Nedostatak Klotho pojačava ekspresiju IFN-a/induciranu hipoksijom putem regulacije RIG-I u bubrezima
Mar 25, 2022
Sažetak Hipoksija je uobičajeni put do progresije završnog stadijabolest bubrega.Gen I (RIG-I) inducibilan retinoičnom kiselinom kodira RNA helikazu koja prepoznaje viruse uključujući SARS-CoV2, koji je odgovoran za proizvodnju interferona (IFN)-a/ za sprječavanje širenja virusne infekcije. Nedavno je pronađena aktivacija RIG-1 u uvjetima hipoksije, a pokazalo se da nedostatak klotha pojačava aktivaciju RIG-I u mozgu miševa. Međutim, uloga ovih funkcija u bubrežnoj upali ostaje nedokučiva. Ovdje je, za in vitro studiju, ekspresija RIG-I i IFN-a/ ispitivana u normalnog štakorabubreg(NRK)-52E stanice inkubirane u hipoksičnim uvjetima (1 posto O2). Zatim je siRNA koja cilja RIG-I ili šifrirana siRNA transficirana u NRK52E stanice kako bi se ispitala ekspresija RIG-I i IFN-a/ß u uvjetima hipoksije. Također smo istražili razine ekspresije RIG-I i IFN-a/ kod 33 čovjekabubreguzorci biopsije s dijagnozom lgA nefropatije. Za studiju Vivo, inducirali smo bubrežnu hipoksiju stezanjem bubrežne arterije na 10 minuta kod divljeg tipa miševa (WT miševi) i Klotho-knockout miševa (KIT/miševi). Inkubacija u hipoksičnim uvjetima povećala je ekspresiju RIG-lI i IFN-a/ u stanicama NRK52E. Njihova je regulacija inhibirana u NRK52E stanicama transficiranim siRNA koja cilja RIG-I. U bolesnika s IgA nefropatijom, imunohistokemijsko bojenje uzoraka biopsije bubrega pokazalo je da je ekspresija RIG-I u korelaciji s onom IFN-a/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively).="" the="" expression="" levels="" of="" rig-i="" and="" ifn-a/β="" were="" upregulated="" in="">bubregahipoksičnih WT miševa, a daljnja regulacija opažena je kod hipoksičnih miševa. Ovi nalazi sugeriraju da hipoksija inducira ekspresiju IFN-a/ preko regulacije RIG-I i da nedostatak kloto pojačava tu ekspresiju induciranu hipoksijom ububrega.
Ključne riječi:bolest bubrega; stanice bubrega; nadomjestak bubrega; oštećenje bubrega; bubreg
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
UvodKroničnobolest bubrega(CKD) zahvatilo je 697,5 milijuna ljudi diljem svijeta u 2017. [1], pa je dobro prepoznato kao veliki zdravstveni problem. Kako bi se usporilo napredovanje CKD-a, u kliničkim se uvjetima koriste inhibitori puta renin-angiotenzin-aldosteron sustava (RAAS) [2,3]. Međutim, njihovi su korisni učinci ograničeni i mnogim je bolesnicima na kraju potrebna nadomjesna bubrežna terapija[4]. Patološki, kronična upala i intersticijska fibroza zajedničke su značajke KBB-a, neovisno o primarnoj bolesti [5]. Iako transformirajući čimbenik rasta (TGF)- 1 igra ključnu ulogu u razvoju intersticijske fibroze [6-8], prethodne su studije pokazale da je infiltracija upalnih stanica odgovorna za proizvodnju TGF-a{{12} } [9]. Ovi nalazi sugeriraju da je upala uzvodni događaj intersticijske fibroze i da je upala kandidat za terapijsku metu za CKD.
Hipoksija je stanje u kojem nedovoljno kisika ulazi u tkiva. Kao stanični odgovor na hipoksiju, faktori inducirani hipoksijom (HIF) igraju važnu ulogu u sprječavanju oštećenja tkiva [10-12]. Međutim, teška hipoksija dovodi do akutnih vaskularnih bolesti, kao što su moždani udar [13], angina pektoris [14] i bolest perifernih arterija [15]. Nedavno je objavljeno da kronična hipoksija, poput apneje za vrijeme spavanja, također pridonosi razvoju raznih bolesti [16]. Što se tičebubreg, hipoksija se navodno pojačava s progresijom stadija kronične bubrežne bolesti i trenutno se smatra uobičajenom patofiziologijom koja vodi do krajnjeg stadijabolest bubrega[17]. Kao što je gore spomenuto, upala se smatra uzvodnim događajem, tako da mehanizam kojim hipoksija izaziva upalu treba razjasniti na molekularnoj razini. Upalu karakteriziraju bol, toplina, crvenilo, oteklina i gubitak funkcije[18]. Međutim, u osnovi djeluje na uklanjanje početnog uzroka ozljede stanica i čišćenje nekrotičnih stanica i oštećenog tkiva. U svakom slučaju, upala nije specifičan odgovor, te se smatra da urođeni imunitet uglavnom sudjeluje u inicijalnom procesu upale kroz proizvodnju interferona (IFN)- / [19]. Među čimbenicima koji su uključeni u urođeni imunitet, gen I (RIG-I) koji je induciran retinoičnom kiselinom odgovoran je za imunološke odgovore na virusne infekcije[20]. Naime, nedavne studije su pokazale da hipoksija pojačava ekspresiju RIG-I u mozgu i jetri, što rezultira proizvodnjom IFN-/ [21,22]. Međutim, uloga hipoksije u RIG-I-posredovanoj ekspresiji IFN-/B ububregostaje nedostižan.
Klotho je prvi put zabilježen kao protein protiv starenja [23]. Doista, miševi s nedostatkom klotha pokazuju skraćeni životni vijek praćen fenotipovima koji podsjećaju na ljudsko starenje. Nasuprot tome, klotho transgeni miševi pokazuju produljeni životni vijek [24]. Što se tiče renoprotektivnih učinaka, utvrđeno je da nedostatak klothoa pojačava oštećenje bubrega u eksperimentalnim modelima bubrežnih bolesti, dok ga prekomjerna ekspresija ili primjena klotho proteina ublažava [25]. Klotho protein postoji u tri oblika: membranski, izlučeni i intracelularni koto. Među njima, unutarstanični klotho navodno potiskuje ekspresiju RIG-I zajedno s upalom [26], povećavajući mogućnost da nedostatak klotho pogoršava regulaciju RIG-I i IFN-a izazvanu hipoksijom.bubrega.Ovi su nas nalazi doveli do hipoteze da se ekspresija RIG-I i IFN- / povećala u uvjetima hipoksije u staničnoj liniji stanica bubrežnih tubula i da je njihova regulacija izazvana hipoksijom pojačana u klotho-knockout miševa (KI-7 miševi). U ovoj studiji pokazujemo da hipoksija pojačava RIG-I kao i IFN-a/ u normalnih štakorabubregstanice (NRK-52E) i mišji bubrezi. Također pokazujemo da je RIG-I odgovoran za povišenu regulaciju IFN-c/B izazvanu hip-oksijom.bubregU uzorcima pacijenata kojima je dijagnosticirana IgA nefropatija, utvrđena je pozitivna korelacija ekspresije RIG-I s IFN-/. Na kraju, hipoksijom inducirana pojačana regulacija RIG-I i IFN-/ pojačana je u KI-/- miševa. Ovi nalazi sugeriraju da nedostatak klothoa pojačava ekspresiju IFN-/ izazvanu hipoksijom kroz regulaciju RIG-I ububrega.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA
Materijali i metode ŽivotinjeMuški C57BL/6J miševi divljeg tipa (WT) (stari 8 tjedana i teži 20-25 g) dobiveni su iz Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan). Muški miševi (stari 6 tjedana i teški približno 15 g) kupljeni su od CLEA Japan, Inc. Miševi su smješteni u Institutu za laboratorijske životinjske znanosti Sveučilišta Hirošima (Hirošima, Japan), kao što je prethodno opisano [27]. Sve pokuse odobrio je Odbor za institucionalnu skrb i korištenje životinja Sveučilišta Hiroshima (brojevi dozvola: A19-158 i 2019-156) i izvedeni su u skladu sa Smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) o korištenju laboratorijskih životinja. WT i KI-' miševi podijeljeni su u kontrolnu skupinu ili skupinu hipoksije (n=5 u svakoj skupini). Stanja hipoksije izazvana su stezanjem lijeve bubrežne arterije na 10 min pod općom anestezijom (0,3 mg/kg medetomidina, 4 mg/kg midazolama i 5 mg/kg butorfanola)[28]. Miševi u kontrolnoj skupini bili su podvrgnuti lažnoj operaciji koja je bila ista procedura kao i kod miševa u skupini s hipoksijom, osim što nije bilo podvezivanja arterija. Nakon 10 minuta hipoksije, miševi su eutanazirani punkcijom srca i njihovibubregabili ubrani. Hipoksijabubregpotvrđeno je Western blotingom za ekspresiju eritropoetina (Sl. S1).
Kultura stanicaNormalni štakorbubreg(NRK)-52E stanice su kupljene od American Type Culture Col. lection (Manassas, VA, SAD).NRK-52E stanice su uzgajane u RPMI-1640mediju koji je sadržavao 10 posto fetalnog goveđi serum (FBS) (Nichirei Bioscience, Tokio, Japan) i penicilin/streptomicin (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Ove su ćelije posađene u posude s kulturom od 10 cm. Nakon rasta do subkonfluencije, stanice su inkubirane u 1 postotnoj O2 modularnoj inkubatorskoj komori (MIC 101; Billups-Rothenberg, San Diego, CA, SAD) 30, 60, 90 i 120 minuta. Lizati cijelih stanica su pripremljeni i podvrgnuti na Western blot analizu. Hipoksija NRK-52E stanica potvrđena je Western blotingom za ekspresiju HIF-1 (S2 Slika).
Transfekcija RIG-I siRNAStanice NRK52E transficirane su s 20 nM siRNA ciljane na RIG-I (RSS311418: Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) ili siRNA s negativnom kontrolom (4390843; Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD) pomoću reagensa za transfekciju Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) , u skladu s uputama proizvođača. Nakon 43-45 h, neke od ovih stanica su inkubirane u uvjetima hipoksije (1 posto O2) 30 minuta kako bi se procijenio RIG-I. Ostale stanice su promijenjene u svježi medij. Nakon 24 sata, te su stanice inkubirane pod hipoksičnim uvjetima (1 posto O2) 60 i 120 minuta da se potvrdi supresija IFN-a. Lizati cijelih stanica su pripremljeni i podvrgnuti Western blot analizi.
Western blot analizaPrikupljanje uzoraka i western blot provedeni su u skladu s prethodno opisanim metodama[29]. Zečja monoklonska anti-RIG-I antitijela (#3743S; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD), zečja poliklonalna anti-IFN- 11 antitijela (bs-7023R; Bioss Anti-Bodies, Woburn, MA, SAD), zečje poliklonsko anti-IFN-antitijelo (GTX37658; GeneTex, Irvine, CA, SAD), zečje monoklonsko anti-RIG-I antitijelo (=700366; Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD), zečje poliklonsko anti-IFN{15}} antitijelo (ab193055; Abcam, Cambridge, UK), zečje poliklonsko anti-IFN-antitijelo (PA5-20390; Invitrogen), štakorsko monoklonsko anti-humano klotho antitijelo (KO603; TransGenic, Fukuoka , Japan), korištena su mišja monoklonska anti- -aktinska antitijela (A5316; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i mišja monoklonska anti- -tubulinska antitijela (T9026; Sigma-Aldrich). kao primarna antitijela. Kao sekundarna protutijela korišteni su kozji anti-zečji imunoglobulin G (Dako, Glostrup, Danska) i kozji anti-mišji imunoglobulin G (Dako) konjugirani s peroksidazom hrena. Za detekciju signala korišteni su SuperSignal West Dura i Pico sustav (Thermo Fisher Scientific). Intenzitet svake trake izmjeren je softverom ImageJ (verzija 1.47y; Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, MD, SAD) i normaliziran na razinu -aktina ili -tubulina.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI
Imunohistokemijska analiza tkiva mišjeg bubregaImunohistokemijsko bojenje provedeno je u skladu s prethodno opisanim metodama [27]. Kao primarna protutijela primijenjeni su sljedeći proizvodi: zečje monoklonsko anti-RIG-I protutijelo (#700366; Invitrogen), zečje poliklonsko anti-IFN- 2 protutijelo (ab193055; Abcam), zečje poliklonsko anti-IFN- protutijelo ( PA5-20390; Invitrogen), i štakorska monoklonska anti-humana klotho antitijela (KO603; TransGenic).RIG-I-,IFN-a/-, i klotho-pozitivna područja kvantificirana su kao prosjek 20 nasumično odabranih polja s ImageJ softver.
Prikupljanje kliničkih uzoraka i etička izjavaUzorci bubrega dobiveni su biopsijom bubrega u Sveučilišnoj bolnici u Hirošimi između kolovoza 2014. i studenog 2016. od 33 pacijenta kojima je dijagnosticirana IgA nefropatija. Ovo istraživanje pridržavalo se načela sadržanih u Helsinškoj deklaraciji i odobrilo ga je Etičko povjerenstvo Sveučilišta u Hirošimi (E-1718). Informirani pristanak dobiven je u obliku isključivanja na web stranici (httns:/inzounaika Hiroshima-uaciplresearchl opt out.html).
Imunohistokemijska analiza tkiva bubrega čovjekaImunobojenje je provedeno u skladu s prethodno opisanim metodama [27]. Korištena su sljedeća primarna protutijela: zečje monodonalno anti-RIG-I protutijelo (#700366; Invitrogen), mišje monoklonsko anti-IFN- protutijelo (sc-373757; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) i zečje poliklonska anti-IFN-protutijela (PA5-20390; Invitrogen), RIG-I- i IFN-a/ -pozitivna područja kvantificirana su kao prosjek pet nasumično odabranih polja pomoću softvera Image].
Statistička analizaRezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Korelacije su izračunate korištenjem univarijatne regresijske analize. Za višestruke usporedbe koristili smo jednosmjernu analizu varijance (ANOVA) nakon koje je slijedio Studentov t-test s Bonferronijevom korekcijom. Razlike između dviju skupina analizirane su Studentovim t-testom.P<0.05 was="" considered="" as="" statistically="">
Rezultati:Hipoksija pojačava RIG-I i IFN-a/ u staničnoj liniji bubrežnih epitelnih stanica štakoraKako bismo identificirali učinak hipoksije na ekspresiju RIG-I i IFN-a/ in Vitro, proveli smo Western blot analizu za ove proteine u NRK-52E stanicama uzgojenim u uvjetima hipoksije. Razina proteina RIG-I dosegla je vrhunac nakon 30 minuta, a zatim se postupno smanjivala u NRK-52E stanicama pod hipoksičnom stimulacijom （Slika 1A）. Razine IFN- /ß porasle su i dosegle vrhunac nakon 120, odnosno 60 minuta, u NRK -52E stanice s hipoksičnom stimulacijom (Eig 1Band1C). Nokdaun RIG-I smanjuje ekspresiju IFN-a/ u NRK52E stanicama s hipoksijom. Kako bismo procijenili sudjeluje li RIG-I u ekspresiji IFN-/ u hipoksičnim uvjetima, istražili smo njihovu ekspresiju u NRK-52E stanicama transficiranim s RIG-I siRNA ili negativno
kontrola siRNA. Prvo smo potvrdili nokdaun učinak RIG-siRNA u NRK-52E stanicama. Western blotting za RIG-I otkrio je da RIG-I siRNA smanjuje ekspresiju RIG-I u NRK-52E stanicama sa ili bez hipoksične stimulacije (Eig 2A). Zatim smo istražili ulogu regulacije RIG-a uzrokovane hipoksijom -I u ekspresiji IFN- /B u NRK-52E stanicama pomoću RIG-I siRNA ili negativne kontrole. RIG-siRNA potisnula je ekspresiju IFN- / u NRK-52E stanicama (Eig2Band2C).
RIG-I korelira s razinama ekspresije IFN- / u uzorcima ljudskih bubrega IgA nefropatijeIspitali smo je li razina ekspresije RIG-I povezana s IFN-a/ u uzorcima biopsije bubrega dobivenih od pacijenata s IgA nefropatijom (n=33). Detaljne kliničke karakteristike ovih pacijenata prikazane su u tablici S1. Imunohistokemijsko bojenje za RIG-I i IFN-/ otkrilo je njihovu ekspresiju u glomerulima i bubrežnim tubulima (Slika 3A) i pokazalo da je RIG-I u pozitivnoj korelaciji s IFN-o/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively)(eig="">
Hipoksija ne mijenja razinu ekspresije klothoa u WT i K1-/ miševaKako bismo odredili učinak hipoksične stimulacije na klotho ekspresiju in vivo, istražili smo njegovu ekspresiju u WT i K-/miševima sa ili bez 10 minuta hipoksične stimulacije. Western blotting i imunohistokemijsko bojenje otkrili su da se klotho ekspresija nije razlikovala između WT miševa sa i bez hipoksije i da klotho ekspresija nije uočena u KIT/miševima bez obzira na prisutnost ili odsutnost hipoksične stimulacije (Eig 4A i 4B). U WT miševa, klotho protein je obojen u citoplazmi tubularnih stanica (Slika 4B).Ekspresija RIG-I pojačana je pod hipoksičnim uvjetima u K-miševima.Intracelularni klotho navodno daje sposobnost suzbijanja upale posredovane RIG-I, pa smo ispitali razinu ekspresije i lokalizaciju RIG-I u hipoksičnimbubregaWT i Kl−/− miševa. Western blotting otkrio je da se ekspresija RIG-I povećala u WT miševa s hipoksičnom stimulacijom i da je pojačana u Kl-/− miševa (Slika 5A). Imunohistokemija je pokazala da se RIG-I-pozitivna površina povećala u Kl−/− miševa, što je bilo slično rezultatima dobivenim Western blotingom (Slika 5B).
IFN- je pojačano reguliran u uvjetima hipoksije u KI--miševaKako bismo identificirali učinke hipoksije na ekspresiju -a u wvo, ispitali smo razinu njegove ekspresije i lokalizaciju u hipoksičnih WT i KI-miševa. Western blotting je otkrio da se ekspresija IFN-a povećala u WT miševa s hipoksičnom stimulacijom i da je dodatno regulirana naviše u miševa (Slika 6A). Imunohistokemijsko bojenje također je otkrilo da je IFN- -pozitivno područje uglavnom primijećeno u tubularnim stanicama i da je razina ekspresije IFN-a pokazala istu tendenciju kao u Western blottingu (Slika 6B).
IFN- je povećan u uvjetima hipoksije u K1T-/miševaUz IFN-c, ispitali smo razinu ekspresije i lokalizaciju IFN-Bin hipoksičnih WT i miševa. Iz rezultata Western blottinga, ekspresija IFN-a se povećala u WT miševa s hipoksičnom stimulacijom, dok je daljnji porast primijećen u KIT/miševima (Slika 7A). Nakon kvantificiranja IFN- -pozitivnog područja, razina ekspresije IFN-a povećala se u KI-/- miševa u usporedbi s WT' miševima (Slika 7B).
opaženo u Kl−/− miševa bez obzira na prisutnost hipoksične stimulacije. Pokazali smo da je bubrežna hipoksija povećala ekspresiju RIG-I i IFN-/ i da je njihova ekspresija dodatno pojačana u Kl−/− miševa. Ovi nalazi upućuju na to da nedostatak klothoa pojačava ekspresiju RIG-I izazvanu hipoksijom, što dovodi do povećanja IFN-/. Identificirali smo ekspresiju RIG-I i IFN-/ izazvanu hipoksijom u studijama in vitro i in vivo. Kako bi se prilagodio uvjetima hipoksije, HIF se stabilizira i funkcionira kao faktor transkripcije [30]. U prethodnoj studiji objavljeno je da je RIG-I uključen u HIF-inducibilne molekule. Međutim, nismo mogli identificirati da je RIG-I nizvodni efektor HIF-a. Uz infekciju virusom, ekspresija RIG-I se povećava u uvjetima hipoksije [31]. Iako su prethodne studije izvijestile da hipoksija utječe na tubularne epitelne stanice, endotelne stanice, pericite, fibroblaste, upalne stanice i progenitorske stanice u bubrezima [32,33], pokazujemo da je pojačana regulacija RIG-I uglavnom opažena u tubularnim epitelnim stanicama u miševa uz hipoksičnu stimulaciju, kao i kod bolesnika s IgA nefropatijom. Budući da se bubrežni tubuli smatraju ulaznim mjestom transuretralnih patogena [34], RIG-I može igrati ključnu ulogu u imunološkom odgovoru tubularnih epitelnih stanica u uvjetima hipoksije. Urođeni imunološki odgovor aktiviraju ne samo mikroorganizmi, već i alarmni signali oštećenih, povrijeđenih ili stresiranih stanica [35]. U ovoj smo studiji pokazali da ekspresija RIG-I izazvana hipoksijom sudjeluje u proizvodnji IFN-/ u staničnoj liniji bubrežnih tubula štakora. Prikazani podaci sugeriraju da ekspresija RIG-I funkcionira kao urođeni imunološki sustav citosola kao odgovor na hipoksični stres kao i na virusnu infekciju. Prethodne studije opisale su da se hipoksija pojačava tijekom razvoja kronične bubrežne bolesti bez obzira na primarnu bolest i da hipoksija pridonosi progresiji oštećenja bubrega [17]. U kliničkoj studiji koja je koristila magnetsku rezonanciju ovisnu o razini oksigenacije krvi, bubrežna hipoksija ne samo da se pojačala tijekom progresije CKD-a, već je i predvidjela takvu progresiju [36]. Stoga se hipoksija trenutno smatra uobičajenim putem do progresije završnog stadijabolest bubrega, tako da bi upala izazvana hipoksijom trebala biti terapijski cilj za suzbijanje progresije CKD.
Pokazali smo da hipoksija inducira proizvodnju IFN-/, koji se klasificiraju kao interferoni tipa 1. Interferoni tipa 1 u osnovi djeluju tako da inhibiraju replikaciju virusa [37] i da se odupru imunosupresiji izazvanoj hipoksijom [21,22]. Međutim, dosadašnje studije pokazale su da interferoni tipa 1 dovode do aktivacije prirodnih stanica ubojica, igrajući važnu ulogu ne samo u uklanjanju stanica zaraženih virusom, već i u oštećenju tkiva [38]. Zapravo, prethodne studije su izvijestile da RIG-I doprinosi upali u različitim organima, kao što su pluća [39],bubreg[40], i živčani sustav [21]. U ovoj smo studiji također pokazali da je regulacija RIG-I izazvana hipoksijom odgovorna za proizvodnju IFN-/. Stoga interferoni tipa 1 mogu djelovati kao zaštita od infekcije u stanju hipoksije, ali bi bili štetni u nezaraženim uvjetima. Štoviše, prethodna studija je objavila da je, uz interferone tipa 1, RIG-I uključen u proizvodnju različitih citokina, kao što su IL-1, IL- 6 i TNF- [41]. Budući da ti citokini uzrokuju oštećenje tkiva, regulacija RIG-I izazvana hipoksijom može sudjelovati u progresiji CKD-a. Pokazali smo da nedostatak klothoa pojačava ekspresiju RIG-I izazvanu hipoksijom, što je popraćeno pojačanom regulacijom IFN-/. Klotho ekspresija se navodno smanjuje sa starenjem i progresijom CKD [42,43]. Stoga, ekspresija RIG-I može biti više regulirana u starijih osoba i bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti u uvjetima hipoksije, što dovodi do proizvodnje IFN-/. Kao što je gore spomenuto, kloto postoji u tri oblika — membranski, izlučeni i intracelularni kloto — pri čemu je potonji odgovoran za suzbijanje proizvodnje upalnih citokina posredovane RIG-I [26]. U smislu lokalizacije, pokazali smo da se ekspresija klotho uglavnom javlja u stanicama bubrežnih tubula, s dokazima da je ekspresija RIG-I uglavnom pojačana u stanicama bubrežnih tubula u hipoksičnim uvjetima. Ovi nalazi sugeriraju da smanjena razina klotho ekspresije doprinosi pojačanoj RIG-I posredovanoj proizvodnji interferona tipa 1 u uvjetima hipoksije.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLOVE BUBREGA/BUBREGA
Ukratko, pokazali smo da hipoksična stimulacija inducira RIG-I i IFN-/ u mišjim bubrezima i staničnoj liniji bubrežnih tubularnih stanica štakora, te da je RIG-I bio uključen u regulaciju IFN-/ in vitro in vitro izazvanu hipoksijom. U uzorcima biopsije bubrega pacijenata s IgA nefropatijom, ekspresija RIG-I korelirala je s regulacijom IFN-/. Na kraju, hipoksijom inducirana ekspresija RIG-I pojačana je u klotho-nockout miševa, zajedno s regulacijom IFN-/. RIG-I-posredovana ekspresija interferona tipa 1 povećala se u hipoksičnim uvjetima, a daljnja regulacija opažena je u stanju klotho regulacije. Prema kliničkim studijama, hipoksija se pogoršava s uznapredovalim stadijem KBB-a [36] i predviđa dugoročnu progresiju KBB-a [36]. Dodatno, ekspresija klothoa opada s padom bubrežne funkcije, a smanjenje ekspresije klothoa povezano je s oštećenjem bubrega [44]. U ovoj studiji pokazujemo da nedostatak klotha pojačava hipoksijom induciranu ekspresiju IFN-/ putem regulacije RIG-I u bubrezima i da je ekspresija RIG-I povezana s ekspresijom IFN-/ u stvarnih pacijenata s IgA nefropatijom. Uzimajući ove nalaze zajedno, i hipoksija i smanjenje klothoa promoviraju se tijekom progresije KBB-a, pa je stoga aktivacija urođenog imuniteta pojačana u bolesnika s KBB-om.