Mehanizmi i ciljevi imuniteta posredovanog Fc-receptorima na sporozoite malarije

Cjepivo s visokom zaštitom uvelike će olakšati postizanje i održavanje eliminacije malarije. Razumijevanje mehanizama imunosti posredovane antitijelima ključno je za razvoj cjepiva visoke učinkovitosti. Ovdje identificiramo ključne uloge u humoralnom imunitetu za interakcije Fc-receptora (Fc R) i opsoničnu fagocitozu sporozoita.

Identificirali smo značajnu glavnu ulogu neutrofila u posredovanju fagocitnog čišćenja sporozoita u perifernoj krvi, dok monociti doprinose manjoj ulozi. Antitijela također potiču aktivnost prirodnih stanica ubojica. Mehanički, čini se da su interakcije protutijela s Fc RIII bitne, s Fc RIIa također potrebnim za maksimalnu aktivnost. Sve regije proteina cirkumsporozoita mete su funkcionalnih protutijela protiv sporozoita, a N-terminalna protutijela imaju veću aktivnost u nekim testovima. Funkcionalna protutijela polako se stječu nakon prirodne izloženosti malariji, prisutna među nekim izloženim odraslim osobama, ali neuobičajena među djecom. Naša otkrića otkrivaju ciljeve i mehanizme imuniteta koji bi se mogli iskoristiti u dizajnu cjepiva kako bi se povećala učinkovitost.

Malarija je i dalje veliki globalni zdravstveni problem, s P. falciparum malarijom koja uzrokuje oko 219 milijuna kliničkih slučajeva i 435 000 smrtnih slučajeva godišnje1. Unatoč međunarodnim naporima za kontrolu, teret malarije ostao je konstantan posljednjih godina1. Postoji snažna potreba za visoko učinkovitim cjepivom za kontrolu i eliminaciju malarije, što je dodatno naglašeno sve većim brojem izvješća o otpornosti na lijekove protiv malarije i otpornosti na insekticide1. Svjetska zdravstvena organizacija i partneri koji financiraju postavili su cilj razviti cjepivo s većom ili jednakom učinkovitošću od 75 posto do 2030. godine2, što se pokazalo izazovnim za postizanje3,4. Potrebno je bolje razumijevanje mehanizama koji posreduju u imunitetu kako bi se razvile strategije koje generiraju snažnije zaštitne imunološke odgovore.

Poboljšanje imuniteta u svakodnevnom životu zahtijeva od nas održavanje dobrih životnih navika. Uspostava i održavanje rasporeda odlaska na spavanje i buđenja može pospješiti normalan rad cirkadijalnog ritma. Izbjegavajte visokokalorične blagdanske obroke i izbjegavajte jesti kiselu ili začinjenu hranu koja može otežati probavu. Odlučite se za laganu večeru sa svježim namirnicama. Ograničite korištenje elektroničkih uređaja. Svjetlo zaslona može nas prevariti da se probudimo nekoliko puta noću mijenjajući cikluse spavanja i kvalitetu sna. Izbjegavajte naporne vježbe u ranim večernjim satima. Preporuča se minimalno dva sata. Vježbanje potiče oslobađanje adrenalina i ubrzava rad srca, što aktivira naš san. Osim toga, možemo unijeti i Cistanche deserticola. Polisaharidi i verbaskozid u Cistanche deserticola mogu ojačati imunitet. Polisaharidi i verbaskozid Cistanche deserticola mogu povećati enzimsku aktivnost srčanog i moždanog tkiva, te pojačati fagocitnu funkciju peritonealnih stanica i proliferacijski odgovor limfocita.

Pritisnite kada želite uzeti cistanche

Infekcija malarijom počinje ubodom zaraženog komarca Anopheles, tijekom kojeg se sporozoiti inokuliraju u dermis5. Sporozoiti zatim migriraju u krvnu žilu, cirkuliraju krvotokom do jetre i uspostavljaju infekciju u hepatocitima. Sporozoiti predstavljaju prioritetnu metu cjepiva protiv malarije jer će čišćenje sporozoita zaustaviti infekciju prije pojave kliničke malarije3. Istraživanja na životinjskim modelima i ispitivanja cjepiva utvrdila su da su protutijela ključni posrednici imuniteta na sporozoite (pregledano u ref. 3). Međutim, kako protutijela mehanički funkcioniraju kako bi očistila sporozoite i spriječila infekciju, te specifične mete funkcionalnih protutijela, nije dobro shvaćeno. Potrebni su novi uvidi u ova pitanja kako bi se olakšao razvoj učinkovitijih cjepiva.

Protein cirkumsporozoita (CSP) najzastupljeniji je protein na površini sporozoita6 i glavna meta ljudskih protutijela6. Cjepiva koja se temelje na CSP-u do danas su bila bolja od drugih antigena cjepiva, iako je učinkovitost i dalje ispod optimalne3. Najnaprednije cjepivo protiv malarije, RTS, S, temelji se na skraćenom obliku CSP (sadrži samo središnje ponavljajuće područje i C-terminalno područje) i postiglo je skromnu učinkovitost protiv kliničke malarije (29-36 posto) u fazi III kliničkog ispitivanja7. Središnje ponavljajuće područje CSP-a smatra se važnom metom protutijela, pa je stoga potencijalna važnost protutijela za neponavljajuće regije uvelike nedovoljno proučena8, ali može biti važna. Protutijela na C-terminalnu regiju povezana su sa zaštitom u ispitivanjima RTS i S cjepiva kod djece9.

Što se tiče funkcionalnih mehanizama protutijela, većina objavljenih studija usredotočila se na izravnu inhibitornu aktivnost protutijela na središnju ponovljenu regiju CSP-a, koja mogu inhibirati pokretljivost sporozoita i invaziju hepatocita in vitro10-17. Malo se zna o drugim potencijalno važnim mehanizmima i ciljevima imuniteta.

Ključni imunološki mehanizam koji se sve više prepoznaje u imunitetu protiv virusnih i bakterijskih patogena18-21 je sposobnost protutijela za interakciju s Fc receptorima (Fc R) na različitim tipovima stanica što dovodi do opsonične fagocitoze ili izravne citotoksičnosti. Antitijelima na antigene sporozoita tipično dominiraju potklase IgG1 i IgG313, koje imaju snažan potencijal za interakciju s Fc Rs22. Međutim, trenutačno se malo zna o ovim potencijalnim mehanizmima imuniteta na sporozoite. Glavni tipovi fagocitnih stanica uključuju monocite i neutrofile (2-10 posto odnosno 45-70 posto perifernih bijelih krvnih stanica).

Uz fagocitozu, neutrofili i stanice prirodne ubojice (NK) također mogu ubiti stanice putem stanične citotoksičnosti ovisne o antitijelima (ADCC)23,24, a i monociti i neutrofili također imaju šire imunološke učinke putem ekspresije aktivacijskih markera, citokina, i kemokini (pregled u referencama 25-27).

Obrasci ekspresije Fc R razlikuju se između monocita i neutrofila, što utječe na njihove funkcije u imunitetu. Budući da sporozoiti predstavljaju prvi korak u započinjanju infekcije malarijom, sporozoiti bi se obično susreli s potencijalnim fagocitnim stanicama u stanju mirovanja ili homeostatskom stanju, a ne u aktiviranom stanju.

Monociti u stadiju mirovanja pretežno eksprimiraju Fc RI i Fc RIIa, s malim podskupom koji eksprimira Fc RIIIa28, dok neutrofili u stadiju mirovanja eksprimiraju Fc RIIa i Fc RIIIb29 i niske razine Fc RIIIa30 (što je funkcionalno važno). Procjena specifičnih interakcija između protutijela i različitih Fc R je stoga važna za razumijevanje potencijalnih uloga različitih fagocita u imunitetu. IgG potklasa, glikozilacija i specifičnost epitopa mogu utjecati na interakcije s različitim Fc Rs22.

Definiranje Fc R-posredovanih mehanizama koji ciljaju na sporozoite može otkriti spoznaje koje bi se mogle iskoristiti za poboljšanje zaštitne učinkovitosti cjepiva na bazi sporozoita. U ovoj studiji otkrivamo važne mehanizme i ciljeve imuniteta protiv sporozoita posredovanih specifičnim Fc Rs na imunološkim stanicama. Razvijamo tehnike za mjerenje interakcija između antitijela i specifičnih Fc R i identificiramo specifična svojstva antitijela, antigenske ciljeve i Fc R koji su važni za optimalnu funkcionalnu aktivnost. Nadalje, kvantificirali smo stjecanje funkcionalnih odgovora protutijela ovisnih o Fc R u djece i odraslih koji su prirodno bili izloženi malariji. Naša otkrića otkrivaju važne imunološke mehanizme protiv sporozoita i predlažu strategije i antigenske ciljeve za razvoj visoko učinkovitog cjepiva protiv malarije.

Rezultati

Opsonična fagocitoza sporozoita pretežno je posredovana neutrofilima u perifernoj krvi.

Kako bismo istražili relevantnost Fc R-posredovanih mehanizama protiv sporozoita, prvo smo uspostavili testove opsonične fagocitoze korištenjem nediferencirane THP-1 stanične linije (promonocitne stanice), pod standardnim uvjetima31,32 (dodatna slika 1A). Za opsonizaciju sporozoita upotrijebili smo serumska protutijela odraslih Kenijaca koji žive u regiji s visokim intenzitetom prijenosa malarije i imaju značajan klinički imunitet na malariju i protutijela na CSP33. Opsonizirane sporozoite P. falciparum učinkovito su fagocitirale stanice THP-1 na način ovisan o koncentraciji s malom fagocitozom korištenjem protutijela donora koji nisu bili zaraženi malarijom (stanovnici Melbournea) (dodatna slika 1B). Opsonična fagocitoza posredovana pojedinačnim serumima bila je vrlo ponovljiva (r=0.925, P < 0.001; Dodatna slika 1C).

Kako bismo prevladali izazove u stvaranju velikog broja održivih sporozoita za testove opsonične fagocitoze, uspostavili smo upotrebu fluorescentnih kuglica obloženih CSP-om pune duljine, glavnim antigenom izraženim na sporozoitima, kao surogat mjere opsonične fagocitoze sporozoita. Zrnca obložena CSP-om opsonizirana s odabirom uzoraka protutijela iz različitih odraslih Kenijaca bila su učinkovito fagocitirana stanicama THP-1, a opsonična fagocitoza zrnaca obloženih CSP-om snažno je korelirala s opsoničkom fagocitozom sporozoita P. falciparum (r {{4 }}.831, P=0.0015, Dodatna slika 1D). Stoga su CSP kuglice pružile učinkovitu platformu za proučavanje mehanizama i ciljeva opsonične fagocitoze posredovane antitijelima.

Zatim smo istražili tipove stanica koje posreduju opsoničnu fagocitozu u testu cijelih leukocita sa svježom krvlju, u početku koristeći CSP kuglice opsonizirane poliklonskim zečjim antitijelima na CSP. Zanimljivo je da je stopa fagocitoze (broj kuglica fagocitiranih po stanici) bila mnogo veća kod neutrofila nego kod monocita (Slika 1A, B). Budući da smo kvantificirali stopu fagocitoze, veća aktivnost neutrofila nije jednostavno objašnjena njihovom većom zastupljenošću u usporedbi s monocitima. Opsonična fagocitoza se povećavala s povećanjem koncentracije protutijela, a viša relativna aktivnost neutrofila u usporedbi s monocitima uočena je u koncentracijama protutijela i nizu omjera kuglica: stanica. Veća aktivnost fagocitoze neutrofila potvrđena je korištenjem svježe izoliranih živih sporozoita (koristili smo transgene sporozoite P. berghei koji eksprimiraju CSP P. falciparum, koji zamjenjuje endogeni gen CSP P. berghei12, označen kao PfCSP-P. berghei). Opsonična fagocitoza sporozoita opsoniziranih protutijelima kenijskih donora izloženih malariji bila je pretežno posredovana neutrofilima sa samo niskim razinama fagocitoze monocita, a neutrofili pokazuju višu stopu fagocitoze (Slika 1C). Također smo izvršili testove kako bismo omogućili produženo vrijeme za fagocitozu (do 60 minuta), ali smo još uvijek primijetili mnogo veću fagocitozu neutrofila u usporedbi s monocitima (dopunska slika 2A).

Daljnja analiza populacije monocita pokazala je da je većina fagocitoze nastala klasičnom podskupinom (CD14visoki CD16−; slika 1D i dopunska slika 2B–D). Kako bismo podržali naše nalaze, dodatno smo pokazali da pročišćeni neutrofili mogu učinkovito fagocitirati sporozoite P. falciparum opsonizirane antitijelima (slika 1E). Smanjenje CSP-specifičnih protutijela, prethodnom inkubacijom s rekombinantnim CSP-om, smanjilo je fagocitozu sporozoita za 70 posto u usporedbi s neosiromašenim uzorkom (Slika 1F i Dodatna slika 3). Koristili smo dodatni pristup za dobivanje dokaza o važnosti CSP-a kao mete stečenih funkcionalnih protutijela u ljudskom imunitetu testiranjem mAb (MGG4) izoliranog iz pojedinca izloženog ponovljenim infekcijama sporozoitima34. mAb je inducirao znatnu fagocitozu sporozoita, dok je bilo malo fagocitoze s neimunim ljudskim protutijelima ili korištenjem anti-CSP MAb (2A10) koje je mutirano u Fc regiji da inhibira Fc R interakcije (Slika 1G).

Definiranje Fc receptora uključenih u opsoničnu fagocitozu sporozoita.

Opsonizirali smo cijele sporozoite P. falciparum i CSP zrnca s protutijelima iz kenijskih odraslih osoba i izmjerili opsoničnu fagocitozu neutrofila u prisutnosti specifičnih Fc R-blokirajućih protutijela. Neutrofili su imali značajno nižu opsoničnu fagocitozu i CSP kuglica i sporozoita P. falciparum u prisutnosti blokatora Fc RIIa ili Fc RIII (Slika 2A, B i Dodatna slika 4A), što sugerira da su oba receptora bila važna.

Značajno je da je blokada Fc RIII bila najučinkovitija u inhibiciji fagocitoze sporozoita P. falciparum ili CSP kuglica, sa slabijim učinkom blokade Fc RIIa. Blokiranje Fc RI nije utjecalo na opsoničnu fagocitozu neutrofila. Titracija koncentracije blokirajućih antitijela sugerira da smo postigli maksimalni učinak za blokadu svakog Fc R (dodatna slika 4B).

Stoga smo kombinirali Fc RIIa i Fc RIII blokirajuća protutijela i otkrili da to daje veću inhibiciju fagocitoze od upotrebe bilo kojeg od blokirajućih protutijela, dodatno sugerirajući važnost oba Fc R tipa za optimalnu fagocitozu (Slika 2B). Ovi rezultati su u skladu s ekspresijom Fc Rs na neutrofilima u mirovanju, koji pretežno eksprimiraju Fc RIIa i Fc RIIIa/b, ali im nedostaje Fc RI35 (dopunska slika 2C). Važnost Fc RIII u posredovanju opsonične fagocitoze CSP kuglica i sporozoita može djelomično objasniti relativno nisku aktivnost monocita budući da glavne podskupine monocita izražavaju malo Fc RIIIa na površini u neaktiviranom stanju i ne izražavaju Fc RIIIb35. THP-1 stanice naširoko se koriste kao model fagocitoze monocita i visoko eksprimiraju Fc RI36, koji je vezan monomernim IgG (dok se Fc RIIa i Fc RIII eksprimirani neutrofilima vežu samo na imunološke komplekse).

Sukladno tome, otkrili smo da je opsoničnu fagocitozu stanica THP-1 u standardnim uvjetima (koji sadrže samo 10 posto FCS-a i bez ljudskog seruma) snažno inhibirao blokator Fc RI s ograničenom inhibicijom blokatorom Fc RIIa, a nijedna s Fc Blokiranje RIII (slika 2C). To je sugeriralo da je interakcija između IgG i Fc RI bila posebno važna za THP-1 stanice, što je suprotno rezultatima viđenim kod neutrofila. Stoga smo modificirali standardni THP-1 test kako bismo ga učinili fiziološki relevantnijim uključivanjem ljudskog seruma u testni medij.

U prisutnosti dodatnih 2,5 posto ljudskog seruma (kao što se koristi u testovima cijelih leukocita i neutrofila), bilo je mnogo manje opsonične fagocitoze (Slika 2D), vjerojatno zbog vezanja neimunog monomernog humanog IgG prisutnog u ljudskom serumu u Fc RI. Ovi nalazi mogu dodatno objasniti nisku fagocitnu aktivnost primarnih monocita uočenu u testovima cijelih leukocita u prisutnosti ljudskog seruma; goveđi IgG (prisutan u FCS) ne veže ljudski Fc RI37.

S obzirom na očitu važnost Fc RIII, dalje smo mjerili funkciju antitijela na CSP među odraslim Kenijcima u ADCC testovima, budući da Fc RIII interakcije igraju ključnu ulogu u posredovanju ADCC putem NK stanica. Testirali smo odabir uzoraka iz kenijske odrasle kohorte (Kanyawegi kohorta) kako bismo predstavili osobe s visokim, srednjim i niskim odgovorom (n=31) u analizi pomoću ADCC reporterske stanične linije koja eksprimira samo Fc RIIIa. Prirodno stečena antitijela među odraslim Kenijcima imala su značajnu aktivnost, dok antitijela iz Melbourne malarije naivnih donora nisu (slika 2E, F). Ovi nalazi sugeriraju da antitijela na CSP također mogu pospješiti ADCC aktivnost uključivanjem Fc RIIIa. Zatim smo testirali aktivnost primarnih NK stanica u svježoj krvi koristeći utvrđeni test degranulacije 38. Inkubacija NK stanica s CSP kuglicama opsoniziranim kenijskim antitijelima odraslih dovodi do degranulacije primarnih NK stanica (Slika 2G, H). Aktivnost je varirala među testiranim uzorcima i značajno korelirala s vezanjem Fc RIII (r=0.538, P=0.002, slika 2H), ali je slabo korelirala s IgG na CSP (r {{10} }.127, P=0.489, n=31).

Izravno vezanje Fc RIII i Fc RIIa pomoću kompleksa antitijelo-antigen.

Razvili smo testove vezanja Fc R koristeći Fc RIIa i Fc RIII koji su eksprimirani i pročišćeni kao dimeri tako da mogu djelovati u interakciji s kompleksima antigen-antitijelo39. Odrasli u Keniji imali su visoku prevalenciju i veličinu protutijela na CSP koja su mogla djelovati s dimerima Fc RIIa i Fc RIII (slika 3A). Sveukupno, 67,3 i 61,5 posto uzoraka (n=104) smatralo se pozitivnim na vezanje Fc RIIa i Fc RIII. Dok je vezanje oba Fc Rs imalo jaku, pozitivnu korelaciju među uzorcima (r=0.71, P< 0.0001, n = 104) (Fig. 3B), some individual samples demonstrated high binding to one FcγR and low binding to the other. Furthermore, the ability of antibodies to CSP to promote direct binding of FcγRIII was significantly correlated with ADCC tested by the ADCC reporter cell line (r = 0.405, P = 0.022, Fig. 2F) and primary NK cells (r = 0.538, P = 0.002, Fig. 2H). FcγRs occur in populations as different alleles40. 

Stoga smo testirali različite alele Fc RIIa (R131, H131) i Fc RIII (F158, V158) za vezanje posredovano IgG-om39. Objavljeni podaci pokazuju da su ti aleli prevladavajući u našoj ispitivanoj populaciji41. Protutijela na CSP učinkovito su pospješila vezanje oba alela Fc RIIa i Fc RIII. Postojala je visoka korelacija vezanja Fc R između različitih alela; rho=0.8371 za Fc RIIa, i rho=0.78 za Fc RIII (Slika 3C, D).

Regije CSP-a ciljane funkcionalnim antitijelima.

Naši raniji podaci pokazuju da je CSP bio značajna meta ljudskih protutijela koja potiču fagocitozu (Slika 1F, G). Stoga smo zatim istražili različite regije CSP-a kao mete funkcionalnih protutijela kod pojedinaca izloženih malariji koristeći tri konstrukta CSP-a: (i) sintetski peptid koji predstavlja NT regiju (koja nije uključena u RTS, S cjepivo), (ii ) sintetski peptid koji predstavlja regiju ponavljanja (NANP ponavljanja), (iii) rekombinantni protein koji predstavlja regiju CT. Svaki konstrukt je zasebno obložen na fluorescentne kuglice (u zasićenim koncentracijama) i opsoniziran s skupom kenijskog seruma. Protutijela su učinkovito pospješila fagocitozu neutrofila kuglica obloženih svakim konstruktom (slika 4A).

Naknadno smo procijenili prirodno stečena protutijela na regije CSP-a za njihovu sposobnost promicanja angažmana Fc RIIa i Fc RIII. Ljudska antitijela vezala su svaku CSP regiju dovoljnom gustoćom da pospješuju vezanje Fc RIIa i Fc RIII (Slika 4B). Kako je ukupna razina vezanja IgG varirala među različitim CSP konstruktima (dodatna slika 5), ​​standardizirali smo vezanje Fc RIIa i Fc RIII u odnosu na razinu reaktivnosti IgG (nazvanu učinkovitost vezanja Fc R). Naši podaci sugeriraju da su antitijela na NT regiju imala veći potencijal za uključivanje Fc Rs od centralnog ponavljanja i CT regija (aktivnost je bila značajno veća za NT u odnosu na CT ili NANP regije, P < 0.001 za svaku usporedbu) .

Nadalje smo procijenili značaj različitih regija kao ciljeva funkcionalnih antitijela koristeći antitijela stvorena protiv specifičnih regija i cijelih sporozoita u testovima fagocitoze. Prvo smo potvrdili da zečja anti-CSP protutijela mogu pospješiti fagocitozu sporozoita. Sporozoiti P. falciparum opsonizirani ovim protutijelima dali su visok indeks fagocitoze (40,5 posto) u usporedbi s kontrolom (slika 4C). Naknadno smo ustanovili da poznato mAb protiv središnje NANPrepeat regije P. falciparum CSP (mAb 2H8, podrazred mišjeg IgG2a)33 potiče značajnu fagocitozu (17,4 posto, slika 4D) koja je bila veća nego što je viđeno s negativnom kontrolom mAb 3D11 koja cilja na CSP bakterije P. berghei koja nema epitop NANPrepeat (slika 4D). Regija NANP ponavljanja kodira imunodominantni epitop, dok se mnogo manje zna o značaju NT i CT regija kao meta antitijela.

Kako bismo dodatno definirali ulogu protutijela u CT i NT regijama i nadopunili podatke korištenjem ljudskih protutijela, generirali smo zečja poliklonska protutijela za svaku regiju (Dopunska slika 6) i upotrijebili ta protutijela za opsonizaciju transgenog PfCSPP-a. berghei sporozoiti za fagocitozu pomoću neutrofila. Poliklonska antitijela kunića na CT i NT regije učinkovito su pospješila fagocitozu PfCSP-P. berghei sporozoiti (slika 4E). Budući da se koncentracija IgG u CT i NT iz seruma cijepljenih kunića razlikuje (dopunska slika 6), procijenili smo učinkovitost fagocitoze i protutijela, u odnosu na razine IgG (izračunato kao aktivnost fagocitoze podijeljena s reaktivnošću IgG utvrđenom ELISA testom). Ovo je pokazalo da su protutijela na N-terminalnu regiju imala značajno veću učinkovitost fagocitoze u usporedbi s CT protutijelima.

Budući da su protutijela na NT regiju bila vrlo učinkovita u aktiviranju Fc Rs i promicanju opsonične fagocitoze, izvršili smo mapiranje epitopa zečjih poliklonskih protutijela protiv NT regije koristeći preklapajući peptidni niz (Slika 4F i Dodatna slika 6D). Peptidni niz bio je prikladan za mapiranje epitopa jer se predviđa da je NT regija nestrukturirana i ne sadrži cisteine ​​(PlasmoDB, https://plasmodb.org/plasmo/app/ record/gene/PF3D7_0304600). Antitijela su bila reaktivna s peptidima koji pokrivaju 21-aa regiju (DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ) koja je blizu spoja između N-terminalne regije i NANP/NVPD regije ponavljanja.

Stjecanje antitijela koja promiču Fc R interakcije i opsoničnu fagocitozu prirodnom izloženošću.

Analizirali smo uzorke seruma prikupljene od skupine male djece i odraslih izloženih malariji koji žive u zapadnoj Keniji u regiji s visokim intenzitetom prijenosa malarije (iz regije Chulaimbo, dodatna tablica 1). U ovom okruženju, većina morbiditeta i mortaliteta od malarije javlja se kod djece u dobi<5 years. 

Nasuprot tome, odrasli imaju značajan imunitet, što se vidi izostankom razvoja simptomatske epizode malarije, iako se može pojaviti asimptomatska parazitemija42. Mjerili smo sposobnost CSP-specifičnih protutijela za interakciju s Fc RIIa i Fc RIII, kao i za promicanje opsonične fagocitoze CSP kuglica od strane neutrofila (Slika 5A-D). Ukupna prevalencija protutijela sa svakom funkcionalnom aktivnošću bila je fagocitoza neutrofila 16 posto (95 posto CI, 9,19, 26,38 posto), vezanje Fc RIIa 20 posto (95 posto CI, 12,28, 30,84 posto) i vezanje Fc RIII 14,7 posto (95 posto CI, 8,19, 24,85 posto). Razina reaktivnosti IgG na CSP, vezanje Fc R i opsoničnu fagocitozu neutrofila bila je niska među malom djecom i značajno se povećavala s dobi.

Nasuprot tome, odrasli s cjeloživotnom izloženošću stekli su znatno više funkcionalnih protutijela u usporedbi s djecom. Također smo procijenili antitijela koja potiču fagocitozu merozoita u krvnom stadiju, koji su imali znatno veću prevalenciju i razinu među malom djecom u usporedbi s funkcionalnim antitijelima na CSP (Slika 5B, E, F). Ovo podupire koncept da se prirodno stečena imunost na sporozoite stječe mnogo sporije i da je za razvoj potrebna znatno veća izloženost, u usporedbi s imunošću u krvnom stadiju. Istraživali smo je li viša funkcionalna aktivnost kod odraslih rezultat samo veće koncentracije CSP-specifičnog IgG ili također odražava veći funkcionalni potencijal antitijela kod odraslih. Analizirali smo funkcionalnu aktivnost antitijela u odnosu na IgG reaktivnost protiv CSP; da bismo to učinili, isključili smo pojedince s vrlo niskim IgG prema CSP-u (ispod medijana OD od 0.140), te smo izračunali funkcionalnu aktivnost u odnosu na razinu IgG za svakog pojedinca.

Zanimljivo, ovo je pokazalo da je relativna učinkovitost fagocitoze bila značajno veća u odraslih u usporedbi s djecom (Slika 5G) (Mann-Whitneyev test, P=0.022). Nadalje, postojala je značajna korelacija između dobi i učinkovitosti vezanja Fc R (r=0.354, P=0.031 za vezanje Fc RIIa i r=0.572 za vezanje Fc RIII, P <0,001).

Opsonična fagocitoza neutrofila u korelaciji s Fc R vezanjem i citofilnim IgG podklasama

Proširili smo našu analizu na veću kohortu imunih odraslih osoba u zapadnoj Keniji (kohorta Kanyawegi, n=104) koji su doživotno bili izloženi malariji u regiji s visokim intenzitetom prijenosa malarije. Zaključili smo da će veliki dio tih odraslih osoba vjerojatno imati funkcionalna antitijela na CSP, što olakšava analizu faktora antitijela i specifičnosti koje određuju aktivnost funkcionalne opsonične fagocitoze. Doista, mnogi uzorci su pokazali značajnu fagocitozu i aktivnost vezanja Fc R. Prevalencija protutijela sa svakom funkcionalnom aktivnošću bila je neutrofilna fagocitoza 47,1 posto (95 posto CI, 37,6, 56,9 posto), vezanje Fc RIIa 67,3 posto (95 posto CI, 57,6, 75,8 posto) i vezanje Fc RIII 61,5 posto (95 posto CI , 51,7, 70,5 posto ).

Opsonična fagocitoza neutrofila bila je u značajnoj korelaciji s vezanjem Fc RIIa (r {{0}}.50, P < 0.001) i Fc RIII vezanje (r=0.43, P < 0,001) (Slika 6A). Multivarijatna regresijska analiza sugerira da je Fc RIII primarni čimbenik povezan s opsoničnom fagocitozom neutrofila (koeficijent regresije=10.15, P <0,001, Tablica 1), dok je Fc RIIa bio manje važan. Prethodno smo izvijestili da su antitijela na CSP u ovoj kohorti odraslih pretežno IgG1 i IgG3, s nižim razinama IgG2 i vrlo malo IgG433. IgG1 i IgG3 su glavne podklase koje stupaju u interakciju s Fc RIIa i Fc RIII za promicanje fagocitoze, a IgG2 ima slabu aktivnost. Među odraslim Kenijcima, fagocitoza neutrofila bila je u značajnoj pozitivnoj korelaciji s IgG1 (r=0.32, P < 0,001), IgG2 (r=0.26, P=0.007) i više snažno s IgG3 (r=0.50, P < 0,001) (Slika 6B, C, Dodatna slika 7 i Dodatna tablica 2).

Nije primijećena korelacija s IgG4 (r=0.09, P = 0.365), iako su razine IgG4 bile niske. U multivarijatnoj regresiji, IgG3 je ostao značajno povezan s fagocitozom neutrofila, što sugerira da je glavni posrednik ove aktivnosti (dodatna tablica 3). Dodatno, vezanje i Fc RIIa i Fc RIII bilo je u značajnoj korelaciji s ukupnim razinama IgG i IgG potklasa, prvenstveno IgG1 i IgG3 (dodatne tablice 2 i 3). Sve u svemu, uzorci koji su klasificirani kao oni koji imaju visoku aktivnost fagocitoze (definirano kao da su iznad medijana) imali su značajno više razine vezanja Fc RIIa i Fc RIII i IgG3, te su imali značajno više razine IgG za sve regije CSP-a, u usporedbi s uzorcima s niskom fagocitozom aktivnost (sl. 6D, E).

Slična zapažanja pronađena su među Chulaimbo kohortom djece i odraslih. Opsonična fagocitoza značajno je korelirala s vezanjem Fc R, te IgG1 i IgG3, s tim da je korelacija jača za Fc RIII i IgG3 (dodatne tablice 4 i 5). Primijenili smo ove testove u kliničkom ispitivanju faze 1/2a RTS, S cjepiva. Ovo je pokazalo da su antitijela koja potiču opsoničnu fagocitozu neutrofila i vezanje Fc RIII i Fc RIIa bila veća među zaštićenim nego nezaštićenim subjektima43.

Rasprava

Pružamo rezultate koji definiraju mehanizme i ciljeve imunosti posredovane antitijelima na sporozoite kroz interakcije sa specifičnim Fc Rs izraženim na imunološkim stanicama. Naša otkrića podupiru ključnu ulogu neutrofila u uklanjanju sporozoita iz krvi, posredovano interakcijama Fc RIIa i Fc RIII s IgG1 i IgG3 koji ciljaju glavni antigen sporozoita, CSP, uz dodatne doprinose monocita (klasična podskupina) i NK stanica. Koristeći intaktne sporozoite i zrnca obložena antigenom, ustanovili smo da fagocitozu, u punoj krvi, pretežno vrše neutrofili, što je u suprotnosti s niskom razinom aktivnosti uočenom kod monocita. Definirali smo ključne mehanizme uključene u blokiranje specifičnih Fc Rs na površini stanica i korištenje Fc R dimera kao sondi za vezanje kompleksa antigen-antitijelo.

Time je identificirana važnost Fc RIIa i Fc RIII, a podaci posebno ukazuju na važnost Fc RIII. Definirali smo mete protutijela ovog funkcionalnog mehanizma korištenjem protutijela na različite regije CSP-a, različite regije CSP-a presvučene kuglicama i himerne P. berghei sporozoite koji eksprimiraju P. falciparum CSP. Ustanovili smo da je CSP glavna meta ovih funkcionalnih protutijela i da sva tri područja CSP-a mogu biti ciljana protutijelima za uključivanje Fc R i promicanje fagocitoze.

Konkretno, protutijela na NT regiju imala su značajnu aktivnost u nizu različitih testova, pružajući potencijalno vodstvo za razvoj cjepiva budući da NT regija nije uključena u cjepiva RTS, S (sada u studijama provedbe) ili R21 temeljena na CSP-u. (u fazi 2 ispitivanja). Nadalje, ustanovili smo da su prirodno stečena protutijela sposobna potaknuti opsoničnu fagocitozu sporozoita. Stjecanje funkcionalnih protutijela ovisilo je o dobi, a više razine aktivnosti opsonične fagocitoze i vezanja Fc RIIa i Fc RIII uočene su samo kod uzoraka odraslih, ali ne i male djece. Funkcionalna aktivnost u korelaciji s podklasama IgG1 i IgG3.

Veća aktivnost fagocitoze neutrofila, ali vrlo niska razina aktivnosti monocita, može se povezati s prisutnošću i upotrebom različitih Fc Rs; neutrofili su imali veću stopu fagocitoze, što se nije jednostavno objasnilo većom zastupljenošću neutrofila u usporedbi s monocitima. Zanimljivo je da je blokiranje Fc RIIa ili Fc RIIIa/b inhibiralo aktivnost fagocitoze od strane neutrofila, sugerirajući da su oba receptora potrebna za fagocitozu, što je potkrijepljeno postizanjem veće inhibicije s blokirajućim antitijelima na Fc RIIa i Fc RIII korištenim u kombinaciji. Blokiranje Fc RI nije utjecalo na fagocitozu neutrofila. Nekoliko opažanja sugeriralo je veću važnost Fc RIII; općenito je postojala veća inhibicija fagocitoze sporozoita blokadom Fc RIII, a vezanje Fc RIII pomoću antitijela bilo je više korelirano s fagocitozom nego Fc RIIa u multivarijatnoj analizi.

Fc RIIIb, koji je usidren za GPI, najobilniji je Fc RIII tip eksprimiran na neutrofilima, ali nedavne studije su izvijestile da neutrofili eksprimiraju i Fc RIIIa30, koji ima transmembransku i citoplazmatsku domenu za unutarstaničnu signalizaciju. Za fagocitozu, unutarstanična signalizacija može se dogoditi putem Fc RIIIa ili Fc RIIa, pri čemu je vezanje na Fc RIIIb također važno, kao što pokazuju naši nalazi. Ako Fc RIII i Fc RIIa djeluju kooperativno u fagocitozi, to može objasniti zašto je postojala ograničena aktivnost Fc RIIa u fagocitozi monocita. NK stanice izražavaju Fc RIIIa i ustanovili smo da antitijela na CSP mogu pospješiti aktivaciju NK kroz interakciju s Fc RIIIa. To može dovesti do ubijanja sporozoita kao i oslobađanja proupalnih citokina44.

Međutim, NK stanice čine samo 1-5 posto leukocita u krvi što sugerira da bi imale manje istaknutu ulogu u imunitetu protiv sporozoita od neutrofila, koji čine 50-70 posto leukocita. Sporozoiti su također izloženi dermalnim makrofagima i Kupfferovim stanicama jetre, što bi moglo uključivati ​​dodatne mehanizme Fc R-posredovanog čišćenja i opravdati istraživanje u budućim studijama, ali relativna učestalost ovih stanica i njihova ekspresija Fc Rs razlikuje se od fagocita u krvi .

Postojeće studije opsonične fagocitoze u malariji posredovane antitijelima uglavnom su koristile staničnu liniju THP-1 kao model, koristeći standardne uvjete s FCS (ali ne uključujući ljudski serum). Pod ovim uvjetima, otkrili smo da je fagocitoza učinkovito inhibirana blokadom Fc RI, ali je minimalna inhibicija viđena kod blokiranja Fc RIIa ili Fc RIII. Nedavna studija izvijestila je da opsonična fagocitoza od strane THP-1 stanica nije bila u korelaciji sa zaštitom u RTS, S fazi I/IIa ispitivanja kod odraslih osoba koje nisu imale malariju45. Pokazali smo da nespecifični IgG u ljudskom serumu također može smanjiti aktivnost fagocitoze THP-1 stanica jer su Fc RI interakcije inhibirane monomernim IgG prisutnim u ljudskoj plazmi, dok monomerni goveđi IgG ne veže ljudski Fc RI. Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da THP-1 stanice nisu idealan model za proučavanje opsonične fagocitoze protiv sporozoita.

Ustanovili smo da sve tri regije CSP-a mogu biti ciljane antitijelima koja angažiraju Fc RIIa i Fc RIII za promicanje fagocitoze sporozoita od strane neutrofila, pripisujući tako antitijelima funkcije koje prethodno nisu bile prijavljene. Važno je napomenuti da je postojala značajna aktivnost protutijela na NT regiju kao što se vidi u testovima fagocitoze korištenjem ljudskih protutijela s kuglicama obloženim antigenima, fagocitoze sporozoita zečjim protutijelima podignutim na različite regije i Fc R vezanja ljudskih protutijela. Ovi nalazi upućuju na to da veći fokus na NT regiju u dizajnu cjepiva može biti vrijedan, uz uključivanje središnje regije ponavljanja i CT regije. Trenutno vodeća cjepiva ne uključuju NT regiju3,46. Mapirali smo epitope protutijela na 21-aa regiju koja je blizu spoja između NT i središnjih ponavljajućih regija, ali ne uključuje nedavno opisani spojni epitop34 i razlikuje se od epitopa regije I, koja je mjesto za Cijepanje N-terminala u vrijeme invazije hepatocita47,48.

Naša opažanja da protutijela stečena izlaganjem malariji mogu pospješiti Fc R-posredovanu fagocitozu neutrofila dalje podržavaju koncept da je to mehanizam koji se javlja in vivo među pojedincima koji razviju visoku razinu imuniteta. U okruženju visokog prijenosa malarije u Keniji, ova funkcionalna antitijela su vrlo niska među malom djecom koja su najviše izložena riziku od infekcije i teške malarije, ali se javljaju kod odraslih. Prethodne studije u ovoj populaciji otkrile su da su visoke razine protutijela na CSP među odraslima povezane sa smanjenim rizikom od infekcije među odraslima49. Nasuprot tome, skupina većinom djece nije pronašla povezanost u Maliju, gdje je intenzitet prijenosa malarije bio manji od naše ispitivane populacije50. Zanimljivo je da su relativne razine aktivnosti vezanja sa svakim Fc R značajno varirale među pojedincima, što će vjerojatno utjecati na aktivnost fagocitoze. Na varijacije u specifičnom vezanju Fc R utjecat će profili podrazreda IgG, epitopi na koje ciljaju protutijela i glikozilacija IgG22. IgG1 i IgG3 prevladavaju među stečenim IgG potklasama i koreliraju s aktivnošću vezanja Fc R.

U ovoj smo studiji prilagodili upotrebu mikrosfera obloženih antigenom za proučavanje aktivnosti opsonične fagocitoze protutijela na CSP, ključnu imunološku metu sporozoita P. falciparum. Prednost ovog pristupa je u tome što nadilazi izazove stvaranja velikih količina sporozoita za imunološke testove, što je teško postići za velike populacijske studije i klinička ispitivanja. Razina opsonične fagocitoze izmjerena pomoću kuglica obloženih CSP-om bila je u visokoj korelaciji s onom izmjerenom korištenjem intaktnih sporozoita. Ova nam je platforma također omogućila seciranje funkcionalnih odgovora protutijela na svaku regiju CSP-a. Također smo potvrdili fagocitozu korištenjem kriokonzerviranih sporozoita (preživljavanje > 85 posto 51) i svježe seciranih sporozoita.

Prethodne studije su pokazale da antitijela na sporozoite mogu inhibirati pokretljivost sporozoita, prolazak stanica i invaziju hepatocita kao potencijalne imunološke mehanizme. Međutim, trenutačno ne postoje dosljedni dokazi koji pokazuju korelaciju ovih mehanizama sa zaštitom od infekcije Plasmodiumom u kliničkim studijama3. U modelima pasivne imunizacije kod životinja, visoke razine IgG na CSP mogu zaštititi od eksperimentalne infekcije3,4. Međutim, slične visoke razine zaštite, održane tijekom vremena, još nisu postignute antitijelima izazvanim cjepivom u kliničkim ispitivanjima52-56. RTS, S izaziva vrlo visoke razine CSP IgG, ali pruža samo skromnu zaštitu53,56, što sugerira da su potrebne druge strategije za stvaranje protutijela koja imaju veću funkcionalnu zaštitnu aktivnost3,4. Naši podaci pružaju uvid u uglavnom nedovoljno proučen imunološki mehanizam protutijela u fagocitnom uklanjanju sporozoita i sugeriraju da bi korištenje mehanizama posredovanih Fc R-om moglo biti strategija za stvaranje snažnijeg imuniteta za više razine zaštite. To se može postići strategijama cjepiva koje optimiziraju odgovore podklase IgG, smanjuju IgM koji može inhibirati Fc R interakcije i poboljšavaju ciljanje specifičnih funkcionalnih epitopa. Ova poboljšanja mogu se postići upotrebom specifičnih adjuvanata cjepiva i dizajnom imunogena. Fc R interakcije s IgG vezanim na antigene također mogu biti pod utjecajem gustoće epitopa i prostorne orijentacije i položaja epitopa57,58. Pristupi strukturne biologije mogu biti vrijedni za razumijevanje ovoga i informiranje o dizajnu cjepiva. Također je moguće da različite regije CSP-a posreduju u imunitetu kroz različite imunološke mehanizme.

Ovo je pokazano za hemaglutinin influence, pri čemu su mehanizmi posredovani Fc R važni za antitijela na očuvanu regiju peteljke, ali su manje važni za antitijela specifična za soj na regiju glave18,21.

Buduće studije koje istražuju indukciju ovih funkcionalnih antitijela i njihovu korelaciju sa zaštitom opravdane su u ispitivanjima faze II i faze III RTS, S i drugih cjepiva koja se temelje na CSP. Proveli smo početnu studiju u fazi I/IIa ispitivanja RTS-a, S56. Time je utvrđeno da cijepljenje RTS, S doista inducira antitijela na CSP koja potiču vezanje Fc RIIa i Fc RIII, kao i fagocitozu neutrofila. Važno je da su ove funkcionalne aktivnosti bile značajno veće među subjektima koji su bili zaštićeni od infekcije malarijom u odnosu na one koji su razvili infekciju43. Dok je CSP meta stečenog ljudskog imuniteta, uključujući funkcionalna protutijela, trenutno postoji ograničeno razumijevanje mogućih razlika u prirodno stečenom imunitetu i imunitetu izazvanom cjepivom protiv sporozoita. Daljnja istraživanja ovih razlika mogu otkriti važne uvide koji će poslužiti za razvoj cjepiva.

Ukratko, naše su studije definirale ključne mehanizme i mete Fc R-posredovanog imuniteta protiv sporozoita u krvi. Naši nalazi ukazuju na glavnu ulogu neutrofila u fagocitnom klirensu sporozoita, definirane su važne uloge za Fc RIIa i Fc RIII, te utvrđen CSP kao ključna meta za ovu funkcionalnu aktivnost. Monociti također pridonose fagocitozi, ali imaju nižu aktivnost, a protutijela također mogu pospješiti ADCC aktivnost NK stanica kroz angažman Fc RIIIa. Razumijevanje i definiranje mehanizama koji posreduju u imunitetu ključno je za omogućavanje razvoja učinkovitijih cjepiva. Buduće studije trebale bi istražiti koliko učinkovito trenutna cjepiva u kliničkim ispitivanjima stvaraju antitijela s ovim funkcionalnim aktivnostima. Korištenje ovog znanja u razvoju cjepiva može biti učinkovita strategija za stvaranje snažnog imunološkog odgovora koji pruža višu razinu zaštite od malarije.

Metode

Proučavajte populacije i etičku izjavu.

Plazma od zdravih, asimptomatskih odraslih osoba izloženih malariji koji žive u podokrugu Kanyawegi okruga Kisumu, Kenija (n=104, dobni raspon 18–79; 26,9 posto muškaraca) prikupljena je u kolovozu 2007. (kohorta Kanyawegi)59; niti jedan sudionik nije imao simptome malarije, a 46,15 posto ima asimptomatsku P. falciparum parazitemiju (otkrivenu mikroskopijom). Plazma zdrave, asimptomatske male djece i odraslih koji žive u podokrugu Chulaimbo okruga Kisumu, Kenija (n=75, dobni raspon 0,3–5,9 godina za djecu, dobni raspon 19,6–69,2 godina za odrasle; 55 posto žena) bila je prikupljeno u veljači – ožujku 2007. (kohorta Chulaimbo)42; detalji kohorte sažeti su u dodatnoj tablici 1. Intenzitet prijenosa bio je relativno visok u vrijeme prikupljanja krvi (prevalencija asimptomatske parazitemije u djece manje od ili jednaka 10 godina bila je 70-80 posto)60. Krv je prikupljena od zdravih odraslih muškaraca i žena za korištenje u testovima cijelih leukocita, neutrofila, monocita i NK.

Etičko odobrenje dobiveno je od Alfred Hospital Human Research and Ethics Committee (protokol 385-18), Institutional Review Board for Human Investigation pri Sveučilišnim bolnicama u Clevelandu za Sveučilište Case Western Reserve, SAD (protokol 02-04-04) i Povjerenstvo za etičku reviziju pri Kenijskom medicinskom istraživačkom institutu, Kenija (protokol SSC867). Pisani informirani pristanak dobiven je od svih sudionika istraživanja ili njihovih roditelja ili zakonskih skrbnika.

Antigeni.

Svi antigeni korišteni u ovoj studiji temeljeni su na 3D7 referentnoj sekvenci P. falciparum CSP (ID gena PF3D7_0304600; www.plasmodb.org). Rekombinantni CSP pune duljine kupljen je od Sanaria (Sanaria, Rockville, SAD).

Protein je eksprimiran u Pichia pastoris počevši od aminokiselinskog ostatka 50 i sadrži (NANP)22 ponavljanja i (NVPD)4 ponavljanja. C-terminalna regija CSP (CT) i fuzija N-terminalne regije i C-terminalne regije CSP (N plus C) generirani su kao rekombinantni proteini pomoću HEK293F stanica (kupljenih od Invitrogena, Australija). N-terminalna regija CSP-a (aminokiselina 19-104, NT) generirana je kao sintetski peptidi, a središnja regija ponavljanja CSP-a (NANP) također je generirana kao sintetski peptidi (NANP×15) od strane LifeTeina (LifeTein, NJ, SAD).

Stvaranje antitijela na različite CSP proteine.

izvela ustanova za antitijela Instituta Walter Eliza Hall; odobrenje je dalo Povjerenstvo za etiku životinja Instituta Walter i Eliza Hall (ref: 2020.019, 2014.009). Ukratko, zečevi (n=2) su cijepljeni jednim od sljedećih antigena: CSP pune duljine, N plus C rekombinantni protein i NT peptid. Svaki je kunić primio tri doze antigena (200 µg/doza) zajedno s Freudovim adjuvansom 0. dan, 28. dan i 56. dan. Serumi zeca su sakupljeni nakon trećeg cijepljenja 68. dana, a zečji IgG pročišćen je proteinom A - pozitivna selekcija. Zečji anti-N plus C IgG su inicijalno testirani i pokazalo se da pretežno prepoznaju C-terminalnu regiju CSP-a, a ne N-terminalnu regiju (dopunska slika 6A). Potvrđeno je da zečji anti-NT IgG prepoznaje N-terminalnu regiju CSP-a (dodatna slika 6B). I NT i CT protutijela reagirala su s CSP-om pune duljine (dodatna slika 6C). Monoklonsko protutijelo (mAb) MGG434, koje je izolirano iz pojedinca nakon ponovljene infekcije atenuiranim sporozoitima, eksprimirano je i pročišćeno kao rekombinantno IgG1 protutijelo u HEK293 stanicama korištenjem utvrđenih pristupa. mAb je testiran u odnosu na rekombinantni CSP da se potvrdi specifičnost. Anti-CSP mAb 2A1061 eksprimirano je s LALA mutacijama u Fc regiji62 da inhibira Fc R interakcije kao kontrolno protutijelo.

Izolacija PBMC, neutrofila i cijelih leukocita iz periferne krvi.

Mononuklearne stanice periferne krvi (PBMC) i neutrofili izolirani su iz periferne krvi korištenjem prethodno utvrđenih metoda63,64. Ukratko, periferna krv zdravih davatelja odvojena je pomoću Ficoll gradijent centrifugiranja. Buffyjevi slojevi, koji sadrže PBMC, i RBC pelet koji sadrži neutrofile, odvojeno su prikupljeni. Za PBMC izolaciju, stanice sakupljene iz Buffy sloja isprane su četiri puta s PBS-1 postotkom NCS na 4 stupnja. PBMC su naknadno resuspendirani u RPMI1640-10 posto fetalnog goveđeg seruma (FCS) i držani na ledu. Neutrofili su obogaćeni segmentacijom dekstrana iz taloga eritrocita nakon centrifugiranja u gradijent Ficoll, nakon čega je uslijedila hipotonična liza63.

Cijeli leukociti izolirani su iz pune krvi početnim obogaćivanjem segmentacijom dekstrana nakon čega je uslijedila hipotonična liza. Izolirani neutrofili i cijeli leukociti podešeni su na 5 × 105 neutrofila/ml ili 5 × 106 fagocita (monocita i neutrofila)/ml i zatim resuspendirani u RPMI1640 dopunjenom s 10 posto FCS i 2,5 posto toplinski inaktiviranog ljudskog seruma i držani na ledu. Stanice su fenotipizirane za ekspresiju Fc R korištenjem antitijela na Fc RI (klon 10.1 BD Bioscience, 1:50), Fc RIIa (klon 8.26, BD Bioscience, 1:25) i Fc RIII (klon 3G8 BD Bioscience, 1:50) . Antitijela na CD14 (klon M5E2, BD Bioscience, 1:20) također su korištena za određivanje podskupa monocita.

Održavanje THP-1 ćelija.

Stanice THP{{0}} promonocitne stanične linije (izvor iz ATCC) održavane su u RPMI-1640 s 0.002 mol/L L-glutamina, 0.01 mol/L HEPES-a i 10 posto fetalnog telećeg seruma (FCS). Gustoća stanica pomno je praćena i održavana između 1 × 105 i 1 × 106 stanica/ml. Stanice su pasirane svakih 6 dana ili kada se gustoća stanica približi 1 × 106 stanica/ml.

Kultura i izolacija sporozoita P. berghei.

Komarci Anopheles stephensi hranjeni su Swiss Webster miševima zaraženim himernim CSP-om koji eksprimira parazitsku liniju P. berghei ANKA12. Žlijezde slinovnice su secirane 18-22 dana nakon infektivnog krvnog obroka i homogenizirane u PBS-u. Sporozoiti su propušteni kroz 70-µm cjedilo za tkivo (Falcon) i izbrojani pomoću hemocitometra.

Kultura i izolacija merozoita P. falciparum.

Linija D10 P. falciparum održavana je u RPMI-HEPES-u s dodatkom 0.5 posto Albumax (Life Technologies) i 0,18 posto NaHCO3. Kulture su održavane ispod 10 posto parazitemije i sinkronizirane tretmanom sorbitolom. Merozoiti su izolirani korištenjem prethodno objavljenih metoda 32. Ukratko, stadij shizonta inficiranih eritrocita obogaćen je magnetskim pročišćavanjem i nastavljen je uzgoj u mediju s dodatkom transepoksisukcinil-L-leucilamido(4-gvanidino) butana (E64, Sigma -Aldrich) 8 h prije prolaska zrelih šizonta kroz filtar od 1.2-µm za oslobađanje merozoita. Merozoiti su podešeni na 5 × 107/ml za ispitivanje opsonične fagocitoze ili 1 × 107/ml za oblaganje na ELISA ploči za ispitivanje Fc R-vezivanja.

Kovalentno spajanje antigena na fluorescentne kuglice od lateksa.

Fluorescentne lateksne kuglice modificirane aminom veličine 2.0-µm (Sigma-Aldrich) dvaput su isprane s 400 µl PBS-a i centrifugirane na 2000 × g 3 minute. Zrncima je dodan glutaraldehid od 8 posto u PBS-u i inkubiran na valjku preko noći na 4 stupnja. Nakon ispiranja s PBS-om, kuglicama je dodano 1 mg/ml rekombinantnog CSP-a i inkubirano na vorteksu 6 h. Nakon toga, zrnca su centrifugirana i resuspendirana u 200 µl etanolamina i inkubirana 30 minuta na vorteksu kako bi se ugasile sve preostale aminske skupine. Kuglice su zatim isprane u PBS-u i blokirane s 1 posto BSA preko noći na 4 stupnja. Kuglice obložene antigenom držane su u ultrazvučnoj vodenoj kupelji 20 minuta na 4 stupnja kako bi se smanjila agregacija i zatim su podešene na 5 × 107 kuglica/ml. Kuglice su pohranjene na 4 stupnja u prisutnosti 0,1 posto SDS i 0,02 posto NaN3.

Testovi opsonične fagocitoze.

Testovi opsonične fagocitoze provedeni su u različitim postavkama za različite svrhe kako je opisano u nastavku i u Dodatnoj tablici 6.

Za opsoničnu fagocitozu sporozoita P. falciparum i P. berghei korištenjem izoliranih stanica, krioprezervirane sporozoite P. falciparum osigurao je PATHMVI (Samaria, Rockville, SAD) i pohranjeni su u tekućem dušiku te odmrznuti na 37 stupnjeva 40 s kako je opisano u korisnički priručnik proizvođača. Svježe secirani sporozoiti P. berghei koji su bili transfektirani radi ekspresije PfCSP12 također su korišteni u ovoj studiji. Isti pristup korišten je za sporozoite P. falciparum i P. berghei u pokusima. Sporozoiti su obojeni s 10 µg/ml etidijevog bromida tijekom 1 sata na ledu nakon čega su uslijedila tri ispiranja s RPMI-HEPES. Za opsonizaciju, 50000 sporozoita inkubirano je s 1 ul testnog seruma 1 h na ledu, nakon čega je uslijedila koinkubacija s 5000 neutrofila u koncentraciji od 5 × 105 stanica/ml u RPMI-1640 nadopunjen s 10 posto FCS-a i 2,5 posto toplinski inaktiviranog ljudskog seruma donora iz Melbournea koji nisu bili zaraženi malarijom. Također je dodana dodatna 1 ul testnog seruma kako bi se uzela u obzir promjena volumena od dodavanja neutrofila i održala ista koncentracija testnog antitijela tijekom fagocitoze.

Koinkubacija je ostavljena 15 minuta na 37 stupnjeva u inkubatoru s 5 posto CO2 kako bi došlo do fagocitoze. Stanice su centrifugirane na 4 stupnja i isprane hladnim PBS-1 posto NCS–0.04 posto NaN3 (FACS pufer) kako bi se zaustavila aktivnost fagocitoze. Razina fagocitoze kvantificirana je protočnom citometrijom (FACS CantoII, BD Biosciences) i analizirana pomoću softvera FlowJo (verzija 10). Podaci su predstavljeni kao indeks fagocitoze (PI), koji je definiran kao udio neutrofila (dopunska slika 4A) ili THP-1 stanica (dopunska slika 1A) koje su imale fagocitirane sporozoite. Za pokuse na kohorti Kanyawegi i Chulaimbo, PI je dodatno standardiziran kao relativni indeks fagocitoze (RPI), koji je definiran kao postotak PI za svaki uzorak u odnosu na pozitivnu kontrolu. Neopsonizirani sporozoiti uključeni su kao negativne kontrole u svim testovima. Standardni testovi fagocitoze neutrofila uključivali su 2,5 posto ljudskog seruma donora koji nisu bili izloženi malariji. Standardni testovi fagocitoze THP-1 provedeni su korištenjem utvrđenih metoda koje uključuju 10 posto FCS.

Za fagocitozu kuglica obloženih antigenom ili merozoita korištenjem izoliranih stanica, analiza fagocitoze prilagođena je iz prethodno objavljenih metoda s modifikacijama 32. Ukratko, 1 × 106 fluorescentnih kuglica od lateksa obloženih antigenom ili merozoita opsonizirano je s uzorcima seruma tijekom 1 sata. Kuglice ili merozoiti isprani su tri puta s RPMI-1640 prije koinkubacije s 1 × 105 neutrofila za fagocitozu. Fagocitoza je ostavljena 20 minuta za kuglice ili 10 minuta za merozoite na 37 stupnjeva, a stanice su nakon toga isprane FACS puferom na 300 x g i 4 stupnja 4 minute. Udio neutrofila koji sadrže fluorescentna zrnca ili merozoite procijenjen je protočnom citometrijom (FACS CantoII, BD Biosciences) i analiziran pomoću softvera FlowJo (dopunska slika 4A). U nekim testovima korištena je stanična linija THP-1 sa standardnim uvjetima koji uključuju 10 posto FCS-a; u drugim je testovima za usporedbu korišteno dodatnih 2,5 posto ljudskog seruma donora iz Melbournea koji nisu bili zaraženi malarijom.

Za fagocitozu kuglica obloženih antigenom ili sporozoita P. berghei korištenjem preparata leukocita cijele krvi, kuglice obložene CSP opsonizirane su zečjim poliklonalnim antitijelima podignutim protiv CSP. Fagocitoza je izvedena koinkubacijom opsoniziranih kuglica s ukupnom frakcijom leukocita iz cijele krvi koja je sadržavala 1 × 106 fagocita (monocita i neutrofila) tijekom 20 minuta na 37 stupnjeva u inkubatoru s 5 posto CO2. Ovi eksperimenti su izvedeni korištenjem varijabilnih koncentracija antitijela za opsonizaciju ili varijabilnih omjera kuglica prema fagocitima. Za testiranje opsonične fagocitoze sporozoita P. berghei pripravcima cijelih leukocita, 5 × 105 sporozoita je opsonizirano skupom seruma kenijske odrasle osobe izložene malariji u razrjeđenju od 1:100, nakon čega je uslijedila koinkubacija s cijelim leukocitima koji su sadržavali 5 × 104 fagocita. Stanice su centrifugirane na 4 stupnja tijekom 4 minute kako bi se zaustavila fagocitna aktivnost, a različiti fagociti (monociti i neutrofili) obilježeni su fluorescentno konjugiranim protutijelima za daljnju analizu. Monociti su obilježeni anti-CD14-Alexa647 (MφP9 BD Bioscience, 1:33) i anti-CD16- BV421 (3G8 BD Bioscience, 1:20), a neutrofili su obilježeni anti-CD66bAPC -H7 (G10F5 BD Bioscience, 1:33).

Za FACS analizu, fagocitirane kuglice odabrane su kao PEhigh i FSChigh populacije. Zrnca koja su fagocitirana monocitima i neutrofilima dalje su razlučena bojanjem CD14 i CD66b. Broj kuglica koje su monociti i neutrofili fagocitirali izračunat je na temelju intenziteta fluorescencije (dodatna slika 8). Ovaj broj je dalje standardiziran korištenjem ukupnog broja fagocita (monocita i neutrofila) i izražen kao kuglice na 100 fagocita, što predstavlja stopu fagocitoze različitih tipova stanica.

Za inhibiciju opsonične fagocitoze blokiranjem Fc receptora ili iscrpljivanjem CSP antitijela, različiti Fc Rs su blokirani korištenjem specifičnih blokirajućih antitijela. Fc RI je blokiran s 50 µg/ml blokirajućim protutijelom (mAb 10.1 Merck), Fc RIIa je blokiran s 50 µg/ml blokirajućim protutijelom (mAb IV.3), Fc RIII je blokiran s 50 µg/ml blokirajućim protutijelom (mAb 3G8) . THP-1 stanice i neutrofili tretirani su sa svakim Fc R blokatorom, redom, na 4 stupnja tijekom 30 minuta prije koinkubacije s CSP-obloženim lateks kuglicama, koje su opsonizirane serumom imunih odraslih osoba. Test fagocitoze je izveden kao što je gore navedeno. Kako bi se procijenila uloga protutijela na CSP u poticanju fagocitoze posredovane stečenim ljudskim protutijelima, skup kenijskog seruma odrasle osobe prethodno je inkubiran 30 minuta s rekombinantnim CSP-om i peptidom NT regije u koncentraciji od 20 ug/ml za vezanje CSP-specifičnih antitijela, prije upotrebe u testovima fagocitoze.

Mjerenje ukupnog IgG i IgG podklasa ELISA testom.

Ukupni IgG i IgG potklase rekombinantnih proteina izmjereni su ELISA-om kao što je prethodno opisano33. Ukratko, CSP je obložen u koncentraciji od 1 µg/ml na 96- Maxisorp mikrotitarskim pločama (NUNC, Roskilde, Danska) i inkubiran preko noći na 4 stupnja. Ploče su isprane s PBS-om koji sadrži 0.05 posto Tween20 (PBS-Tween) i blokirane s PBS-1 posto BSA na 37 stupnjeva tijekom 2 sata. Ljudski serum ili zečji IgG razrijeđen je do željene koncentracije i dodan na ploče u duplikatu. Za detekciju ukupnog IgG, HRP-konjugirani kozji anti-ljudski IgG korišten je u razrjeđenju 1:2500 nakon čega je slijedio ABTS supstrat za razvijanje boje. Reakcija je zaustavljena s 1 posto SDS, a apsorbancija je izmjerena na 405 nm. Za detekciju podklase IgG, mAbs za ljudske IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 korištena su u razrjeđenju 1:1000, nakon čega je slijedio HRP konjugirani kozji anti-mišji IgG korišten u razrjeđenju 1:2500. Konačno, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB, Life Technologies) supstrat je korišten za razvijanje boje, a reakcija je zaustavljena s 1 M H2SO4. Apsorbancija je mjerena na 450 nm. Kao pozitivna kontrola korišten je skup kenijskog seruma odraslih s visokom IgG reaktivnošću na CSP.

Mapiranje epitopa antitijela NT regije.

Sintetiziran je niz koji sadrži 70 biotiniliranih 15-mer peptida koji predstavljaju linearnu sekvencu CSP (3D7/NF54 soj) (Mimotopes, Australija). Svaki peptid je imao kratki SGSG razmak između CSP peptidne sekvence i biotinske oznake (koja je dodana da pomogne imobilizaciju), i 12 aa preklapanja između peptida. Analize protutijela provedene su korištenjem prethodno utvrđenih pristupa65,66; 50 ul po jažici peptida dodano je na ELISA ploče koje su prethodno obložene s 1 ug/ml streptavidina (Sigma-Aldrich). Zasićenje vezanja peptida postignuto je i potvrđeno kvantificiranjem rezidualnih biotin-veznih mjesta na streptavidinu pomoću biotin-HRP. nakon čega slijedi blokiranje s 10 posto mlijeka i ispiranje PBS-om s 0,05 posto Tween-a. Zečji poliklonski IgG podignut na NT regiji CSP je dodan u svaku jažicu u koncentraciji od 1:500. Razina vezanja zečjih IgG detektirana je HRP konjugiranim kozjim anti-zečjim IgG (Millipore, 1:2500) i kvantificirana korištenjem TMB supstrata.

Test vezanja Fc receptora.

Test vezanja Fc receptora prilagođen je iz prethodno objavljenih metoda s manjim modifikacijama39. Ukratko, 5{{20}} ul rekombinantnog CSP-a u koncentraciji od 1 ug/ml obloženo je na Maxisorp™ ploče i inkubirano preko noći na 4 stupnja, nakon čega su uslijedila tri ispiranja s PBS-Tween. Ploče su zatim blokirane s 200 ul 1 posto BSA-PBS na 37 stupnjeva tijekom 2 sata nakon čega su uslijedila tri ispiranja s PBS-Tween. Uzorci seruma su razrijeđeni u omjeru 1:50 u PBS-BSA i 50 ul svakog uzorka je dodano na ploče u duplikatu i inkubirano na sobnoj temperaturi 2 sata, nakon čega su uslijedila tri ispiranja u PBS-Tweenu. Pedeset mikrolitara biotinom konjugiranih rekombinantnih topljivih dimera ektodomene Fc RIIa H131 (0,2 ug/ml) ili dimera ektodomene Fc RIII V158 (0,1 ug/ml) dodano je u svaku jažicu i inkubirano na 37 stupnjeva 1 h nakon čega su slijedila tri ispiranja s PBS-om -Tween. Za neke testove, R131 alel Fc RIIa i F158 alel Fc RIII korišteni su u istoj koncentraciji. Nakon toga je uslijedio sekundarni HRP-konjugirani streptavidin (Thermo Fisher Scientific, 1:10, 000) u PBS-BSA na 37 stupnjeva tijekom 1 sata nakon čega su uslijedila tri ispiranja s PBS-Tween.

Na kraju je dodano 50 ul TMB tekućeg supstrata tijekom 20 minuta da se izmjeri enzimska reaktivnost. Reakcija je zaustavljena s 50 ul 1 M otopine H2SO4. Razina vezanja je mjerena kao optička gustoća na 450 nm. Skupni ljudski IgG odraslih Kenijaca izloženih malariji (1:100) i zečji poliklonalni IgG prema CSP (1:500) korišteni su kao pozitivne kontrole. Individualni serumi naivnih odraslih Melbourne (1:50) korišteni su kao negativne kontrole.

Test vezanja Fc receptora prilagođen je iz prethodno objavljenih metoda s manjim modifikacijama39. Ukratko, 5{{20}} ul rekombinantnog CSP-a u koncentraciji od 1 ug/ml obloženo je na Maxisorp™ ploče i inkubirano preko noći na 4 stupnja, nakon čega su uslijedila tri ispiranja s PBS-Tween. Ploče su zatim blokirane s 200 ul 1 posto BSA-PBS na 37 stupnjeva tijekom 2 sata nakon čega su uslijedila tri ispiranja s PBS-Tween. Uzorci seruma su razrijeđeni u omjeru 1:50 u PBS-BSA i 50 ul svakog uzorka je dodano na ploče u duplikatu i inkubirano na sobnoj temperaturi 2 sata, nakon čega su uslijedila tri ispiranja u PBS-Tweenu. Pedeset mikrolitara biotinom konjugiranih rekombinantnih topljivih dimera ektodomene Fc RIIa H131 (0,2 ug/ml) ili dimera ektodomene Fc RIII V158 (0,1 ug/ml) dodano je u svaku jažicu i inkubirano na 37 stupnjeva 1 h nakon čega su slijedila tri ispiranja s PBS-om -Tween. Za neke testove, R131 alel Fc RIIa i F158 alel Fc RIII korišteni su u istoj koncentraciji. Nakon toga je uslijedio sekundarni HRP-konjugirani streptavidin (Thermo Fisher Scientific, 1:10, 000) u PBS-BSA na 37 stupnjeva tijekom 1 sata nakon čega su uslijedila tri ispiranja s PBS-Tween. Na kraju je dodano 50 ul TMB tekućeg supstrata tijekom 20 minuta da se izmjeri enzimska reaktivnost. Reakcija je zaustavljena s 50 ul 1 M otopine H2SO4. Razina vezanja je mjerena kao optička gustoća na 450 nm. Skupni ljudski IgG odraslih Kenijaca izloženih malariji (1:100) i zečji poliklonalni IgG prema CSP (1:500) korišteni su kao pozitivne kontrole. Individualni serumi naivnih odraslih Melbourne (1:50) korišteni su kao negativne kontrole.

Test stanično posredovane citotoksičnosti ovisan o protutijelima.

ADCC-inducira aktivnost odabranih uzoraka seruma procijenjena je korištenjem kompleta ADCC Reporter Bioassay (Promega, kat. br. G7010) prema uputama proizvođača, uz sljedeće izmjene. Kuglice obložene CSP opsonizirane su ljudskim serumom u razrjeđenju 1:50. Reporterske stanice su nasađene na 72 000 stanice po jažici zajedno s CSP-obloženim fluorescentnim kuglicama u omjeru 10:1. Nakon 6 h inkubacije, dodan je supstrat za kemiluminiscenciju i luminiscencija je detektirana i kvantificirana otprilike svakih 5 minuta tijekom 40 minuta (CLARIOstar, BMG LabTech). Prikazani podaci zabilježeni su oko 30 minuta nakon dodavanja kemiluminiscentnog supstrata.

Razina ADCC također je potvrđena u primarnim NK stanicama korištenjem prethodno objavljene metode 38. Ukratko, PBMC koje sadrže NK stanice uzgajane su u RPMI1640 dopunjenom s 10 posto FCS i 100 IU/ml interleukina-2 (IL{{5 }}) preko noći. Kuglice obložene CSP-om opsonizirane su ljudskim serumom u razrjeđenju 1:50, zatim su kultivirane s primarnim PBMC-ima u prisutnosti anti-CD107a-AF647 (H4A3, BD Bioscience) tijekom 1 sata. Nakon toga, kokulturi su dodani brefeldin A (Sigma-Aldrich) i inhibitor transporta proteina (BD Bioscience) u koncentraciji od 5 ug/ml odnosno 1/1500 i nastavljeno je inkubirati 3 sata. Nakon inkubacije, stanice su centrifugirane na 300 × g 4 minute na 4 stupnja i obojene s anti-CD3-APC-H7 (SK7, BD Bioscience, 1:33), anti-CD56- PE-Cy7 (B159, BD Bioscience, 1:33) i anti-CD16-BV421 (3G8, BD Bioscience, 1:20). NK stanice definirane su kao CD3−, CD56 plus limfociti, a razina ADCC kvantificirana je kao postotak NK stanica s CD107a bojenjem protočnom citometrijom (LSR Fortessa X-20, BD Bioscience) (dopunska slika 9).

Analiza podataka.

Statističke analize provedene su korištenjem Prism verzije 7 (GraphPad Software Inc) i STATA verzije 13.1 (StataCorp). Statistički test i P vrijednosti naznačeni su u legendi slika. Korelacije između fagocitoze, vezanja Fc R i razina IgG procijenjene su korištenjem Spearmanovih koeficijenata korelacije i višestrukih linearnih regresijskih modela. Razlike u razinama fagocitoze, vezanju Fc R i razinama IgG u dobnim skupinama i različitim uvjetima opsonizacije procijenjene su pomoću jednosmjerne ANOVA-e s višestrukim usporedbama.

Za procjenu funkcionalnih aktivnosti protutijela bez obzira na ukupni titar IgG na CSP, Fc R vezanje i učinkovitost fagocitoze izračunati su kao razina Fc R vezanja ili razina opsonične fagocitoze u odnosu na IgG reaktivnost na CSP. Spearmanova korelacija i Mann-Whitneyev test korišteni su za analizu funkcionalne učinkovitosti antitijela kod djece i odraslih. Dvosmjerna ANOVA korištena je za usporedbu opsonične fagocitoze neutrofila i monocita u testovima cijelih leukocita. Kruskal-Wallisov test i Mann-Whitneyjev test provedeni su za podatke koji nisu normalno raspoređeni. Sve statističke analize provedene su kao dvostrani testovi. Uzorci su klasificirani kao pozitivni na antitijela ako je reaktivnost bila veća od srednje vrijednosti plus 3 standardne devijacije vrijednosti kontrola koje nisu bile izložene malariji.

Sažetak izvješća.

Dodatne informacije o dizajnu istraživanja dostupne su u Sažetku izvješća o istraživanju prirode povezanom s ovim člankom.

Dostupnost podataka.

Podaci korišteni za izradu slika dostupni su od autora na zahtjev. Baze podataka koje su analizirane u pripremi ovog rada i prikazane u slikama i tablicama dostupne su od dotičnog autora na razuman zahtjev i uz suglasnost relevantnih etičkih povjerenstava (za kliničke podatke). Sekvence P. falciparum dobivene su iz javne baze podataka na PlasmoDB.org.

Primljeno: 2. rujna 2019.; Prihvaćeno: 24. veljače 2021.

Reference

1. Svjetska zdravstvena organizacija. Svjetsko izvješće o malariji 2018. (Svjetska zdravstvena organizacija, 2018.).

2. Svjetska zdravstvena organizacija, Plan za tehnologiju cjepiva protiv malarije (Svjetska zdravstvena organizacija, 2018.).

3. Beeson, JG i sur. Izazovi i strategije za razvoj učinkovitih i dugotrajnih cjepiva protiv malarije. Sci. prev. Med. 11, eaau1458 (2019).

4. Cockburn, IA & Seder, RA Prevencija malarije: od imunoloških koncepata do učinkovitih cjepiva i zaštitnih antitijela. Nat. Immunol. 19, 1199–1211 (2018).

5. Choumet, V. et al. Vizualizacija neinfektivnog i zaraznog Anopheles gambiae hranjenja krvlju u naivnih miševa i miševa imuniziranih slinom. PLoS ONE 7, e50464 (2012).

6. Nussenzweig, V. & Nussenzweig, RS Circumsporozoite proteini malarijskih parazita. Cell 42, 401-403 (1985).

7. Partnerstvo, RCT Učinkovitost i sigurnost RTS, S/AS01 cjepiva protiv malarije sa ili bez docjepljivanja u dojenčadi i djece u Africi: konačni rezultati faze 3, pojedinačno randomiziranog, kontroliranog ispitivanja. Lancet 386, 31–45 (2015).

8. Dups, JN, Pepper, M. & Cockburn, IA Odgovor antitijela i B stanica na sporozoite Plasmodium. Ispred. Microbiol. 5, 625 (2014).

9. Dobano, C. i sur. Koncentracija i avidnost protutijela na različite epitope cirkumsporozoita koreliraju s učinkovitošću RTS, S/AS01E cjepiva protiv malarije. Nat. Komun.

10, 2174 (2019). 10. Stewart, MJ, Nawrot, RJ, Schulman, S. & Vanderberg, JP Invazija sporozoita Plasmodium berghei blokirana je in vitro protutijelima koja imobiliziraju sporozoite. Zaraziti. Imun. 51, 859–864 (1986).

11. Mishra, S., Nussenzweig, RS & Nussenzweig, V. Protutijela na protein Plasmodium circumsporozoite (CSP) inhibiraju aktivnost sporozoita koja prolazi stanicom. J. Immunol. Metode 377, 47–52 (2012).

12. Triller, G. i sur. Prirodna izloženost parazitima izaziva zaštitna ljudska antimalarijska antitijela. Imunitet 47, 1197-1209 e1110 (2017).

13. Hoffman, SL i sur. Imunitet na malariju i prirodno stečena antitijela na protein cirkumsporozoita Plasmodium falciparum. N. engl. J. Med. 315, 601-606 (1986).

14. Foquet, L. i sur. Monoklonska protutijela izazvana cjepivom usmjerena na protein cirkumsporozoita sprječavaju infekciju Plasmodium falciparum. J. Clin. Istražite. 124, 140–144 (2014).

15. Przysiecki, C. et al. Protutijela koja neutraliziraju sporozoite izazvana u miševa i rezus makakija imuniziranih ponovljenim peptidom Plasmodium falciparum konjugiranim s proteinskim kompleksom vanjske membrane meningokoka. Ispred. Cell Infect. Microbiol. 2, 146 (2012).

16. Flores-Garcia, Y. et al. Zaštita protiv plazmodijevih sporozoita posredovana protutijelima počinje na dermalnom mjestu inokulacije. mBio 9, e02194-02118 (2018).

17. Aliprandini, E. i sur. Citotoksična protutijela protiv cirkumsporozoita ciljaju sporozoite malarije u koži domaćina. Nat. Microbiol. 3, 1224–1233 (2018).

18. DiLillo, DJ, Tan, GS, Palese, P. & Ravetch, JV Široko neutralizirajuća antitijela specifična za hemaglutinin zahtijevaju FcgammaR interakcije za zaštitu od virusa influence in vivo. Nat. Med. 20, 143–151 (2014).

19. Hessell, AJ et al. Vezanje Fc receptora, ali ne i vezanje komplementa, važno je u zaštiti protutijela od HIV-a. Nature 449, 101-104 (2007).

20. Bournazos, S. et al. Široko neutralizirajuća anti-HIV-1 antitijela zahtijevaju Fc efektorske funkcije za aktivnost in vivo. Cell 158, 1243-1253 (2014).

21. Mullarkey, CE i sur. Široko neutralizirajuća antitijela specifična za stabljiku hemaglutinina induciraju snažnu fagocitozu imunoloških kompleksa pomoću neutrofila na Fc-ovisan način. mBio 7, e01624-01616 (2016).

22. Irani, V. et al. Molekularna svojstva potklasa humanih IgG i njihove implikacije za dizajniranje terapijskih monoklonskih protutijela protiv zaraznih bolesti. Mol. Immunol. 67, 171–182 (2015). 23. Nauseef, WM & Borregaard, N. Neutrofili na djelu. Nat. Immunol. 15, 602–611 (2014).

24. Kolaczkowska, E. & Kubes, P. Regrutiranje i funkcija neutrofila u zdravlju i upali. Nat. Rev. Immunol. 13, 159–175 (2013).

25. Gordon, S. Fagocitoza: imunološki proces. Imunitet 44, 463–475 (2016).

26. Scapini, P. & Cassatella, MA Društveno umrežavanje ljudskih neutrofila unutar imunološkog sustava. Blood 124, 710–719 (2014).

27. Dale, DC, Boxer, L. & Liles, WC Fagociti: neutrofili i monociti. Blood 112, 935–945 (2008).

28. Ziegler-Heitbrock, L. et al. Nomenklatura monocita i dendritičnih stanica u krvi. Blood 116, e74-e80 (2010).

29. Rosales, C. Heterogenost Fcgamma receptora u funkcionalnim odgovorima leukocita. Ispred. Immunol. 8, 280 (2017).

30. Golay, J. i sur. Ljudski neutrofili izražavaju niske razine FcgammaRIIIA, koji igra ulogu u aktivaciji PMN-a. Blood 133, 1395–1405 (2019).

31. Steel, RW i sur. Ispitivanje opsonične fagocitoze za sporozoite Plasmodium falciparum. Clin. Cjepivo Immunol. 24, e00445-00416 (2017).

32. Osier, FH i sur. Opsonična fagocitoza merozoita Plasmodium falciparum: mehanizam u ljudskom imunitetu i korelat zaštite od malarije. BMC Med. 12, 108 (2014).

33. Kurtović, L. et al. Ljudska protutijela aktiviraju komplement protiv sporozoita Plasmodium falciparum i povezana su sa zaštitom od malarije kod djece. BMC Med. 16, 61 (2018).

34. Tan, J. i sur. Javna loza protutijela koja snažno inhibira infekciju malarijom dvostrukim vezanjem na protein cirkumsporozoita. Nat. Med. 24, 401–407 (2018).

35. Kerntke, C., Nimmerjahn, F. & Biburger, M. Postoji (znanstvena) snaga u brojevima: sveobuhvatna kvantifikacija broja Fc gama receptora na ljudskim i mišjim leukocitima periferne krvi. Ispred. Immunol. 11, 118 (2020).

36. Fleit, HB & Kobasiuk, CD Stanična linija slična ljudskom monocitu THP-1 eksprimira Fc gama RI i Fc gama RII. J. Leukoc. Biol. 49, 556-565 (1991).

37. Ulfman, LH, Leusen, JHW, Savelkoul, HFJ, Warner, JO & van Neerven, RJJ Učinci goveđih imunoglobulina na imunološku funkciju, alergiju i infekciju. Ispred. Nutr. 5, 52 (2018).

38. Lichtfuss, GF i sur. HIV inhibira događaje rane transdukcije signala potaknute CD16 umrežavanjem na NK stanicama, koje su važne za staničnu citotoksičnost ovisnu o antitijelima. J. Leukoc. Biol. 89, 149–158 (2011).

39. Wines, BD et al. Dimerne FcgammaR ektodomene kao probe funkcije Fc receptora IgG virusa influence. J. Immunol. 197, 1507–1516 (2016).

40. Li, X., Gibson, AW & Kimberly, RP Ljudski FcR polimorfizam i bolest. Curr. Vrh. Microbiol. Immunol. 382, 275–302 (2014).

41. Munde, EO i sur. Povezanost između genetskih polimorfizama Fcgamma receptora IIA, IIIA i IIIB i osjetljivosti na tešku anemiju malarije u djece u zapadnoj Keniji. BMC Infect. Dis. 17, 289 (2017).

42. Chelimo, K. et al. Razlike vezane uz dob u prirodno stečenoj memoriji T stanica na površinski protein merozoita Plasmodium falciparum 1. PLoS ONE 6, e24852 (2011).

43. Kurtović, L. et al. Multifunkcionalna antitijela inducirana su RTS, S cjepivom protiv malarije i povezana su sa zaštitom u ispitivanjima faze I/IIa. J. Zaraziti. Dis, jiaa144 (2020). 44. Abel, AM, Yang, C., Thakar, MS & Malarkannan, S. Stanice prirodne ubojice: razvoj, sazrijevanje i klinička upotreba. Ispred. Immunol. 9, 1869 (2018).

45. Chaudhury, S. et al. Biološka funkcija protutijela izazvanih RTS, S/AS01 kandidatom za cjepivo protiv malarije određena je njihovom finom specifičnošću. Malar. J. 15, 301 (2016).

46. ​​Collins, KA, Snaith, R., Cottingham, MG, Gilbert, SC & Hill, AVS Povećanje zaštitnog imuniteta na malariju s visoko imunogenim cjepivom nalik virusu. Sci. Rep. 7, 46621 (2017).

47. Coppi, A., Pinzon-Ortiz, C., Hutter, C. & Sinnis, P. Protein Plasmodium circumsporozoite se proteolitički obrađuje tijekom invazije stanica. J. Exp. Med. 201, 27–33 (2005).

48. Coppi, A. i sur. Protein cirkumsporozoita malarije ima dvije funkcionalne domene, svaka s različitim ulogama dok sporozoiti putuju od komarca do domaćina sisavca. J. Exp. Med. 208, 341–356 (2011).

49. John, CC et al. Korelacija visokih razina protutijela na višestruke preeritrocitne antigene Plasmodium falciparum i zaštita od infekcije. Am. J. Trop. Med Hyg. 73, 222–228 (2005).

50. Tran, TM i sur. Intenzivna longitudinalna kohortna studija malijske djece i odraslih ne otkriva nikakve dokaze o stečenoj imunosti na infekciju Plasmodium falciparum. Clin. Zaraziti. Dis. 57, 40–47 (2013).

51. Epstein, JE et al. Zaštita od malarije Plasmodium falciparum cjepivom PfSPZ. JCI Insight 2, e89154 (2017).

52. Sack, BK i sur. Humoralna zaštita od infekcije Plasmodium falciparum koja se prenosi ubodom komarca u humaniziranih miševa. NPJ Vaccines 2, 27 (2017).

53. Stoute, JA i sur. Preliminarna procjena rekombinantnog cjepiva proteina cirkumsporozoita protiv malarije Plasmodium falciparum. RTS, S Grupa za procjenu cjepiva protiv malarije. N. engl. J. Med. 336, 86–91 (1997).

54. Kester, KE i sur. Učinkovitost rekombinantnih režima cjepiva s proteinom cirkumsporozoita protiv eksperimentalne malarije Plasmodium falciparum. J. Zaraziti. Dis. 183, 640-647 (2001).

55. Kester, KE i sur. Faza 2a ispitivanja 0, 1 i 3 mjeseca i 0, 7 i 28-dnevnog rasporeda imunizacije cjepivom protiv malarije RTS, S/AS02 kod odraslih osoba koje nisu bile liječene malarijom u Walter Reedu Vojni institut za istraživanje. Vaccine 26, 2191-2202 (2008).

56. Kester, KE i sur. Randomizirano, dvostruko slijepo, faza 2a ispitivanja cjepiva protiv malarije falciparum RTS, S/AS01B i RTS, S/AS02A u odraslih osoba koje nisu imale malariju: sigurnost, učinkovitost i imunološki suradnici zaštite. J. Zaraziti. Dis. 200, 337–346 (2009).

57. Lux, A., Yu, X., Scanlan, CN & Nimmerjahn, F. Utjecaj veličine imunološkog kompleksa i glikozilacije na vezivanje IgG na ljudski FcgammaRs. J. Immunol. 190, 4315-4323 (2013).

58. Nesspor, TC, Raju, TS, Chin, CN, Vafa, O. & Brezski, RJ Avidnost daje vezujuće FcgammaR i funkciju imunološkog efektora glikoziliranom imunoglobulinu G1. J. Mol. Prepoznati. 25, 147–154 (2012).

59. Dent, AE i sur. Vremenska stabilnost prirodno stečenog imuniteta na površinski protein merozoita-1 u odraslih Kenijaca. Malar. J. 8, 162 (2009).

60. John, CC et al. Antitijela na preeritrocitne antigene Plasmodium falciparum i rizik od kliničke malarije u kenijske djece. J. Zaraziti. Dis. 197, 519–526 (2008).

61. Zavala, F. i sur. Obrazloženje za razvoj sintetskog cjepiva protiv malarije Plasmodium falciparum. Znanost 228, 1436–1440 (1985).

62. Arduin, E. et al. Jako smanjeno vezanje na mišje Fc gama receptore visokog i niskog afiniteta putem mutacija L234A/L235A i N297A Fc konstruiranih u mišji IgG2a. Mol. Immunol. 63, 456–463 (2015).

63. Quinn, MT, DeLeo, FR & Bokoch, GM u Methods Mol Biol, sv. 412 (ur. Quinn, MT) 13–18 (Springer Science plus Business Media, Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2007.).

64. Maueroder, C. et al. Sposobnost neutrofila da formiraju NET nije pod izravnim utjecajem peptida koji cilja CMA. Ispred. Immunol. 8, 16 (2017).

65. Feng, G. i sur. Imunizacija ljudi polimorfnim kandidatom za cjepivo protiv malarije izazvala je antitijela na očuvane epitope koji potiču funkcionalna antitijela na više sojeva parazita. J. Zaraziti. Dis. 218, 35–43 (2018).

66. Boyle, MJ i sur. Ljudska antitijela fiksiraju komplement da inhibiraju invaziju Plasmodium falciparum na eritrocite i povezana su sa zaštitom od malarije. Imunitet 42, 580–590 (2015).

Priznanja

Zahvaljujemo sudionicima studije i osoblju Kenijskog instituta za medicinska istraživanja na uzorcima iz kohorte Chulaimbo i kohorte Kanyawegi. Sporozoite P. falciparum i mAb 2H8 ljubazno je ustupila PATH Inicijativa za cjepivo protiv malarije (MVI). mAb 3D11 i hibridom ljubazno je osigurao Miguel Prudêncio iz Instituta za molekularnu medicinu. P. berghei paraziti koji eksprimiraju P. falciparum CSP osigurali su Chris Janse, Shahid Khan i Hans Kroeze iz Medicinskog centra Sveučilišta Leiden. Kovalentno spajanje antigena na fluorescentne kuglice uvelike su podržali Paul Ramsland s RMIT-a, Paul Sanders s Burnet Instituta i Geoffrey Pietersz s Baker Heart and Diabetes Institute.

Također zahvaljujemo Michelle Wong s Instituta Burnet što je bila naš flebotomist i Emily Locke na korisnim povratnim informacijama i savjetima. Ovu studiju također je podržao temeljni pogon za protočnu citometriju AMREP. Ovaj je rad podržalo Nacionalno vijeće za zdravlje i medicinska istraživanja (NHMRC) Australije (programska potpora i stipendija za starije istraživače JG Beesonu; projektna potpora JGB-u, GI McFaddenu i PM Hogarthu; stipendija za razvoj karijere MJB-u), PATH-MVI (donacija za JGB), Zaklada CASS (donacija za GF), stipendija laureata Australskog istraživačkog vijeća za GI McFadden i NIH međunarodni centri za izvrsnost u istraživanju malarije (U19AI129326). Burnet Institute podržavaju NHMRC za Infrastructure Support Scheme za neovisne istraživačke institute i Victorian State State Operational Infrastructure Support. JGB, GF, MJB, JAC, SC i LK članovi su NHMRC Australskog centra za istraživačku izvrsnost u eliminaciji malarije.

Autorski prilozi

JGB, GF i BDW vodili su dizajn studije uz doprinose PMH, GIM, LK, JAC i drugih autora; GF, BDW, LK, PB, DML, SC, VM i AC proveli su eksperimente i interpretirali rezultate; GF, PB i JAC proveli su analizu podataka uz pomoć JGB, LK i MJB; JGB, BDW, PMH, JWK, AED, KC, GIM, AC, VM, DRD i RJC pružili su ili generirali ključne reagense, podatke i/ili resurse; GF, JGB, LK, JAC i DRD pridonijeli su pripremi rada uz doprinos svih ostalih koautora.

Suprotstavljeni interesi

Autori izjavljuju da nema suprotstavljenih interesa.

Informacije o recenziji

Nature Communications zahvaljuje Katie Ewer, Photini Sinnis i drugim, anonimnim recenzentima na njihovom doprinosu recenziji ovog rada. Dostupna su izvješća recenzenata.

Napomena izdavača

Springer Nature ostaje neutralan u pogledu tvrdnji o nadležnosti u objavljenim kartama i institucionalnim vezama.

Otvoreni pristup

Ovaj je članak licenciran pod međunarodnom licencom Creative Commons Attribution 4.0, koja dopušta korištenje, dijeljenje, prilagodbu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju ili formatu, sve dok izvornom autoru(-ima) dajete odgovarajuće priznanje ) i izvor, navedite poveznicu na licencu Creative Commons i naznačite jesu li promjene napravljene. Slike ili drugi materijali trećih strana u ovom članku uključeni su u Creative Commons licencu članka osim ako nije drugačije navedeno u kreditnoj liniji za materijal. Ako materijal nije uključen u Creative Commons licencu članka, a vaša namjeravana uporaba nije dopuštena zakonskim propisima ili premašuje dopuštenu upotrebu, morat ćete dobiti dopuštenje izravno od nositelja autorskih prava. Za pregled kopije ove licence posjetite http://creativecommons.org/licens/by/4.0/.

 For more information:1950477648nn@gmail.com