MikroRNA u razvoju i bolesti bubrega Ⅱ

Razvoj bubrega

Thebubreg sisavca(ili metanefros) je vitalni organ koji ima ključnu ulogu uizlučivanje metaboličkog otpada,regulacija volumena izvanstanične tekućine, iodržavanje elektrolitaiacidobazna homeostaza. Štoviše, bubreg proizvodi važne hormone, kao što sueritropoetin, kalcitriol,renin, iprostaglandini(48). Funkcionalni kapacitet bubrega korelira s brojem funkcionalnih nefrona koji se formiraju tijekom razvoja bubrega prije rođenja, što se također naziva nefronska nadarenost. Svaki ljudski bubreg u prosjeku sadrži 1,000,000 nefrona, iako taj broj znatno varira, s procjenama u rasponu od 200,000 do 2,000,{{8 }} nefrona (49, 50). Sstarenje,gubitak funkcionalne rezerve nefronadogađa se tijekom vremena (51, 52); stoga je niska obdarenost nefronima pri rođenju povezana s povećanim rizikom od razvoja hipertenzije i kronične bubrežne bolesti (CKD) kasnije u životu (53-55). Štoviše, CAKUT, koji dovodi do smanjene obdarenosti nefrona i funkcije nefrona, vodeći je uzrok zatajenja bubrega u djece, što rezultira značajnim morbiditetom i mortalitetom povezanim s transplantacijom i dijalizom (56, 57). Stoga, bolje razumijevanje staničnih i molekularnih mehanizama na kojima se temelji uspostavljanje broja nefrona i normalnog formiranja nefrona daje uvid u nove načine predviđanja, prevencije i liječenja bolesti bubrega u dječjoj dobi.

KOLIKO JE POTREBNO DA CISTANCHE DJELUJE KOD BUBREŽNIH PACIJENATA?

Metanefrični razvoj bubregapočinje oko 10.5. embrionalnog dana (E10.5) kod miševa i oko petog tjedna gestacije kod ljudi (58). Kao odgovor na induktivne signale iz metanefričkog mezenhima, ureteralni pupoljak se proteže od kaudalnog kraja Wolffovog kanala i prodire u susjedni mezenhim (Slika 2). Istovremeno, morfogeni koji izlaze iz ureterijskog pupoljka potiču kondenzaciju metanefričkog mezenhima kako bi se formirao mezenhim kapice (također nazvan nefronski progenitori) oko vrhova ureterijskog pupoljka. Kako nefrogeneza napreduje, ureteralni pupoljak prolazi kroz uzastopne krugove grananja, izduživanja i diferencijacije kako bi se stvorili sabirni kanalići bubrega. Subpopulacija progenitora nefrona prolazi mezenhimalno-epitelni prijelaz u obliku bubrežnih mjehurića, koji nakon polarizacije i elongacije postaju tjelesne strukture u obliku zareza i slova S. Konačno, distalni dio tijela u obliku slova S stapa se sa sabirnim kanalom i tvori funkcionalni nefron (59-61). Tijelo u obliku slova S prolazi daljnju diferencijaciju kako bi se formirale zrele vrste stanica nefrona, osim sabirnog kanala. Foxd1+ stromalne progenitorne stanice nalaze se uz nefrone progenitore u vanjskoj kortikalnoj ili nefrogenoj zoni bubrega u razvoju (Slika 2) (62). Smatra se da signali iz kortikalne strome inhibiraju ekspanziju nefronskih progenitorskih stanica i stimuliraju njihovu diferencijaciju, budući da ablacija bubrežne strome dovodi do poremećene diferencijacije nefronskih progenitorskih stanica (63). Foxd1+ progenitorske stanice stvaraju sve stromalne stanice u metanefričkom bubregu, uključujući bubrežne kortikalne i medularne intersticijske stanice, pericite, perivaskularne fibroblaste, mezangijske stanice i vaskularne glatke mišićne stanice (64, 65). Poremećaji u bilo kojem koraku ovog procesa mogu dovesti do CAKUT-a, glavnog uzroka CKD-a u djetinjstvu (66, 67).

Zreli nefron sastoji se od glomerula koji djeluje kao filtracijska jedinica i cjevastog stražnjeg sorpcijskog odjeljka koji je dalje podijeljen na proksimalni zavojiti tubul, Henleovu petlju, distalni zavojiti tubul i sabirni kanal (Slika 2). Filtracijska barijera glomerula (koja se sastoji od fenestriranog endotela, glomerularne bazalne membrane, nastavaka stopala i prorezanih dijafragmi podocita) omogućuje filtraciju plazme i malih otopljenih tvari, dok selektivno zadržava proteine ​​poput albumina i imunoglobulina u krvi (68, 69). U međuvremenu, odjeljak tubularne reapsorpcije odgovoran je za održavanje homeostaze vode, reapsorpciju otopljenih tvari (uključujući natrij, kalij, kalcij, fosfor, magnezij, glukozu i mnoge druge), te izlučivanje kiseline i drugog otpada.

MiRNA u bubrezima u razvoju

U studijama na kondicijskim transgenim miševima, miRNA su se pokazale kao kritični regulatori morfogeneze bubrega u više staničnih linija. Početne studije koje su procjenjivale funkcionalnu ulogu miRNA u razvoju bubrega koristile su uvjetnu deleciju Dicera (70) u različitim bubrežnim linijama. Međutim, poznato je da Dicer ima uloge neovisne o miRNA (71), što je kompliciralo tumačenje ovih modela. Uvjetna delecija Dicera u ranom metanefričkom mezenhimu ili progenitorima nefrona rezultira pojačanom apoptozom progenitora nefrona, povišenim razinama proapoptotskog proteina Bim i preranim prekidom nefrogeneze (72-75) (Tablica 1). Zanimljivo je da gubitak ekspresije Bim u progenitorima nefrona s nedostatkom Dicera smanjuje apoptozu i djelomično obnavlja stvaranje nefrona. Dvije miRNA izražene u progenitorima nefrona, miR-17 i miR-106, identificirane su kao supresori BIM ekspresije (76). Zajedno, ovi nalazi pokazuju da miRNA kontroliraju ravnotežu između preživljavanja i apoptoze u progenitorima nefrona kako bi se osiguralo formiranje ispravnog broja nefrona tijekom nefrogeneze.

Slika 2. Shematski prikaz faza razvoja metanefričnog bubrega. Signali iz ureteralnog pupoljka pokreću kondenzaciju metanefričkog mezenhima kako bi se formirala kapica nefronskih preteča (kapa mezenhima) oko vrhova ureteričnih pupoljaka. Mezenhim kapice prolazi mezenhimalno-epitelni prijelaz u obliku bubrežnih mjehurića, koji se uzastopno razvijaju u tijela u obliku zareza i slova S. Te se strukture spajaju s peteljkom pupoljka uretera, iz koje nastaje sabirni kanal. Stanice u proksimalnoj domeni tijela u obliku slova S diferenciraju se u specijalizirane epitelne stanice zrelog bubrežnog korpuskula (tj. podocite i stanice Bowmanove kapsule), dok se stanice u srednjem i distalnom dijelu diferenciraju u tubularne segmente nefrona (proksimalni tubuli , Henleove petlje i distalni tubuli). Izrađeno s BioRender.com.

Uvjetna delecija Dicera u lozi mokraćnog pupoljka rezultira spektrom abnormalnosti koje jako nalikuju CAKUT-u, uključujući bubrežnu displaziju i razvoj cista sabirnog kanala (73, 77, 78). Prijevremeni prekid morfogeneze grananja (kao odgovor na smanjenu ekspresiju Wnt11 i c-Ret iz pupoljka uretera) vjerojatno je glavni faktor koji pridonosi bubrežnoj displaziji (73). Početak stvaranja ciste događa se oko E15.5 i povezan je s defektima u duljini primarnih resica, povećanom apoptotičkom staničnom smrću i prekomjernom staničnom proliferacijom (73). Kako Dicer ima važne uloge neovisne o miRNA u stanici, uvjetna delecija Dgcr8 korištena je za potvrdu da su fenotipovi opaženi u modelima uvjetnog Dicer-nokauta doista rezultat gubitka miRNA. Životinje s delecijom Dgcr8 u distalnom nefronu i derivatima sabirnog kanala razvijaju hidronefrozu i ciste sabirnog kanala (79), fenotip sličan CAKUT-u koji nalikuje gubitku aktivnosti Dicera u lozi mokraćnog pupoljka.

Studije dviju neovisnih skupina pokazale su da ablacija Dicera iz loze bubrežne strome Foxd1+ i njegovih derivata rezultira spektrom bubrežnih anomalija, s dosljednim nalazima u vezi s hipoplastičnim bubrezima, smanjenim brojem glomerula, abnormalnim sazrijevanjem glomerula i defektnim vaskularnim uzorkovanje (80, 81). Iako su obje skupine opisale uglavnom podudarne fenotipove koristeći slične mišje modele, uočene su dvije različite razlike. Nakagawa i sur. uočili nedostatak unutarnje medule i papile, kao i smanjenje nefrogene zone (80). Nasuprot tome, Phua et al. pokazali su ekspanziju populacije nefrona progenitora i očuvanu bubrežnu papilu (81). Nakagawa i sur. predložio je da su ti nedostaci povezani s prekidom signalizacije puta Wnt, što rezultira promjenama u migraciji i proliferaciji stromalnih stanica, zbog smanjene regulacije miRNA stromalnih stanica, miR-214, miR-199a{{7 }}p i miR-199a-3p (80). Studija Phua i sur. sugerirali su da promjene u apoptotskim programima (uključujući povećanu ekspresiju Bim i p53 efektorskih gena) doprinose fenotipskim defektima (81). Moguće je da genetske pozadinske razlike i/ili učinkovitost Cre-posredovane rekombinacije mogu biti odgovorne za razlike koje ove studije opisuju. Unatoč tome, opisani fenotipovi su u skladu s poznatim višestrukim ulogama bubrežne strome u razvoju bubrega, a mehanizmi na kojima se temelje ti fenotipovi vjerojatno su složeni s obzirom na prirodu Dicerove delecije. Potrebne su daljnje studije koje ispituju specifične miRNA u raznim stromalnim subpopulacijama kako bi se bolje definirali regulatorni mehanizmi koji su u igri.

Noviji rad bavio se pitanjem funkcije specifičnih miRNA u bubregu i nefronu u razvoju. Koristeći model matičnih stanica ljudskog embrija, Bantounas et al. pokazalo je da inhibicija klastera miR-199a~214 rezultira dismorfnim glomerulima, aberantnim proksimalnim tubulima, smanjenom ekspresijom WT1 i povećanim intersticijskim kapilarama u organoidima sličnim bubrezima (82). Zanimljivo je da globalna delecija miR-210 koja reagira na hipoksiju dovodi do deficita nefrona specifičnog za muškarce (83). Na primjer, uvjetna delecija klastera miR-17~92 u nefronskim progenitorima i njihovim derivatima u miševa smanjuje proliferaciju progenitorskih stanica i smanjuje broj nefrona u razvoju. Kao rezultat, mutirani miševi razvijaju proteinuriju, fibrozu bubrega i oštećenu funkciju bubrega (84). Disregulirane razine ciljnog gena miR-17~92, CFTR, upletene su u neispravnu proliferaciju progenitorskih stanica i smanjenu obdarenost nefrona u ovom mišjem modelu (85).

Sekvenciranje male RNA (smRNA-Seq) sve se više koristi za profiliranje obrazaca ekspresije miRNA i za otkrivanje novih vrsta miRNA. smRNA-Seq E15.5 nefrogenih mezenhimalnih stanica identificirao je 162 označene miRNA koje su različito izražene u ovoj staničnoj populaciji u usporedbi s cijelim bubrezima i 49 novih vrsta miRNA (86). Zanimljivo je da su razine miRNK obitelji miR-200 značajno smanjene u progenitorima nefrona. S obzirom na to da su članovi obitelji miR-200 ključni regulatori mezenhimalno-epitelnog prijelaza u sabirnom kanalu (87), nagađamo da bi njihova ekspresija mogla biti strogo regulirana kako bi se osigurala normalna epitelna diferencijacija nefronskih progenitora tijekom razvoja bubrega.

MiRNA funkcionira u zrelom nefronu

Uz njihovu potrebu tijekom razvoja bubrega, miRNA reguliraju brojne biološke procese u glavnim staničnim linijama koje tvore zreli nefron (69, 88-91). U skladu s tim, opisana je segmentno specifična ekspresija miRNA duž nefrona, uključujući miR-143 i miR-195a u glomerulu, miR-107 i miR{{7} }a u proksimalnom tubulu, miR-193 i miR-378a u debelom uzlaznom kraku, miR-874 i miR-155 u distalnom zavojitom tubulu i miR{{ 12}}c u sabirnom kanalu (87). Štoviše, funkcionalne studije u odjeljcima zrelog nefrona podržavaju različite uloge miRNA.

Miševi kojima nedostaju Dicer ili Drosha u podocitima pokazuju izraženu proteinuriju, glomerulosklerozu i brzu progresiju do zatajenja bubrega, sekundarno zbog poremećaja barijere glomerularne filtracije (90-93). In silico analize otkrile su da različiti pojačano regulirani transkripti u mutiranim glomerulima sadrže ciljne sekvence za miR-30 članove obitelji. Kao sva četiri miR-30 člana obitelji (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d i miR-30c{ {9}}) normalno jako eksprimirani u podocitima, ove miRNA mogu biti odgovorne za abnormalnosti podocita i poremećaj glomerularne filtracijske barijere u mutiranih miševa (91).

Donekle iznenađujuće, brisanje Dicera iz postnatalnih proksimalnih tubula sisavaca ne utječe na razvoj bubrega, histologiju ili funkciju, ali štiti od bubrežne ishemije/reperfuzijske ozljede. Mutantni miševi pokazuju bolju funkciju bubrega, smanjenu ozljedu bubrega, manju tubularnu apoptozu i poboljšano preživljavanje u usporedbi s njihovim WT kolegama iz legla (94). Ovo vjerojatno odražava "zbroj" učinka delecije višestrukih miRNA u proksimalnom tubulu, budući da je drugi rad od tada pokazao da je ekspresija specifičnih miRNA zaštitna kod bubrežne ishemije/reperfuzijske ozljede (npr. miR-16 i miR-21 ref. 95, 96); dok su drugi štetni (npr. miR-182; ref. 97).

Iako se čini da su miRNA nezamjenjive za funkciju proksimalnih tubula, one su bitne za distalne nefrone i homeostazu sabirnog kanala (79, 88, 98). Sakupljanje specifične inaktivacije dicera za kanale i drugih kritičnih gena povezanih s biogenezom miRNA (uključujući Dgcr8, Ago1, 2, 3 i 4) uzrokuje zatajenje bubrega kod odraslih miševa zbog progresivne tubulointersticijske fibroze i intersticijske upale (88). Ovome prethodi djelomična epitelno-mezenhimalna tranzicija (EMT) stanica sabirnih kanala i regulacija miR-200 članova obitelji, koji inhibiraju EMT (88). Slično tome, ablacija Dicera ili Dgcr8 iz distalnog nefrona i derivata pupoljka uretera rezultira bubrežnim abnormalnostima i zatajenjem bubrega (78, 98), koji su u konačnici povezani s niskom regulacijom članova obitelji miR-200 (98). Povećana ekspresija miR-200 ciljnog gena Pkd1 u ovih mutiranih miševa remeti tubulogenezu i proizvodi strukture slične cistama (98). Ove razlike u zahtjevima za funkcionalnim miRNA u proksimalnim tubulima i distalnom nefronu/sabirnom kanalu mogu se objasniti segmentnom raspodjelom miRNA duž duljine nefrona i sabirnog kanala u WT bubrezima (88).

Brisanje Dicera u stanicama koje izlučuju renin u jukstaglomerularnom aparatu rezultira deficitom jukstaglomerularnih stanica, smanjenom razinom cirkulirajućeg renina s posljedičnim smanjenjem arterijskog krvnog tlaka, smanjenom funkcijom bubrega, prugastim uzorkom intersticijske fibroze i vaskularnim abnormalnostima (89). Smanjenje jukstaglomerularnih stanica ukazuje na potrebu za zrelim miRNA u održavanju njihovog fenotipa. Kasnije su miR-330 i miR-125b-5p identificirani kao potencijalni kandidati koji ili inhibiraju ili promiču fenotip glatkih mišića jukstaglomerularnih stanica (99).

Druga aktivna područja istraživanja miRNA kod akutne ozljede bubrega (8-10), policistične bolesti bubrega (11) i transplantacije bubrega (10) iscrpno su obrađena u drugim nedavnim pregledima.

MiRNA u pedijatrijskim bubrežnim bolestima U ovom odjeljku dajemo pregled uloge miRNA u razvojnim bubrežnim bolestima, uključujući CAKUT i Wilmsove tumore. CAKUT su među najčešćim oblicima malformacija pri rođenju, a pogađaju otprilike 3-7 od 1000 živorođene djece (100). Poremećaj razvoja bubrega i donjeg urinarnog trakta dovodi do širokog spektra kliničkih manifestacija uočenih u CAKUT-u, uključujući anomalije bubrega (tj. agenezu bubrega, hipoplaziju i displaziju bubrega i multicistične displastične bubrege), anomalije ureteropelvičnog spoja (tj. opstrukciju ureteropelvičnog spoja), duplex sabirni sustav te anomalije mjehura i uretre (101–103). Ova fenotipska heterogenost vjerojatno je posljedica složenih interakcija između genetskih, epigenetskih i/ili prenatalnih okolišnih čimbenika koji utječu na razvoj bubrega i donjeg urinarnog trakta, što rezultira CAKUT-om (101). Većina našeg trenutnog znanja o patogenezi CAKUT-a proizašla je iz mišjih modela i sindromskih oblika CAKUT-a. Ove su studije dovele do identifikacije nekoliko gena CAKUT, od kojih su mnogi uključeni u rani razvoj bubrega, uključujući PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 i druge (101, 104, 105). Međutim, pojedinačne mutacije ili varijante broja kopija u genima za kodiranje proteina ne objašnjavaju većinu slučajeva CAKUT (~80%) (101, 106).

Kao što je gore spomenuto, smanjenje zrelih miRNA iz različitih staničnih linija bubrega u razvoju u mišjim modelima rezultira abnormalnostima bubrega koje oponašaju ljudski CAKUT (73, 74, 78, 79). Osim toga, delecije MIR17HG iz germinativne linije, koji kodira klaster miR-17~92, uzrokuju Feingoldov sindrom tipa 2 kod ljudi (107). Iako bubrežni fenotip u bolesnika s Feingoldovim sindromom tipa 2 s mutacijama MIR17HG ostaje nedefiniran, prijavljena je incidencija CAKUT-a od 18% u slučajevima Feingoldovog sindroma koji su povezani s mutacijama MYCN (108, 109). Zajedno, ova opažanja upućuju na to da bi mutacije u miRNA eksprimirane tijekom razvoja bubrega mogle uzrokovati CAKUT kod ljudi, osobito jer su mnoge miRNA visoko očuvane između miševa i ljudi.

Kako bi se testirala ova hipoteza, jedna je studija istraživala 1248 pacijenata s nesindromskim CAKUT-om iz 980 obitelji i tražila mutacije u 96 regija matične petlje 73 miRNA gena bubrežnog razvoja (106). Unutar ove kohorte identificirana je 31 osoba sa 17 različitih varijanti jednog nukleotida koje utječu na 16 različitih miRNA gena. Među njima, za dvije nove varijante miRNA pronađeno je da su potencijalno patogene. MIR19B1 (član klastera miR-17~92) bio je povezan s prisutnošću ageneze desnog bubrega, a MIR99A s teškim vezikoureteralnim refluksom i ptozom bubrega. Ovaj iznenađujuće nizak broj kandidata za patogene varijante djelomično je posljedica ograničenja ove studije, budući da je analiza uzela u obzir samo mutacije u miRNA genima koji su bili uključeni u pristup genima kandidata i nije otkrila varijacije broja kopija i velike DNA preraspodjele (106) .

U alternativnom pristupu, segmenti uretera pacijenata s različitim CAKUT-om analizirani su na diferencijalnu ekspresiju transkripta putem mikronizova, na prisutnost bioinformatički predviđenih miRNA ciljeva i zrelih miRNA putem qPCR (110). Koristeći ovaj višestruki pristup, identificirano je sedam miRNA s potencijalnom ulogom u CAKUT-u, a među njima je has-miR-144 značajno povećan u bolesnika s CAKUT-om. Analiza genske ontologije pokazala je da predviđeni has-miR-144 ciljni geni doprinose biološkim procesima uključenim u razvoj CAKUT-a, uključujući razvoj cijevi (22 ciljna gena), razvoj urogenitalnog sustava (18 ciljnih gena), razvoj bubrega (14 ciljnih gena) i razvoj embrionalnih organa (18 ciljnih gena) (110).

Potrebne su daljnje studije kako bi se definirali molekularni mehanizmi koji leže u pozadini patogene uloge miRNA u CAKUT-u. Nalazi iz takvih studija bit će ključni za poboljšanje skrbi za pacijente s CAKUT-om i sprječavanje njihove progresije u CKD, pružanje odgovarajućeg genetskog savjetovanja za pacijente i njihove obitelji i razvoj novih terapijskih strategija.