Deplecija makrofaga smanjuje patologiju bolesti kod glomerulonefritisa ovisnog o faktoru H, posredovanog imunološkim kompleksom

Faktor komplementaH (FH) je ključni regulator alternativnog puta komplementa, kod čovjeka i miša. Ranije su naše studije otkrile da odsutnost FH uzrokuje da miš C57BL6 postane osjetljiv nakronična serumska bolest(CSS) zajedno s povećanjembubrežni inFiltracija makrofagau usporedbi s kontrolama. Da bismo razumjeli je li povećano regrutiranje makrofaga (Mϕs) u bubreg je zabijaospozljede i širenja, ispitali smo essek od Mϕ deplecija s klodronatom u FH nokaut miševa sa CSS. Osam tjedana stari FHKO miševi liječeni su apoferitinom (4 mg/mišu) tijekom 5 tjedana i s nosačem (PBS) ili klodronatom (50 mg/kg ip, 3 puta/tjedno tijekom posljednja 3 tjedna). Uprava odklodronat je smanjio monocite i Mϕs u bubrezimapo>80%. 

Funkcija bubregaprocijenjeno BUN-om i albumin je ostao bliži normali nakon iscrpljivanja Mϕs. Liječenje klodronatom spriječilo je promjenu citokina, TNF i IL-6, te povećanje ekspresije gena faktora rasta vezivnog tkiva (CTGF), TGF -1, matrična metaloproteinaza-9 (MMP9),fibronektin, laminin i kolagen u FHKO miševa s CSS (P < 0:05). Liječenje klodronatom dovelo je do relativne zaštite odimunološki kompleks- (IC-) posredovana patologija bolesti tijekom CSS-a prema procjeni od straneznakoviFineznatno smanjena glomerularna patologija(GN) i izvanstaničnog matriksa. Naši rezultati sugeriraju da je aktivacija komplementa jedan od mehanizama koji reguliraju krajolik makrofaga i timefibroza. Točan mehanizam tek treba dešifrirati. Ukratko, naši podaci pokazuju da je Mϕigraju ključnu ulogu u ICGN-u ovisnom o FH i Mϕ iscrpljenostsmanjuje napredovanje bolesti.

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE S 25% EHINAKOSIDA I 9% AKTEOZIDA ZA FUNKCIJU BUBREGA

1. Uvod

Kronična bolest bubrega(CKD) je globalni zdravstveni problem; Od čega je 10% posredovano imunološkim kompleksima (IC-) i javlja se kod serumske bolesti, infekcija i autoimunih bolesti. [1]. Godišnje izvješće USA Renal Data System Annual Report to navodiosobe s CKD"jasno su pod visokim rizikom od smrti" s 10-putno povećanom incidencijom tijekom tri desetljeća u kojima su oboljeli pacijenti izgubili 70% svog životnog vijeka. Prema NIDDK-u, približno 14% odrasle populacije ima dijagnosticiranu bolest bubrega, što je čini devetim vodećim uzrokom smrti [2]. Bubrezi su vrlo osjetljivi na oštećenja uzrokovana komplementom, osobito u autoimunim i upalnim uvjetima [3, 4].

Sustav komplementa sudjeluje u urođenim i adaptivnim imunološkim odgovorima i pruža prvu liniju obrane protiv mikroorganizama [5, 6]. Sastoji se od tri puta aktivacije, koji se pokreću na jedinstvene načine, a sastoji se od više od 30 proteina plazme i stanica povezanih [7]. Alternativni put je stalno na oprezu i reguliran je proteinima kao što je faktor komplementa H (FH). FH je cirkulirajući protein koji se uglavnom sintetizira u jetri [8]. FH-deficijentni (fh-/-) miševi liječeni apoferitinom razvijaju kroničnu serumsku bolest (CSS) koja dovodi do difuznog proliferativnog glomerulonefritisa (GN) unutar 5 tjedana liječenja, dok C57BL/6 miševi iz legla koji imaju dovoljan faktor H (FH) imaju malo upala glomerula [9]. F4/80+ infiltracija makrofaga događa se u bubregu i opaža se oko naslaga IC u fh-/- miševa. Aktivacija komplementa stvara anafilatoksine, C3a i C5a, koji sudjeluju u prometu Mϕs do mjesta upale. Inhibicija C5a/C5aR1 signalizacije smanjila je Mϕs u bubrezima [10]. U ovoj postavci,ozljeda bubregaje povezan s bubrežnom infiltracijom, ali mehanizmi koji mogu biti uključeni u izazivanjeozljeda bubregaostaju nepoznati.

Slika 1: FH mijenja markerske gene makrofaga u bubrezima miševa s ICGN ovisnim o FH. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu za CD204 i CD206 korištenjem mRNA izolirane iz bubrega nakon 5 tjedana fiziološke otopine ili apoferitina. Izraz je normaliziran na GAPDH (n=6/grupa). ∗P < 0:01. Grafikoni prikazuju višestruku promjenu gena u fh-/- miševa tretiranih apoferitinom (n=6) u usporedbi s fh-/- miševima tretiranim fiziološkom otopinom (n=6).

Monociti (Mo) koje stvaraju hematopoetske stanice [11] migriraju kroz endotel u tkiva, gdje se diferenciraju u Mϕs. Markeri kao što su F4/80, CD11b, CD68 i Fc receptori mogu identificirati Mϕs. Mϕ su kritično uključeni u oštećenje bubrega, popravak i fibrozu u različitim eksperimentalnim modelima bubrežne bolesti [12, 13]. Nedavno su naše studije pokazale da je oštećenje bubrega kod ICGN-a ovisnog o FH povezano s bubrežnom infiltracijom Mϕs. Štoviše, prethodne studije su pokazale da inhibicija bubrežne infiltracije Mϕ smanjuje arterijski tlak i sprječava ozljedu glomerula i fibrozu u različitim životinjskim modelima nefropatije [14, 15]. Međutim, koliko znamo, utjecaj smanjenja Mϕ tijekom oštećenja bubrega povezanog s ICGN-om ovisnim o FH nije razmatran. Stoga je ova studija ispitivala ulogu Mϕs na oštećenje bubrega povezano s ICGN-om ovisnim o FH koristeći liposomski klodronat. Klodronat (klodronska kiselina) je bisfosfonat koji se metabolizira u nehidrolizabilni ATP analog [16]. Naši eksperimenti pokazuju da Mϕ igraju ključnu ulogu u gubitku funkcije bubrega u okruženju neregulirane aktivacije komplementa. Stoga bi smanjenje Mϕs ili upućivanje Mϕs da pretpostavi fenotip popravka moglo smanjiti patologiju bolesti i može se terapeutski iskoristiti.

2. Materijali i metode

2.1. Pokusne životinje.

Fh−/− soj miša generirao je i ljubazno ustupio Dr. Matthew Pickering i Marina Botto (Imperial College of London) i kontinuirano povratno križanje sa sojem C57BL/6 u našem laboratoriju više od 10 generacija. Miševi iz legla dovoljni za FH služili su kao kontrola (n=8/skupina). Genotipizacija je provedena korištenjem pristupa temeljenih na PCR-u. Miševi su držani na temperaturi od 20-22 stupnja C u ciklusu osvjetljenja od 12 sati svjetlo-12 sati u tami, u sterilnim, ventiliranim kavezima s hranom i vodom ad lib. Odbori za institucionalnu skrb i korištenje životinja Sveučilišta u Chicagu i Sveučilišta u Buffalu odobrili su sve studije.

2.2. Protokol za kroničnu serumsku bolest.

CSS je induciran u 6-8 tjednih fH−/− miševa ili miševa divljeg tipa svakodnevnom intraperitonealnom primjenom 4 mg apoferitina konjske slezene (Calzyme Laboratories) bez adjuvansa [10, 17, 18] tijekom 5 tjedana. Kontrolne životinje iz legla su istovremeno primile intraperitonealne injekcije fiziološke otopine

2.3. Procjene funkcije bubrega.

Koncentracije dušika ureje u krvi (BUN) određene su Beckman Autoanalizatorom (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Koncentracije albumina u urinu izmjerene su ELISA kitom za mišji albumin (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) i normalizirane na kreatinin u urinu izmjeren kolorimetrijski (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) kako je prethodno opisano [19].

Slika 2: Klodronat sve više smanjuje bubrežne makrofage u miševa s ICGN ovisnim o FH. Prikazani su profili protočne citometrije F4/80+ monocita/Mϕs na dan 0, 2, 4 i 7, reprezentativno. Ekspresija F4/80+ stanica određena je protočnom citometrijom. Podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo V10. F4/80+ stanice značajno se smanjuju u svakoj vremenskoj točki i dosežu manje od 10% do 7. dana. Svaka vremenska točka n=6.

2.4. Histologija.

Bubrezi su umetnuti u parafin i fiksirani u malinu, te su generirani presjeci od četiri mikrometra. Sekcije su obojene periodičnom kiselinom-Schiff i pregledane od strane renalnog patologa (AC) na slijepi način. Za svaki slajd, proliferativni glomerulonefritis i glomeruloskleroza ocijenjeni su od 0 do 4 kao što je prethodno opisano [20]. Za imunofluorescentnu mikroskopiju, tkivo bubrega je brzo zamrznuto u 2-metilbutanu prethodno ohlađenom u suhom ledu. Isječci kriostata od četiri mikrona obrađeni su za imunofluorescentno (IF) bojenje. Sekcije su fiksirane u 4% paraformaldehidu i obojene Alexa488-konjugiranim anti-mišjim C3 (Cappel) i Alexa 555 anti-mišjim IgG. Polukvantitativna ocjena intenziteta bojenja i distribucije od 0 do 4 dana je na slijepi način kao što je prethodno opisano [19].

2.5. qRT-PCR.

Bubrezi su sakupljeni, a ukupna RNA ekstrahirana je iz tkiva pomoću TRIzol reagensa prema uputama proizvođača (Invitrogen, SAD). cDNA je sintetizirana korištenjem reverzne transkriptaze SuperScript III (Invitrogen). qRT-PCR je izveden korištenjem Power SYBR Green PCR Master mix na detektoru sekvenci ABI 7700 (Applied Biosystems). PCR amplifikacija je izvedena u ukupnom volumenu od 25 ul koji sadrži 12,5 ul 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 6,25 ul vode bez nukleaze, 5 ul cDNA i 1,25 ul odgovarajućih početnica (IDT). Svi qPCR primeri (Tablica 1) dizajnirani su pomoću softvera Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research) kako bi se osigurala specifičnost i osjetljivost. Kako bismo kvantificirali razine mRNA, normalizirali smo ekspresiju ciljnih gena na gliceraldehid-3- fosfat dehidrogenazu. Relativne razine ekspresije mRNA izračunate su pomoću metode 2 − ΔΔCt i normalizirane su na razine ekspresije GAPDH.

2.6. Statistika.

Svi rezultati su srednja vrijednost ± SD od najmanje {{0}} miševa u svakoj skupini. Ili nespareni dvostrani test (podaci s normalnom distribucijom) ili Mann–Whitneyjev U test (podaci bez normalne distribucije) korišten je za usporedbu 2 grupe pomoću GraphPad Prism 5.0. Statistička značajnost izražava se na sljedeći način: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; i ns: nije značajno.

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop