Lamivudin poboljšava kognitivni pad kod SAMP8 miševa: integracija in vivo farmakološke evaluacije i mrežne farmakologije

Sažetak

Inhibitori reverzne transkriptaze kao što je lamivudin (3TC) igraju važnu ulogu uprotiv starenja, ali njihovi učinci naneurodegenerativne bolesti uzrokovane starenjemnisu jasni, posebno o funkcijamaživčani sustav kao što su spoznaja. U ovoj smo studiji davali 3TC miševima 8 (SAMP8) miševima s ubrzanim starenjem želučanom perfuzijom (100 mg/kg) tijekom 4 tjedna. Naši rezultati su pokazali da je 3TC značajno poboljšaostatus starenja SAMP8 miševa, posebice pad kognitivnih sposobnosti procijenjen Morrisovim testom vodenog labirinta. Za daljnje istraživanje molekularnih mehanizamapoboljšanje statusa starenjaSAMP8 miševa pomoću 3TC, qPCR i metode bojenja tkiva korištene su za proučavanje moždanog tkiva (tj. hipokampusa i korteksa) miševa, dok je mrežna farmakološka analiza primijenjena za istraživanje potencijalnih meta 3TC-a. Rezultati su pokazali da su razine mRNA gena povezane s dugo raspršenim elementom-1, odgovorom interferona tipa 1, fenotipom sekrecije povezanim sa starenjem iAlzheimerova bolestu hipokampusu i korteksu SAMP8 miševa povećani su zbogstarenje, ali ovaj je trend djelomično preokrenuo 3TC. Rezultati histoloških studija pokazali su da 3TC smanjuje smrt neurona hipokampusa, dok su rezultati mrežne farmakološke analize pokazali da 3TC može vršiti svoj utjecaj kroz više putova, uključujući signalizaciju estrogena i PI3K/Akt i signalne putove interakcije neuroaktivnog liganda i receptora, što smo potvrdili in vitro pokusima. Ovi nalazi dokazuju terapijski potencijal 3TC-a u liječenju neurodegenerativnih bolesti.

KLJUČNE RIJEČIstarenje, kognitivne sposobnosti, lamivudin, ljedan isprepleteni element-1, neurodegenerativne bolesti

Kineske biljke Cistanche Utjecaj naInhibitori reverzne transkriptaze za sprječavanje starenja

1|UVOD

Do danas, starenje i neurodegenerativne bolesti, kao što suAlzheimerova (AD) ili Parkinsonova bolestpovezani sa starenjem, u stalnom su porastu zbog globalnih demografskih promjena.1,2 kognitivni pad predstavlja ozbiljnu prepreku postizanju dugog i zdravog života. Desetljećima su uloženi znatni napori u traženje lijekova koji se mogu koristiti za liječenje kognitivne degeneracije sa starenjem.3 Posljednjih godina, dugo umetnuti element -1 (L1) privukao je sve veću pozornost kao potencijalni roman meta za proučavanje starenja.4 L1 pripada najzastupljenijoj obitelji retrotranspozona koji se ne ponavljaju na dugim terminalima s ~500000 kopija, što čini ~17 posto ljudskog genoma. Gen L1 sastoji se od operona s dva otvorena okvira čitanja (ORF1 i ORF2), od kojih su oba potrebna za retrotranspoziciju.5-7 ORF1 kodira protein (ORF1p) s aktivnostima reverzne transkriptaze koji se može inhibirati analozima nukleozida, kao što je lamivudin (2'-3'-deoksi-3'-tiocitidin, 3TC).8

Aktivni L1 može sintetizirati cDNA izvan kromatina i zatim je ponovno umetnuti u genom kataliziran ORF1p, u konačnici mijenjajući ekspresiju drugih gena i rezultirajući bolestima povezanim s genomskom nestabilnošću.9,10 Domaćin općenito inhibira transpozibilnu aktivnost L1 kroz niz regulacija, poput epigenetske modifikacije i regulacije ograničavajućeg faktora domaćina.11,12 Transpozicija L1 općenito se događa samo u zametnim stanicama ili stanicama raka, dok su nedavne studije pokazale da je L1 također vrlo aktivan u središnjem živčanom sustavu ili stanicama koje stare, iako neuralni mehanizmi koji leže u pozadini L1 su nejasni.13 Studije su pokazale da su čimbenici (npr. TREX1, RB1 i FOXA1) povezani s mehanizmom praćenja L1 nefunkcionalni u staničnom starenju, što rezultira aktivacijom L1. TREX1 je 3' egzonukleaza koja razgrađuje strane invazivne DNA i njezin gubitak je povezan s nakupljanjem citoplazmatske L1 cDNA.14 Pokazalo se da se RB1 veže na repetitivne elemente, uključujući elemente L1, i potiče njihovu heterokromatinizaciju.15 A FOXA1 je pojačano reguliran u senescentnim stanicama13 i vezan za središnje područje L1 5' UTR. Aktivirani L1 dalje aktivira odgovor interferona tipa I (IFN-I), koji izaziva upalu putem reverzne transkripcijske cDNA i održava fenotip sekrecije povezan sa starenjem (SASP). Stoga, kao važan čimbenik u aseptičkoj upali uzrokovanoj starenjem, L1 se smatra važnom metom za liječenje bolesti povezanih sa starenjem. U starijih miševa liječenih 3TC-om, akumulacija upalnih čimbenika poboljšana je inhibicijom izvanstanične transkripcije L1 u mišićnom i drugim tkivima.16 Do danas su rijetka istraživanja učinaka inhibitora reverzne transkriptaze na funkcije živčanog sustava. Nedavno su tisuće varijanti genomske cDNA (gencDNA) pronađene u mozgovima preminulih pacijenata s AD-om, a rezultat su ponovnog umetanja karakterističnih varijanti spajanja RNA u genom.17 Ovaj se fenomen smatra važnim uzrokom AD-a. Čimbenici koji uzrokuju stvaranje gencDNA uključuju transkripciju, uništavanje DNA, reverznu transkriptazu i starenje.

Studije su pokazale da je proces stvaranja gencDNA blokiran korištenjem nukleozidnih inhibitora reverzne transkriptaze u staničnoj liniji jajnika kineskog hrčka (CHO) s endogenim aktivnostima reverzne transkriptaze.19 Nadalje, pacijenti s AIDS-om stariji od 65 godina koji su uzimali inhibitore reverzne transkriptaze dugo vremena rijetko razvija AD.20 Stoga nagađamo da bi 3TC, kao inhibitor reverzne transkriptaze, mogao biti potencijalni lijek za liječenje kognitivnih oštećenja i neurodegenerativnih bolesti uzrokovanih starenjem. Pokazalo se da senescence-accelerated prone 8 (SAMP8) miševi, kao model za proučavanje ljudskog starenja i bolesti povezanih sa starenjem, pokazuju mnoge značajke za koje se zna da se javljaju u ranim fazama neurodegenerativnih bolesti, kao što su povećani oksidativni stres, neuroupala i kognitivni poremećaji. 21 Stoga su u ovoj studiji SAMP8 miševi odabrani kao idealan životinjski model za neurodegenerativne bolesti uzrokovane starenjem. Usredotočili smo se na kognitivne učinke 3TC-a na prerano starenje miševa i molekularne putove povezane sa starenjem, pružajući dokaze o ulozi inhibitora reverzne transkriptaze u liječenju neurodegenerativnih bolesti uzrokovanih starenjem. Nadalje smo primijenili metodu mrežne farmakologije za predviđanje ciljeva 3TC-a, konstrukciju mreža i analizu bioloških funkcija i putova povezanih s 3TC-om.

2|EKSPERIMENTALNI DIO 2.1 |

Životinje 44-tjedne stari mužjaci SAMP8 i srodni mišji R1 s normalnim ubrzanim starenjem (SAMR1) koje je osiguralo Tianjinsko sveučilište tradicionalne kineske medicine korišteni su nakon 1-tjednog perioda aklimatizacije. Protokol pokusa na životinjama odobrio je Odbor za etiku životinja pokrajinske bolnice Shandong, a proveden je na temelju Vodiča Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) za brigu i korištenje laboratorijskih životinja. Miševi su držani u autoklaviranim kavezima i davana im je sterilna hrana i voda. Svaki dan su bilježene tjelesne težine miševa. Dijagram toka eksperimenata provedenih u ovoj studiji dan je na slici 1A. Nakon završetka pokusa, miševi su eutanazirani inhalacijom dietil etera.

2.2|Priprema i tretman 3TC

Lijekovi su svježe pripremljeni na dan svakog eksperimenta. 3TC kupljen od MCE (Šangaj, Kina) otopljen je u DMSO do konačne koncentracije od 2 mmol/L. Osnovna otopina je zatim razrijeđena do radne koncentracije vodom za piće s konačnom koncentracijom DMSO manjom od 0.1 posto. Ustanovljene su tri skupine miševa: kontrolna skupina tretirana otopinom nosača (voda za piće), testna skupina tretirana s 3TC i skupina SAMR1 koja je primila nosač korišten kao druga kontrolna skupina za starenje. Ispitna skupina je oralno primala 3TC u dozi od 100 mg/kg na dan. Svi miševi su hranjeni intragastričnom primjenom tijekom 4 tjedna (Slika 1B).

SLIKA 1. Eksperimentalni dizajn i učinci 3TC-a na poboljšanje relativnog gubitka težine zbog starenja i ocjene starenja. (A) Dijagram toka farmakoloških eksperimenata za proučavanje učinka 3TC na kognitivnu sposobnost SAMP8 miševa. (B) Shematski prikaz rasporeda pokusa na životinjama. (C) Konceptualni tijek rada za predviđanje interakcija lijek-cilja pomoću Pharmmappera koji prikazuje, slijeva na desno, molekularnu strukturu 3TC-a, 3D strukturni dijagram 3TC-a i model farmakofora predviđen s 3TC-om koji se veže na estrogenski receptor s najvišom normaliziranom prikladni rezultati. (D) Obrazac rasta tjelesne težine u svakoj skupini miševa. (E) Promjene u ocjenama ocjenjivanja prije i nakon liječenja 3TC-om. SAMR1 plus nosač: 44-tjedne stari SAMR1 miševi tretirani nosačem 4 tjedna. SAMP8 plus Vehicle: 44-tjedne stari SAMP8 miševi tretirani nosačem 4 tjedna. SAMP8 plus 3TC: 44-tjedne stari SAMP8 miševi 3TC-liječeni 4 tjedna. Studentov t-test: *p < 0.05, **p < 0.01 i ***p < 0.001. ns: nema statističke značajnosti. Crne zvjezdice predstavljaju usporedbu sa skupinom vozila SAMR1 plus. Crvene zvjezdice predstavljaju usporedbu sa skupinom vozila SAMP8 plus. Plava linija označava skupinu SAMP8 plus 3TC u dobi od 44 i 48 tjedana.

2.3|Sustav ocjenjivanja

Stupanj starenja kod miševa procijenjen je korištenjem prethodno opisanog sustava ocjenjivanja.22 Svaka kategorija rezultata sadrži pet razina, u rasponu od 0 do 4, s najvišim rezultatom stupnja koji označava najviši stupanj starenja životinje. . Bodove za svaku kategoriju zasebno su procijenila četiri iskusna eksperimentatora koji su bili slijepi za uvjete liječenja (dodatna tablica S1).

.2.4|Morrisov test vodenog labirinta

Studije Morrisovog vodenog labirinta provedene su prema Morrisovom protokolu, uključujući eksperiment orijentacijske navigacije i ispitivanja sondama.23 Vodeni labirint bio je kružni bazen (promjera 120 cm opremljen platformom promjera 10 cm) i ispunjen vodom na 25 ± 1 stupanj. Miševi su bili istrenirani da pronađu platformu ispod površine vode unutar jedne minute. Ako miš nije pronašao platformu unutar 60 s, odveden je do platforme i dopušteno mu je da ondje ostane 20 s. Svaki od miševa je treniran pet puta dnevno, a svaki je bio odvojen jedan od drugog 15 minuta. U svakom pokusu početna pozicija bila je drugačija, pseudoslučajnim redoslijedom. Šestog dana testa platforma je uklonjena i životinja je ušla u vodeni labirint s točke nasuprot kvadranta labirinta gdje se platforma nalazila tijekom treninga i dopušteno joj je istraživati ​​labirint 60 s. Put plivanja i vrijeme koje su miševi proveli tražeći labirint snimljeni su video kamerom i analizirani pomoću EthoVision XT (Noldus Software). Svaka skupina sastojala se od najmanje osam životinja.

2.5|Ekstrakcija RNK i kvantitativni PCR

Ukupna RNA ekstrahirana je iz hipokampalnog i kortikalnog tkiva miševa nakon tretmana pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen) prema protokolu proizvođača. Svaki RNA uzorak (1 ug) je obrnuto transkribiran da bi se stvorila cDNA korištenjem cDNA Reverse Transcription Kit (Takara) i zatim PCR-amplificiran korištenjem TaKaRa Taq Kita (Takara). Kompleti primera opisani su u Dodatnoj tablici S2.

2.6|Priprema tkiva

Životinje su anestezirane dietil eterom, a njihovi mozgovi su sakupljeni nakon transkardijalne perfuzije fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) i 4-postotnom otopinom paraformaldehida. Tkiva mozga su uklonjena i fiksirana u paraformaldehidu preko 2 dana. Fiksirani mozgovi su ugrađeni u parafin s tkivom hipokampusa izrezanim u debljini od 5 μm.

2.7|Bojanje hematoksilinom i eozinom (H & E).

Morfologija mozga analizirana je metodama bojenja hematoksilinom i eozinom (H & E). Parafinske sekcije hipokampalnog tkiva deparafinizirane su i dehidrirane gradijentom alkohola niza koncentracija. Bojanje HE provedeno je korištenjem kompleta za bojenje H & E (Solarbio) prema uputama proizvođača. Nakon uranjanja u etanol i ksilen, rezovi su obloženi smolom i promatrani pod svjetlosnim mikroskopom (Olympus).

2.8|Nisslovo bojenje

Metoda bojenja po Nisslu (Biyuntian) korištena je za otkrivanje neuronske ozljede na dijelovima tkiva hipokampusa. Sekcije su inkubirane s Nissl bojom 30 minuta i isprane s 95 postotnim etanolom. Obojene stanice su izbrojane i fotografirane pod svjetlosnim mikroskopom (Olympus). Stanice su prebrojane na tri nasumično odabrana polja koja se ne preklapaju u svakom stakalcu tkiva hipokampusa s indeksom preživljenja definiranim kao broj preživjelih neurona/ukupni broj neurona.

2.9|TUNEL bojenje

Sekcije tkiva hipokampusa inkubirane su s otopinom proteinaze K 15 minuta nakon čega je uslijedila inkubacija s reakcijskom smjesom TUNEL (Beyotime). Nakon ispiranja tri puta s PBS-om, sekcije su montirane s otopinom za montiranje koja je sadržavala nuklearnu boju DAPI i promatrane korištenjem ili konvencionalnog fluorescentnog mikroskopa ili konfokalnog laserskog fluorescentnog mikroskopa.

2.10|Izgradnja ciljane baze podataka 3TC-a

Ciljana baza podataka 3TC-a konstruirana je na temelju dvije baze podataka. Prvo, potencijalni ciljevi 3TC-a identificirani su korištenjem obrnute farmakodinamičke mape gena temeljene na Pharmmapper bazi podataka (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Chembiodraw je sve kemijske komponente pretvorio u format '.mol2' i učitao u bazu podataka Pharmmapper (Slika 1C). Molekule s normaliziranim fit rezultatom većim od 4.0 identificirane su kao potencijalne mete 3TC-a. Drugo, baza podataka ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) korištena je za ispitivanje bioloških aktivnosti meta ili spojeva. Proteini za koje je potvrđeno da potječu iz Homo sapiensa identificirani su kao potencijalne mete 3TC-a.

2.11|Analiza interakcije ciljnih proteina i izgradnja mreže

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 odabrani su u dizajniranoj postavci nakon uklanjanja duplikata.

Kako bi se sveobuhvatno istražili molekularni mehanizmi 3TC-a, PPI mreže su konstruirane korištenjem softvera Cytoscape verzije 3.6.0.(http://www.cytoscape.org/). Analiza stupnja čvorova provedena je s programom Centiscape 2.2 (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape) kako bi se pregledali geni čvorišta u mrežama s vrijednošću centralne blizine, središnje vrijednosti između i središnje vrijednosti stupnja postavljene na {{6 }}.2, 450 i 50, redom.

2.12|Obogaćivanje i probir signalnih putova za 3TC

Analiza obogaćivanja genske ontologije (GO) biološkim procesima, staničnim komponentama i molekularnim funkcijama potencijalnih meta provedena je za označavanje bioloških funkcija na temelju DAVID bioinformatičke baze podataka (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). Metabolički putovi KEGG-a označeni su na temelju baza podataka Kyoto enciklopedije gena i genoma (KEGG) pomoću internetskog poslužitelja za automatske bilješke KEGG-a (http://www.genome.jp/ kegg/)

2.13|Vezanje 3TC-a na predviđene ciljeve

Datoteke SDF strukture spoja 3TC dobivene su na web stranici Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). SDF datoteka je pretvorena u PDB datoteku softverom OpenBabel2.3.2, a receptorski proteini ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) i EGFR (PDBID:6S9C) dobiveni su iz baze podataka Protein Data Bank (www.wwpdb .org). Softver PYMOL2.3.4 korišten je za uklanjanje vode i liganda iz receptorskih proteina. Studija spajanja provedena je pomoću AutoDock Vina (1.1.2), softvera za molekularno spajanje otvorenog koda koji je razvio Scripps. Softver Tools korišten je za modificiranje četiri proteina receptora, a naredba Grid Box u programu Grid korištena je za otvaranje alata Grid Option za analizu svakog proteina receptora. Razmak rešetke postavljen je na 1, a središte džepa postavljeno je kao središte mjesta vezivanja.

2.14|Kultura stanica i liječenje

Stanične linije mišjih hipokampalnih neurona HT22 kupljene su od Shanghai Cell Biotechnology Company. HT22 stanice su uzgajane u DMEM-u s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS). Stanice su nasađene u 6-pločice s jažicama 1 dan prije eksperimentalnih tretmana. Starenje stanica potaknuto je formaldehidom (FA), kupljenim od Sigma-Aldricha, kao što je prethodno opisano.24 HT22 stanice su podijeljene u tri skupine, uključujući FA skupinu tretiranu s 30 µmol/L FA tijekom 24 sata, FA/3TC skupina tretirana s 30 µmol/L FA i 50 µmol/L 3TC, a kontrolna skupina uzgajana bez FA ili 3TC.

2.15|Imunofluorescencija i mikroskopija

Medij je uklonjen, a stanice su fiksirane pomoću 2 postotne otopine paraformaldehida 1 sat na sobnoj temperaturi. Eksperiment imunofluorescencije proveden je kao što je prethodno opisano.25 Antitijela korištena u ovoj studiji uključivala su anti-LINE-1 ORF1p antitijela (1:1000; Sigma-Aldrich) sa Alexa Fluor 594 sekundarnim antitijelima (1:1000; Invitrogen) . Stanice su inkubirane s DAPI (1:500 razrjeđenje; Thermo Fisher Scientific) 1 minutu da se obilježe jezgre. Nakon što je dodano sredstvo za prigušivanje fluorescencije, stanice su promatrane pomoću konfokalnog mikroskopa (Nikon). 2.16|Western blot analiza

Ekspresije EGFR, p-AKT1 (aktivni Akt1: fosforiliran na S473) i ADRB2 mjerene su Western blot analizom. Ukupni protein je sakupljen iz stanica nakon različitih tretmana. Western blot je izveden kao što je prethodno opisano.26 Antitijela korištena u ovoj studiji uključivala su anti-EGFR antitijela (1:500; Sigma-Aldrich), anti-pAKT1 antitijela (1:1000; Sigma-Aldrich) i anti-ADRB2 antitijelo (1:200; Sigma-Aldrich) sa anti-zečjim sekundarnim antitijelom (1:1,000; Invitrogen). Nakon ispiranja, mrlje su razvijene s ECL Western blotting detekcijskim sustavom (Amersham, Aylesbury, UK).

2.17|Analiza podataka i statistika

Svaki eksperiment ponovljen je najmanje tri puta i smatran je valjanim, a ispitivanja su pokazala slične rezultate. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Značajna razlika određena je ili Studentovim t-testom s p < 0.05.

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950