Mehanička studija Xian Fang Huo Ming napitka baziranog na Cistancheu u liječenju kroničnog prostatitisa: Integrirana mrežna farmakologija i eksperimentalna validacija usmjerena na put PI3K/Akt/NF-κB
Oct 27, 2025
2. Metode
2.1 Mrežna farmakologija i analiza molekularnog spajanja
2.1.1 Identifikacija aktivnih komponenti i ciljeva bolesti
Korištenjem baze podataka TCMSP, aktivni spojevi u piću Xian Fang Huo Ming (XFHY) na bazi Cistanche pregledani su prema ADME kriterijima: oralna bioraspoloživost (OB) veća ili jednaka 30% i sličnost lijeku (DL) veća ili jednaka 0,18. Potencijalni ciljevi ovih spojeva identificirani su korištenjem SwissTargetPrediction (vjerojatnost veća od ili jednaka 0,1). Mreža "biljka–spoj–cilj" konstruirana je korištenjem Cytoscapea 3.9.1, a prvih pet spojeva identificirano je na temelju stupnja centralnosti. Istovremeno, ciljane bolesti povezane s CP/CPPS-om prikupljene su s GeneCards, OMIM i DisGeNET korištenjem ključnih riječi kao što su "kronični prostatitis" i "prostatitis".
Dodaci ekstrakta cistanche za zdravlje prostate i bubrega PhGs75% Ech 30% Act 12%
2.1.2 Identifikacija ciljeva presjeka
Presjek između ciljeva spojeva XFHY i ciljeva bolesti CP/CPPS utvrđen je pomoću softvera Venny 2.1 za generiranje Vennovog dijagrama, identificirajući ključne potencijalne terapijske ciljeve.
2.1.3 Izgradnja PPI mreže
Ciljevi presjeka uvezeni su u bazu podataka STRING (vrsta: Homo sapiens; ocjena interakcije > 0,9). Rezultirajuća mreža protein-protein interakcije (PPI) uvezena je u Cytoscape, a glavni ciljevi identificirani su pomoću CytoHubbe na temelju parametara mrežne topologije kao što su stupanj, međusobnost i bliskost.
2.1.4 Izgradnja mreže "biljka–spoj–cilj–put"
Koristeći Cytoscape 3.9.1, izgrađen je mrežni model za vizualizaciju odnosa između XFHY, njegovih aktivnih spojeva, ciljeva i signalnih putova. Mrežni parametri su analizirani kako bi se odredili ključni čvorovi.
2.1.5 GO i KEGG analiza obogaćivanja
Ciljevi presjeka učitani su u DAVID bazu podataka za analizu puta obogaćivanja genske ontologije (GO) i Kyoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) (P <0,05). Rezultati su vizualizirani pomoću bioinformatičkih alata.
2.1.6 Molekularno spajanje
Prvih pet spojeva (npr. kvercetin, kemferol) korišteni su kao ligandi, a prvih deset glavnih ciljeva iz PPI mreže kao receptori. Proteinske strukture dobivene su iz Banke podataka o proteinima (PDB), prethodno obrađene pomoću AutoDockTools 1.5.6 (uključujući dehidraciju, hidrogenaciju i dodavanje naboja) i pretvorene u PDBQT format. Strukture liganda u MOL2 formatu dobivene su iz TCMSP i na sličan način pretvorene. Molekularno spajanje provedeno je pomoću AutoDocka, a afiniteti vezanja vizualizirani su pomoću GraphPad Prism 8.
2.2 Pokusi na životinjama
2.2.1 Uspostavljanje modela
Za modeliranje CP/CPPS korištena je metoda kemijske indukcije. Štakori su anestezirani s 3% pentobarbital natrijem (50 mg/kg). Napravljen je središnji rez u donjem dijelu abdomena, a 80 μL 3% λ-karagenana ubrizgano je u svaki lateralni režanj prostate (ukupno 160 μL). Lažno operirani štakori primali su injekcije fiziološke otopine. Postoperativna njega uključivala je topikalnu primjenu antibiotika. Sedmog dana uspjeh modeliranja potvrđen je grubim i histološkim pregledom prostate (edem, kongestija, epitelna degeneracija i upalna infiltracija).
2.2.2 Grupiranje i tretman
Sedamdeset mužjaka SD štakora nasumično je podijeljeno u sedam skupina (n=10):
Normalna kontrola
Lažna operacija
Kontrola modela
XFHY skupine s niskim, srednjim i visokim dozama
Skupina tamsulozina
Doze su izračunate na temelju ekvivalentne doze za ljude (7,29 g/kg/dan). XFHY je primijenjen oralnom sondom pri 0,3645 g/mL (niska) i 1,458 g/mL (visoka). Tamsulozin je primijenjen u dozi od 0,0018 mg/kg. Svi tretmani trajali su 28 dana, počevši 8 dana nakon modeliranja.
2.2.3 Histopatološka procjena
Lijevi režnjevi prostate su fiksirani u 4% paraformaldehidu, uklopljeni u parafin, izrezani i obojeni hematoksilin-eozinom. Histološke promjene procijenjene su pod svjetlosnim mikroskopom.
2.2.4 ELISA za markere upale
Krv sakupljena preko abdominalne aorte je centrifugirana, a serumske razine TNF-, IL-1 i COX-2 izmjerene su pomoću ELISA kompleta prema uputama proizvođača.
2.2.5 qRT-PCR za ekspresiju gena
Ukupna RNA ekstrahirana je iz tkiva prostate i obrnuto transkribirana u cDNA. PCR u stvarnom vremenu proveden je korištenjem specifičnih početnica za PI3K, Akt i NF-κB p65. GAPDH je korišten kao interna kontrola. Relativni izraz izračunat je metodom 2^-ΔΔCt.
2.2.6 Western blot za ekspresiju proteina
Protein je ekstrahiran iz smrznutog tkiva prostate korištenjem RIPA pufera. Nakon kvantifikacije, proteini su odvojeni pomoću SDS-PAGE, prebačeni na PVDF membrane i testirani primarnim antitijelima protiv PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt (Ser473/Thr308), NF-κB p65 i p-NF-κB p65. Korištena su sekundarna protutijela konjugirana s HRP-om i ECL detekcija. Intenziteti trake su kvantificirani korištenjem ImageJ.
2.2.7 Statistička analiza
Svi pokusi izvedeni su u tri primjerka. Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 8 i izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Jednosmjerna ANOVA praćena LSD-om ili Dunnettovim testom korištena je za usporedbu više skupina. P < 0,05 smatra se statistički značajnim.
3. Rezultati
3.1 Mrežna farmakologija i molekularno spajanje
Složeno – ciljno raskrižje:912 složenih ciljeva i 2197 ciljeva bolesti dali su 374 cilja koji se preklapaju.
Glavni identificirani spojevi:Kvercetin, kaempferol, pelargonidin, naringenin i byakangelicol - svi s poznatim protuupalnim i antioksidativnim učincima.
PPI analiza:Ključni ciljevi uključivali su TP53, AKT1, EGFR, TNF, IL6, STAT3, BCL2, CASP3, CCND1 i NFKB1.
GO i KEGG obogaćivanje:Obogaćeni putovi uključivali su PI3K/Akt, MAPK, RAS i biološke procese povezane s upalom.
Molekularno spajanje:Uočeni su jaki afiniteti vezanja između glavnih ciljeva i glavnih spojeva (energija vezanja manja ili jednaka -5,0 kcal/mol), što ukazuje na visoku bioaktivnost.
3.2 Eksperimentalna validacija
3.2.1 HE bojenje
Štakori modelne skupine pokazali su degeneraciju žlijezdanog epitela, stromalni edem i opsežnu upalnu infiltraciju. Skupine liječene XFHY-om pokazale su smanjenu upalu, posebno u skupinama koje su primale srednje i visoke doze.
3.2.2 Razine upalnih markera
U usporedbi s modelnom skupinom, XFHY je značajno smanjio serumske razine TNF-, IL-1 i COX-2 (P <0,01), što ukazuje na protuupalnu učinkovitost.
3.2.3 Ekspresija gena (qPCR)
XFHY je značajno smanjio razine mRNA PI3K, Akt i NF-κB p65 na način ovisan o dozi. Samo niske doze smanjuju Akt i p65; skupine sa srednjom i visokom dozom pokazale su širu supresiju.
3.2.4 Ekspresija proteina (Western blot)
Razine fosforilacije PI3K, Akt (Ser473, Thr308) i NF-κB p65 bile su značajno povišene u modelnoj skupini i smanjene u štakora tretiranih XFHY, posebno pri srednjim i visokim dozama.
4. Rasprava
Na temelju kliničkog iskustva, ova studija to potvrđujeXFHY na bazi Cistancheima značajan protuupalni učinak na CP/CPPS. Mrežna farmakologija identificirala je ključne aktivne spojeve, posebnokvercetin, s dokazanim protuupalnim i antioksidativnim svojstvima. PPI analiza istaknula je ciljeve kao što suTNF, IL6, iAKT1, koji su središnji za upalu kod prostatitisa.
KEGG analiza je sugerirala uključenostPI3K/Akt/NF-κBsignalni put-široko prepoznat u upali i imunološkoj regulaciji. XFHY može imati terapeutske učinke inhibicijom ovog puta, čime se smanjuje ekspresija proupalnih citokina.
Nadalje, čini se da je dvostruka fosforilacija Akt (Ser473 i Thr308) kritična za aktivaciju NF-κB. XFHY je inhibirao fosforilaciju na oba mjesta, što ukazuje na inhibiciju NF-κB signalizacije putem supresije Akt uzvodno.
Zaključak
XFHY može ublažiti CP/CPPS blokiranjem puta PI3K/Akt/NF-κB, smanjujući ekspresijuIL-1 , TNF-, iCOX-2, i ublažavanje upalnih odgovora u tkivu prostate. Uključivanje putanje, posebno fosforilacija Akt na Ser473 i Thr308, pruža potencijalno mehaničko objašnjenje za učinkovitost XFHY. Zajamčena su daljnja istraživanja kako bi se potvrdilo je li PI3K/Akt/NF-κB konačan put kojim XFHY ispoljava svoje terapeutsko djelovanje.
Sukob interesa:
Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Javi mi ako želišgrafički sažetak, sažetak tablice, iliPowerPoint prezentacijana temelju ove studije!
