretirane AA i ASP Miševi skupine AA tretirani su s 60Co Y i intraperitonealnim injekcijama ciklofosfamida i kloramfenikola. Kontrolne životinje liječene su zračenjem olovom i injekcijom fiziološke otopine. Tretirani AA miševi hranjeni su ASP-om 2 tjedna. Mitohondrijska ultrastruktura koštane srži promatrana je transmisijskom elektronskom mikroskopijom, a transmembranski potencijal stanica s jezgrom koštane srži (BMNC) ispitivan je fluorescentnom spektrofotometrijom. Sadržaji Coxa i MDH u mediju također su proučavani u tri skupine. Broj mitohondrija i transmembranski potencijal BMNC-a u koštanoj srži smanjili su se u skupini AA u usporedbi s kontrolnom skupinom, ali su se poboljšali u skupini liječenoj ASP-om u usporedbi s grupa AA. Potpuno cijepanje mitohondrija u skupini liječenoj ASP-om bilo je značajno odgođeno (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Ključne riječi: aplastična anemija, polisaharid Angelica Sinensis, mitohondriji, membranski potencijal, ICR miševi

Ekstrakt cistanke: potiče stvaranje kostiju i povećava gustoću kostiju

Pozadina

Aplastična anemija (AA) je poremećaj krvi u kojem su koštana srž i povezane krvne matične stanice oštećene uzrokujući manjak crvenih krvnih stanica, bijelih krvnih stanica i trombocita. Ovi nedostaci su pojedinačno poznati kao anemija, leukopenija i trombocitopenija, a zajednički su poznati kao pancitopenija. Izloženost kemikalijama, lijekovima, zračenju, radioaktivnim materijalima, uređajima koji proizvode zračenje, infekcija. imunološka bolest, nasljedstvo (u 50 posto slučajeva) i nepoznata etiologija također mogu dovesti do razvoja AA.

Mitohondriji se smatraju "elektranama stanice" jer proizvode adenozin trifosfat (ATP) sustavnim izvlačenjem energije iz molekula hranjivih tvari (supstrata) [1]. Štoviše, mtDNA se replicira s visokom stopom mutacije budući da joj nedostaju zaštitni histoni i učinkovit sustav popravka DNA. Mutacije u mtDNA povezane su s hematološkim bolestima kao što su stečena sideroblastična anemija, mijelodisplastični sindromi i stečeni AA [2-4]. Naša prethodna studija 5] pokazala je da funkcionalno oštećenje dišnog lanca mitohondrija izazvano mutacijama može biti uključeno u hematopoetsko zatajenje kod bolesnika s AA. Bez obzira na morfološke značajke završne stanične smrti (apoptotična, nekrotična, autofagna ili mitotička), permeabilizacija mitohondrijske membrane (MMP) često je odlučujući događaj između preživljavanja i smrti [6]

Prema tradicionalnoj kineskoj medicini, Angelica Sinensis pomaže u sjedinjavanju krvi i pospješuje njezinu cirkulaciju [7]. Nedavne studije pokazale su da ekstrakti Angelice Sinensis imaju antioksidativne i neuroprotektivne učinke [8,9]. Međutim, antioksidativna funkcija ASP ostaje nejasna. Ova studija ispitala je rano oštećenje stanica pomoću vremenske krivulje mitohondrijske lize i stabilizirajućeg učinka ASP-a na mitohondrijsku membranu kod AA.

Cistanche dodatak povećava gustoću kostiju i potiče stvaranje kostiju

Materijali i metode

Grupiranje životinja

Zdrave ICR muške miševe, težine 18-22 g, stare 6-8 tjedana, osigurao je Centar za eksperimentalne životinje Sveučilišta Shandong (Kina). Životinje su bile smještene u toplom, tihom okruženju sa slobodnim pristupom hrani i vodi. i aklimatiziran tjedan dana prije početka eksperimenata.

Miševi su nasumično podijeljeni u tri skupine: normalna skupina, AA skupina i tretirana skupina. Model aplastične anemije generiran je kako je prethodno opisano [10].

Ukratko, miševi su ozračeni s 2.0Gy 60Coy, a zatim su sljedeća tri dana tretirani dnevnim intraperitonealnim injekcijama 40 mg/kg/dan ciklofosfamida i 50 mg/kg/dan kloramfenikola. Tretirana skupina hranjena je intragastrično s ASP (200 mg/kg/dan, prema Kineskom medicinskom rječniku). Kontrolna skupina i miševi AA skupine hranjeni su intragastrično dijetom s dodatkom fiziološke otopine (10 ml/kg/d). Nadalje, svi su miševi tijekom studije dobivali standardnu ​​prehranu. Nakon tretmana s ASP-om ili fiziološkom otopinom tijekom 2 tjedna, miševi su žrtvovani dislokacijom cerviksa.

Hematološki pregled

Uzorci krvi iz repa triju skupina prikupljeni su prvog, odnosno četrnaestog dana. U uzorcima periferne krvi izbrojani su leukociti i trombociti te je određena razina Hb. Po završetku pokusa, miševi su žrtvovani i pripremljeni su razmazi femura za diferencijalno brojanje stanica s jezgrom koštane srži (BMNC) (Slika 1).

Transmisijska elektronska mikroskopija

Femoralna srž je razmazana i izrezana na ultratanke dijelove. Mitohondriji hematopoetskih stanica u femoralnoj srži analizirani su i izbrojani transmisijskom elektronskom mikroskopijom (JEM-2000EX, Japan) ispod 50 vidnih polja.

Krivulja vremena lize mitohondrija

Mitohondriji su ekstrahirani iz mišjih BMNC prema protokolu proizvođača pribora za izolaciju mitohondrija (Pierce Biotechnology Inc., SAD). Koncentracija monoaminooksidaze (MAO) pokazuje koncentraciju mitohondrija i određena je pomoću 200U/ml suspenzije mitohondrija iz 20 serumskih kultura, unutar 12 sati u različitim vremenskim točkama (intervali od 30 minuta). Određen je i sadržaj citokrom oksidaze (Cox) i malat dehidrogenaze (MDH) u mediju. Analiza vršnog vremena mitohondrijske membrane i krivulja koncentracija-vrijeme specifičnih enzima za matriks pokazala je opseg lize mitohondrijske membrane.

Potencijal mitohondrijske membrane

Nakon predinkubacije s MAO ili ASP, izolirani mitohondriji iz tri skupine resuspendirani su u 0.5 ml fosfatno puferirane slane otopine (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Kina) i 10 ul radne otopine rodamina 123 ( Sigma-Aldrich, SAD) je dodan i inkubiran na 37 stupnjeva C u 5 posto CO2 tijekom 15 minuta. Potencijal mitohondrijske membrane je analiziran protočnom citometrijom korištenjem valne duljine ekscitacije od 490 nm i valne duljine emisije od 520 nm.

Statistička analiza

Statistička analiza provedena je pomoću softvera SPSS 19.0. Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti i standardne devijacije. Za usporedbu različitih skupina korišten je Studentov t-test. P < 0.05="" smatra="" se="" statistički="">

cistanche herb: za bolju kvalitetu kostiju

Rezultati

Broj periferne krvi i BMC

Korištenjem potpuno automatskog analizatora krvnih stanica, utvrđeno je da je broj perifernih krvnih stanica i BMC u AA miševa značajno smanjen (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Ultrastruktura mitohondrija u miševa s aplastičnom anemijom

Transmisijska elektronska mikroskopija koštane srži AA miševa pokazala je da se ultrastruktura mitohondrija značajno poboljšala s ASP-om u liječenoj skupini (tablica 2 i slika 1), što ukazuje da ASP stabilizira mitohondrije u AA miševa. Veličina i oblik mitohondrija kontrolne skupine bili su normalni. U kontrastu. mitohondriji skupine AA imali su povećane kuglaste strukture, zajedno s prekidom ili nestankom krista (Slika 1A-C).

Potencijal mitohondrijske membrane (MMP) kod miševa s aplastičnom anemijom

Budući da je transmisijska elektronska mikroskopija otkrila oštećenje mitohondrija, odredili smo učinak ASP-a na MMP u AA miševa mjerenjem relativnih razlika u fluorescenciji Rh 123 među tri skupine pomoću fluorescentnog spektrofotometra.

Rezultati su pokazali da je Rh 123 fluorescencija stanica koštane srži u AA skupini (19,6±3,03) niža od one u kontrolnoj skupini (31,7±2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Krivulja vremena mitohondrijske lize ranog oštećenja stanica

U kontrolnoj skupini, sadržaju mitohondrijske in vitro kulture Cox i MDH trebalo je 3,5 sata da postigne vrhunac. Sadržaj MAO u kulturi nije se značajno mijenjao tijekom vremena, ali sadržaji COX i MDH postupno su rasli s vremenom, dosegnuvši vrhunac, a zatim postupno opadajući. Stoga je cjelokupnom sadržaju mitohondrija koji su stanice otpustile trebalo oko 3,5 sata da postigne vrhunac cijepanja.

Vrhovi COX i MDH u skupini AA pojavili su se za 1,5 sati, 1,375U/, odnosno 36,732U/l. Vrhovi COX i MDH u liječenoj skupini pojavili su se za 5,5 sati, 6,5 sati, 1,341U/l, 33,994U/, respektivno. Za statističku analizu korištena su dva skupa podataka u svakoj vremenskoj točki. Nakon 1,5 sata, razine COX i MDH u skupini AA bile su značajno više nego u liječenoj skupini (P < 0.05).="" stoga="" je="" potpuno="" cijepanje="" mitohondrija="" u="" serumu="" značajno="" odgođeno="" nakon="" dodatka="" asp="" (p=""><0,05), s="" blagim="" smanjenjem="" vršne="" vrijednosti="" (slika="">

Rasprava

Aplastična anemija (AA) je sindrom zatajenja koštane srži karakteriziran perifernom pancitopenijom i hipoplazijom koštane srži. Mutacije i nestabilnost mtDNA dokazane su u nekoliko bolesti. Mitohondrijska disfunkcija i smanjenje broja mitohondrija mogu rezultirati smanjenjem mtDNA. Utvrđeno je da se stečene delecije mtDNA u hematopoetskom odjeljku javljaju kod teške pancitopenije i retikulocitopenije [11]. Na temelju našeg prethodnog istraživanja [5] ispitali smo može li ASP stabilizirati mitohondrijsku membranu AA miševa.

Kompleks polisaharida i željeza Angelice Sinensis (APIC) ne samo da ima vrhunski terapeutski učinak na IDA, već i na nadopunjavanje krvi i promicanje cirkulacije krvi [12]. ASP može biti koristan za liječenje bolesti izazvanih prekomjernom ekspresijom hepcidina sprječavanjem putova Janus-kinaze (JAK), sin majke protiv ekstracelularne dekapentaplegije (SMAD) i 1 signalom regulirane kinaze (ERK) za regulaciju ekspresije hepcidina u IDA štakora [13]. ]. Qin J je otkrio da ASP može poboljšati sintezu proteoglikana (PG) u kondrocitima u modelu OA štakora in vivo i IL-1B-stimuliranim kondrocitima in vitro promicanjem ekspresije agrekana i GT-ova uključenih u sintezu PG [14].

U našem istraživanju, mišji model AA induciran je kombinacijom acetil fenilhidrazina, X-zraka i ciklofosfamida. Miševi AA pokazali su statistički značajno smanjenje leukocita periferne krvi, Hb i trombocita (tablica 1), te ozbiljno smanjenje stanica humeralne srži i progenitorskih stanica vezanih za srž, što su kliničke karakteristike AA. AA miševi tretirani ASP-om pokazali su progresivno povećanje BM stanica u usporedbi sa skupinom AA. Dodatno, broj mitohondrija u hematopoetskim stanicama također je bio pogođen. ASP je rezultirao značajno većim brojem mitohondrija u liječenoj skupini u usporedbi s AA skupinom (Slika 1). Ovi rezultati su pokazali da ASP može pospješiti proliferaciju stanica srži s jezgrom, povećati broj mitohondrija i stabilizirati mitohondrijsku membranu u AA miševa.

Oštećenje mitohondrija odražava se oštećenjem mtDNA i padom razine transkripata mtRNA, sinteze proteina i mitohondrijske funkcije, što može rezultirati smanjenom staničnom energijom, poremećajem stanične signalizacije i ometanjem stanične diferencijacije i apoptoze. Nadalje, manjkava mitohondrijska proizvodnja ATP-a može potaknuti kromosomsku nestabilnost[15]. Budući da mtDNA kodira komponente četiri od pet mitohondrijskih respiratornih kompleksa, promjene u mtDNA rezultiraju mitohondrijskom bolešću [16-18]. Osim mitohondrijskih bolesti, mutacije u mtDNA povezane su s rakom, dijabetesom. kardiovaskularne bolesti. neurodegenerativnih poremećaja, hematoloških bolesti poput leukemije kao i normalnog procesa starenja [19]. Važno je da mutacije mtDNA, kao i smanjenje broja kopija mtDNA, mogu biti patogene [20, 21]. Razumijevanje staničnih mehanizama za održavanje integriteta mtDNA i broja kopija od iznimne je važnosti jer može pružiti ciljeve za kliničke intervencije usmjerene na prevenciju i liječenje hematoloških bolesti kao što je AA. Ovi čimbenici također mogu rezultirati smanjenim energetskim metabolizmom, što će utjecati na samoobnavljanje i diferencijaciju hematopoetskih matičnih stanica.

Nalazi ove studije pokazuju da ASP može poboljšati ultrastrukturu mitohondrija i potisnuti regulaciju transmembranskog potencijala i apoptozu mijeloidnih elemenata kako bi se izliječio zatajenje koštane srži.

Cistanche & ekstrakt cistanche: bebefit kosti

Reference

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitohondriji. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mutacije mitohondrijske DNA u hematopoetskom sustavu. Leukemija 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Heteroplazmatske točkaste mutacije mitohondrijske DNA koje utječu na podjedinicu I citokrom c oksidaze u dva bolesnika sa stečenom idiopatskom sideroblastičnom anemijom. Blood 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. mitohondrijski

4 . Aberacije DNA stanica koštane srži bolesnika s aplastičnom anemijom. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Potpuni niz

5. analiza mitohondrijske DNA i duljine telomera kod aplastične anemije.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA inducira apoptozu u stanicama ljudskog raka pluća A549 indukcijom reaktivnih vrsta kisika i smanjenjem potencijala mitohondrijske membrane. Int J Mol Med 2010, 25: 231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Hematopoetski učinak polisaharida topivih u vodi iz Angelice Sinensis na miševe s akutnim gubitkom krvi. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Neuroprotektivna uloga 8F Z-ligustilida protiv ishemijske ozljede prednjeg mozga u ICR miševa. Brain Res 2006,1102:145-153.

9. Xin J. Zhang J. Yang Y, et al. Radi Angelica Sinensis koja sadrži komponentu Z-ligustilid potiče neurogenezu odraslih da posreduje u oporavku od kognitivnog oštećenja Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Razina ekspresije IL-6 koju izlučuju stromalne stanice koštane srži u miševa s aplastičnom anemijom.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole za mitohondrijsku DNA u patogenezi mijelodisplazije inducirane zračenjem i sekundarne leukemije.Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Učinak kompleksa polisaharida i željeza Angelice Sinensis na anemiju uzrokovanu nedostatkom željeza u štakora. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. Djelovanje signalnih putova JAK, SMAD i ERK na supresiju hepcidina polisaharidima iz Angelice Sinensis u štakora s anemijom nedostatka željeza. Funkcija hrane 2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Učinak polisaharida Angelice Sinensis na osteoartritis in vivo i in vitro: mogući mehanizam za promicanje sinteze proteoglikana. Komplement temeljen na dokazima Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mitohondrijske DNA mutacije u hematopoetskom sustavu. Leukemija 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Delecije mišićne mitohondrijske DNA u bolesnika s mitohondrijskim miopatijama. Nature 1988, 331: 717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayreov sindrom s delecijom mišićne mitohondrijske DNA. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Mutacija mitohondrijske DNK povezana s Leberovom nasljednom optičkom neuropatijom.Science 1988,242:1427-1430.

19. Wallace DC. Mitohondrijska paradigma metaboličkih i degenerativnih bolesti, starenja i raka: zora za evolucijsku medicinu. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Broj je bitan: kontrola broja kopija mitohondrijske DNK sisavaca. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Genetski uzroci smanjenja mitohondrijske DNA u ljudi. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.

Ekstrakt cistanche: pospješuje stvaranje kostiju i povećava gustoću kostiju