Trodimenzionalna arhitektura nefrona u normalnom i cističnom bubregu
Mar 06, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Cle´ment Nguyen1, Martine Burtin1, Ge´rard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8 i Marco Pontoglio1,8
KLJUČNE RIJEČI: cistična bolest bubrega; bubreg; nefron; nefronoftiza;čišćenje tkiva
Funkcija bubrega presudno ovisi o složenoj trodimenzionalnoj strukturi nefrona. Svako iskrivljenje njihovog oblika može dovesti doporemećaj rada bubrega. Tradicionalne histološke metode predstavljaju velika ograničenja za trodimenzionalnu rekonstrukciju tkiva. Ovdje smo kombinirali čišćenje tkiva, višefotonsku mikroskopiju i digitalno praćenje za rekonstrukciju pojedinačnih nefrona u fiziološkim i patološkim uvjetima. Kompleti odnefronakoji se razlikuju po položaju, obliku i veličini prema svojoj funkciji. Zanimljivo je da nefroni leže u ravninama. Kada je ova tehnika primijenjena na modelucistična bolest bubregautvrđeno je da se ciste razvijaju samo u određenim segmentima nefrona. Duž istog segmenta, ciste su susjedne unutar normalnih nedilatiranih tubula. Štoviše, oblici cista variraju ovisno o segmentu nefrona. Prema tome, naša otkrića pružaju vrijednu strategiju za vizualizaciju složene strukture bubrega na razini jednog nefrona i, što je još važnije, pružaju osnovu za razumijevanje patoloških procesa kao što je cistogeneza.
Prijevodna izjava
Metode čišćenja pružaju jedinstveni alat za razumijevanje kako morfološke promjene dovode do patoloških posljedica. Bubrezi su kritični organi koji održavaju tjelesnu homeostazu kroz rukovanje vodom, metabolitima i elektrolitima, koji presudno ovise o složenoj 3-dimenzionalnoj strukturi nefrona. Kada se ova strukturna organizacija promijeni, dolazi do bubrežne patofiziologije. U ovoj studiji razvili smo moćnu metodu koja se temelji na optičkom čišćenju,
multifotonska mikroskopija i digitalno praćenje za proučavanje bubrega na razini jednog nefrona u fiziološkim i patološkim uvjetima. Konkretno, pružamo prvu 3-dimenzionalnu rekonstrukciju policističnog bubrega na razini pojedinačnih nefrona. Ova se metoda može primijeniti na nekoliko patoloških konteksta, što nam omogućuje bolje razumijevanje složenog procesa propadanja bubrega i, posljedično, razvoj ciljanijih terapijskih strategija.
Bubreg održava tjelesnu homeostazu putem svoje složene 3-dimenzionalne (3D) strukture nefrona. Kada se ova strukturna organizacija promijeni, dolazi do bubrežne patofiziologije.Kronične bolesti bubregakarakterizirani su razvojem bubrežnih lezija. Intrigantno, patolozi su izvijestili o širokoj heterogenosti u distribuciji lezija tijekom kroničnih bubrežnih bolesti.1,2 Odražava li to činjenicu da specifični segmenti nefrona mogu biti različito oštećeni ili alternativno, da neki nefroni imaju različitu osjetljivost na ozljede u cjelini , nepoznato je. Kako bi se riješio ovaj problem, obvezno je rekonstruirati 3D oblik nefrona u patološkim kontekstima.
Na naše znanje,nefronapotpuno su rekonstruirani samo korištenjem serijskih 2D presjeka.3-5 Iako standardni histološki rezovi pružaju visoku rezoluciju, 3D rekonstrukcije su naporne i teško ih je dobiti. To je prvenstveno zbog mehaničkih izobličenja, što je neizbježan učinak postupka rezanja. Nadalje, 3D rekonstrukcija iz 2D slika ne dopušta izravno oslikavanje 3D struktura u cijelim tkivima.
Višefotonska mikroskopija poboljšala je našu sposobnost otkrivanja morfoloških promjena u debelim rezovima. Međutim, značajno ograničenje je plitka dostupna dubina zbog raspršenja svjetlosti. Minimizirajući razlike u indeksu loma, sredstva za pročišćavanje dramatično su poboljšala sposobnost snimanja dubina.6,7 Unatoč činjenici da je prvo sredstvo za pročišćavanje predstavljeno prije jednog stoljeća,8 tek je nedavno razvijeno nekoliko protokola za pročišćavanje, uglavnom za mozak .9–17 Nedavne studije pokazale su njihov potencijal za oslikavanje drugih čvrstih organa, poput jetre, gušterače ili bubrega.18–26
cistanche za bubrežnu bolest
Policistična bolest bubrega, genetski heterogeni poremećaj koji uključuje mutacije u nekoliko cilijarnih gena, najčešća je nasljedna bolest bubrega.27,28 Policistična bolest bubrega karakterizirana je razvojem cista koje dovode do potpunog uništenja bubrega.28 Studije mikrodisekcije sugerirale su da ciste mogu razvijaju se ili kao "izbacivanje" segmenta nefrona, kao kod autosomno dominantne policistične bolestibolest bubrega; kao ektatično širenje sabirnih kanalića (CD), kao kod autosomno recesivne policističnebolest bubrega; ili isključivo u medularnim tubulima, kao kod nefronoftize (NPHP).27,29 Međutim, još uvijek nije poznato kako se ciste razvijaju u 3D i organiziraju jedna s drugom i normalnim susjednim tubulima.
Ovdje smo spojili optičko čišćenje s višefotonskom mikroskopijom kako bismo pružili nove uvide u to kakonefronase oblikuju i organiziraju u fiziološkim uvjetima i kako se modificiraju tijekom bolesti, kao što je cistogeneza. Naši rezultati pokazuju da postoje 3 vrste nefrona i da krvne žile mogu utjecati na prostornu organizaciju nefrona. Zanimljivo je da smo primijetili da nefroni leže u određenim ravninama. Neočekivano, kada smo ovu tehniku primijenili na jck miševe, uočili smo da su se ciste razvile samo u specifičnim segmentima nefrona s fuziformnim cistama ispremiješanim s normalnim tubulima.
REZULTATI
Eksperimentalna postavka
Za proučavanje oblika cijelenefronau odnosu na njihov okoliš usvojili smo tehniku koja se temelji na optičkom čišćenju i višefotonskoj mikroskopiji (dodatna slika S1A). Uspoređujući različite protokole optičkog čišćenja, utvrdili smo da je za bubreg benzil alkohol/benzil benzoat (BABB) najprikladniji u smislu učinkovitosti (dodatna slika S1B i C i dopunska tablica S1).
3D rekonstrukcija i digitalno praćenje zahtijevaju visokokvalitetne slike visoke rezolucije i visokog omjera signala i pozadine. Primijetili smo da optički signal koji daje nativna fluorescencija nije ujednačen u dijelovima bubrega. Konkretno, slike iz medule bile su u slabom kontrastu s niskim omjerom signala i pozadine (dodatna slika S2). Kako bismo poboljšali omjer signala i pozadine, obojali smo presjeke periodičnom kiselinom–Schiff (dodatna slika S1D), jer smo empirijski uočili da je ovo bojanje dovelo do visokog kontrasta u tankim presjecima tijekom 2-fotonske fluorescencije. Međutim, signal nije bio ujednačen kroz dijelove bubrega obojene debelom periodičnom kiselinom (Schiffova kiselina) (dodatna slika S1E). Stoga smo obojili dijelove bubrega lektinima povezanim s fluorokromom: aglutininom kikirikija i aglutininom pšeničnih klica, koji boje glomerule i tubule, i aglutininom Griffonia simplicifolia, koji obilježava krvne žile.30 Nevjerojatno, s kombinacijom ovih lektina, signal do- omjer pozadine dramatično je povećan u cjelinidijelovi bubrega, sa značajnim poboljšanjem u ravnini xy i osi z (dodatna slika S1E i dopunski film S1).
3D vizualizacija segmenta nefrona
Kako bismo vizualizirali oblik cijelih nefrona, pratili smo njihove staze, počevši od urinarnog pola glomerula i završavajući na CD spoju (dodatni film S2). Unatoč činjenici da korišteni lektini globalno vežu sve segmente nefrona, primijetili smo da su, kada se pažljivo pregledaju, ti lektini karakterizirani specifičnim uzorkom u načinu na koji su bojali bazalne ili luminalne membrane u različitim segmentima nefrona. Drugim riječima, iskoristili smo stereotipni obrazac bojenja lektina kako bismo identificirali različite segmente nefrona. Na ovaj način smo mogli lako identificirati 6 entiteta: proksimalni tubul (PT), tanki krak (TL) Henleove petlje (HL), debeli uzlazni krak (TAL) HL, distalni uvijeni tubul (DCT), spojni tubul (CNT) ), i CD. Prijelaz između PT i TL bio je karakteriziran iznenadnim gubitkom tipičnog signala PT ruba četke i smanjenjem širine lumena, što je bilo gotovo odsutno u TL (Slika 1a). Suprotno tome, prijelaz između TL i TAL karakteriziran je značajnim povećanjem vanjskog tubularnog promjera i relativno konstantnom širinom lumena (Slika 1b). U svemunefrona, prijelaz TAL u DCT sustavno je pronađen na vaskularnom polu glomerula. Ovaj je prijelaz obilježen naglim povećanjem vanjskog tubularnog promjera koji je pretežno bio posljedica značajnog povećanja promjera lumena (Slika 1c). Prijelaz između DCT i CNT bio je karakteriziran smanjenjem promjera i lumena tubula (Slika 1d). Konačno, veza između CNT i kortikalnog CD-a karakterizirana je naglim povećanjem promjera i lumena tubula (Slika 1e). Kvantifikacija ovih morfoloških prijelaza bila je statistički značajna (Slika 1f), a njezina relevantnost je potvrđena bojanjem sa specifičnim tubularnim markerima (Dodatne slike S3-S5 i Dopunski film S3-S5).
Oblik i veličina PT razlikuju se prema njihovoj dubini
Bojenje gustedijelovi bubregaomogućio nam je praćenje koordinata prostorne evolucije cijelih PT segmenata. Zanimljivo je da smo otkrili da je njihov oblik izuzetno varijabilan i određen položajem njihovih glomerula u korteksu. Globalno smo identificirali 3 obrasca. Prvi je odgovarao najpovršnijim nefronima (SN) (Slika 2a; Dodatni film S6), koji su zauzimali najvanjskiji dio korteksa (najvišnjih 30 posto u blizini bubrežne kapsule). Njihovi zavojiti dijelovi formirali su kompaktne strukture sa samo 6 do 7 zavoja oko vlastitog glomerula, zauzimajući vrlo male i tijesno zbijene prostore. Zavoj ovih SN završavao je dugim i ravnim pars recta koji se spuštao u medulu. Na suprotnom kraju ovog spektra, uočili smo drugi obrazacnefronanalazi se u najdubljem dijelu korteksa (40 posto veća unutarnja dubina), pored medule (jukstamedularni nefroni [JN]) (Slika 2a; Dodatna slika S6 i Dodatni film S6). Njihove PT-ove karakterizirala je početna kratka petlja koja se sustavno spuštala prema papili, a zatim se U okrenula da se podigne prema bubrežnoj kapsuli. Za razliku od SN-ova, JN proksimalne zavojite tubule karakteriziraju velike zavojnice koje su se razvile oko vlastitog glomerula i zauzimaju velike, labavo upakirane domene u jukstamedularnom korteksu. Zavijeni dio PT JN-a imao je 10 do 15 zavoja, tvoreći velike domene. Konačno, treći uzorak uključivao je nefrone smještene u srednjem dijelu korteksa (srednji nefroni [MNs]) (Slika 2a; Dodatni film S6). Zanimljivo je da su ti tubuli imali oblik i prostornu orijentaciju koji su predstavljali prijelaz između SN i JN. Zapravo, sadržavale su 8 do 9 zavoja sa zavojnicama koje su bile veće od SN, ali manje od JN. Osim toga, MN su imale duži pars recta od JN. Zanimljivo je da je globalna usporedba oblika PT-ova pokazala da SN-ovi i MN-ovi imaju homogen uzorak, dok su JN-ovi bili izrazito heterogeni (dodatna slika S6). Osim toga, prostorna rekonstrukcija nekoliko nefrona otkrila je da se PT-ovi nikada ne miješaju (dopunski film S6), što ukazuje da svaki nefron zauzima vlastiti pojedinačni prostor u korteksu.
Morfometrijske analize potvrdile su velike razlike u veličini i obliku SN i JN, s posrednim aspektom za MN. PT JN-ova bio je više od 2-puta duži od PT-a SN-ova (Slika 2b); međutim, ravnost je bila veća u SN-ovima nego u JN-ovima (Slika 2c), što je u skladu s opažanjem da su JN tubuli mnogo vijugaviji (Slika 2a; Dodatna slika S6).
Slika 1|Morfološki kriteriji koji se koriste za identifikaciju segmenata nefrona. (a-e) Morfologija različitih segmenata nefrona u kontrolnih miševa. Nefroni su praćeni od urinarnog pola glomerula do sabirnog kanala (proksimalni tubul [PT]: tirkiz; tanki krak [TL] Henleove petlje: svijetlo siv; debeli uzlazni krak [TAL] Henleove petlje: tamno siv; distalni uvijeni tubul [DCT]: ružičast; spojni tubul [CNT]: žut; kortikalni sabirni kanal [CCD]: narančasto). Strelice pokazuju promjer različitih segmenata nefrona. (nastavak)
Slika 1|(Nastavak) (f) Kvantifikacija vanjskog tubularnog promjera različitih segmenata nefrona. Podaci su izraženi kao srednji SEM. Analiza varijance praćena Tukey-Kramerovim testom: **P < 0.01,="" ***p=""><>
Slika 3|Trodimenzionalna (3D) rekonstrukcija nefrona otkriva 3 različite vrste nefrona. (a) Reprezentativne 3D slike cijelog nefrona (lijeve ploče) od glomerula do sabirnog kanala u površinskom korteksu (plavo), srednjem korteksu (zeleno) i jukstamedularnoj regiji (crveno) kod kontrolnih miševa. Segmentacija nefrona (desne ploče) za 3 različite vrste nefrona. Šipka ¼ 150 mm. (b) Kvantifikacija međuudaljenosti između 2 kraka Henleove petlje za 3 vrste nefrona. (c) Kvantifikacija duljine nefrona za (nastavak)
Slika 3|(nastavak) 3 vrste nefrona. (d) Kvantifikacija duljine različitih segmenata nefrona prema vrsti nefrona. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost -SEM. Analiza varijance praćena Tukey-Kramerovim testom: jukstamedularni nefron (JN) u odnosu na površinski nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" u="" odnosu="" na="" srednji="" nefron="" (mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" spojni="" tubul;="" dct,="" distalni="" uvijeni="" tubul;="" pt,="" proksimalni="" tubul;="" tal,="" debeli="" uzlazni="" krak="" henleove="" petlje;="" tl,="" tanki="" krak="" henleove="">
Veličina glomerula varira s dubinom
Zatim smo analizirali dubinu i promjer glomerula nasumično odabranih iz svake od 3 zone. Morfometrijske analize otkrile su da su glomeruli u prosjeku 783 i 355 mm od bubrežne kapsule u JNs i SNs, redom. Kao što je ranije objavljeno, primijetili smo da veličina glomerula varira ovisno o njihovoj dubini. Konkretno, glomerularni volumen JNs bio je 3 puta veći od volumena SNs i MNs (Slika 2d).
3D rekonstrukcija nefrona
Zatim smo pratili prostornu evoluciju cijelih nefrona od PT do CNT. Globalni pogled na njihovu 3D rekonstrukciju potvrdio je da se oblik nefrona razlikuje među SN, MN i JN (Slika 3a; Dodatni film S7). Ta je razlika uglavnom nastala zbog strukture PT-a. Osim toga, primijetili smo da HL ima drugačiju 3D prostornu organizaciju. Konkretno, TL i TAL bili su udaljenije odvojeni u JN-ovima nego u SN-ovima i MN-ovima (Slika 3b). Morfometrijske analize otkrile su da su JN-ovi globalno 2-puta duži od SN-ova (Slika 3c). Povećana duljina bila je proporcionalno raspoređena u svim segmentima, osim za TAL i DCT, koji su imali sličnu apsolutnu duljinu u svim tipovima nefrona (Slika 3d). Ovo je sugeriralo da je produljenje nefrona iznenađujuće homogeno strukturiran proces.
Lučne žile utječu na jukstamedularnu PT konvoluciju
Da biste dobili sveobuhvatniju perspektivustruktura bubrega, iskoristili smo prednost bojanja aglutininom Griffonia simplicifolia, što nam je omogućilo da pratimo lučne žile i njihove grane u kortikalne zrakaste žile (Slika 4a; Dodatni film S8). Zanimljivo je da je popratna 3D rekonstrukcija nefrona i krvnih žila pokazala da lučne žile imaju tendenciju biti u iznenađujućoj paralelnoj prostornoj organizaciji s obližnjim tubulima. Konkretno, primijetili smo da staza koju slijede specifični JN-ovi (ograničeni JN-ovi) nastoji slijediti putanju obližnjeg plovila (Slika 4b; Dodatni film S9). Zanimljivo je da je ova pristranost (primjećena samo u podskupu JN nefrona) bila odgovorna za veliku heterogenost u oblicima PT (dodatna slika S6). Morfometrijske analize otkrile su da su "ograničeni" PT-ovi bili značajno dulji i vijugaviji (smanjena ravnost) od onih "neograničenih" (Slika 4c i d). Vrijedno je napomenuti da su zakrivljeni dijelovi i SN i MN bili postavljeni iznad lučnih žila i nisu bili sputani.
Tubuli teže ležati u ravninama
Zanimljivo je da je pregled 3D oblika nefrona pokazao da oni teže ležati u ravninama (Slika 5a; Dodatni film S10). Kako bismo kvantificirali ovaj parametar i procijenili moguću statističku pristranost ove konformacije, izmjerili smo opću tendenciju tubula da se savijaju izvan ravnine definirane njihovim petljama. Naša su mjerenja pokazala da su u usporedbi sa simuliranim modelom nasumičnog hodanja generiranim s istim skupom uzastopno izmjerenih kutova i duljina između uzastopnih točaka (Slika 5b), tubuli težili razvoju s manjim odstupanjem od ravnine (Slika 5c). To je ukazivalo na to da su tubuli težili ograničiti svoj put duž ravnine. Uočene razlike bile su visoko statistički značajne (P <>
cistanche može poboljšati rad bubrega
3D rekonstrukcija nefrona otkriva specifičan obrazac razvoja ciste
Kako bismo utvrdili dopušta li naš protokol praćenje nefrona u neorganiziranim patološkim tkivima, karakterizirali smo oblike i prostornu distribuciju cista u jck miševa, široko korištenog modela NPHP i cistične bolesti.31–33 3D slike pokazale su da unatoč pojavljivanja istaknutih cista, opći 3D tijek nefrona nije se značajno razlikovao od onog kod kontrolnih miševa (Dopunski film S11). Slično, morfometrijske analize potvrdile su da je globalna duljina nefrona, glomerularni volumen i duljina svakognefronsegmentu bili su usporedivi s onima kontrolnih miševa (dodatna slika S7). Treba napomenuti da zbog razvoja ciste nismo mogli razlikovati TL od TAL-a u HL-u. Svi su nefroni razvili fuziformne ciste (dodatni filmovi S11 i S12). Jedna od najupečatljivijih značajki bilo je zapažanje da su se fuziformna cistična proširenja pojavila na više mjesta duž istenefronsegment (Dodatni filmovi S12 i S13). Zanimljivo je da smo primijetili da se ciste nikada nisu razvile u PT i HL silaznim udovima (Slika 6a; Dodatni film S12). Nasuprot tome, oni su pretežno otkriveni u HL uzlaznim udovima, DCT-ima, CNT-ovima i u gornjem dijelu CD-a, u kontinuitetu s CNT-om (Slika 6a; Dodatni film S12). Konkretno, uočili smo da DCT, kao i CNT segmenti, imaju neobično povećanu vjerojatnost razvoja cista u svojim distalnijim dijelovima (Slika 6b). Kvantitativne morfometrijske analize 3D rekonstrukcijskih slika otkrile su da je ukupni volumen ciste ponefronbio je posebno visok u CNT (Slika 7a). Osim toga, primijetili smo da su povećanja cista u HL i DCT veća u JN nego u SN i MN (Slika 7a; Dodatni film S12). Štoviše, incidencija cista bila je značajno veća u JN-ima nego u drugim tipovima nefrona (Slika 7b). Također smo primijetili da je prosječna glomerularna međuudaljenost (izračunata na najbližih 5 glomerula) bila osobito povećana kod cističnih miševa, posebno u površnijem korteksu (dodatna slika S8).
3D rekonstrukcija brojnih cista otkrila je da su izrazito varijabilnog oblika i volumena (Slika 6c; Dodatni filmovi S11 i S13). U HL uzlaznom ekstremitetu ciste su imale fuziformni oblik malog promjera. U DCT-u, ciste su imale prilično sferičan i veći oblik i bile su razbacane među nedilatiranim tubulima. Zanimljivo je da je prijelaz između DCT i CNT sustavno karakteriziran normalnom nedilatiranom strukturom. Nasuprot tome, u CNT-u smo sustavno promatrali susjednu proširenu cističnu strukturu izravno u kontaktu s CD-om. Zanimljivo je da se u CD-u ova struktura progresivno smanjila do normalne veličine tubula. Distalnije, nisu se mogle otkriti daljnje ciste u susjednom dijelu CD-a. Druga dosljedna značajka bila je osebujna prostorna organizacija cista u HL uzlaznom ekstremitetu. Zapravo, iako su ciste bile dublje i bliže petlji u SN, one su bile površnije i bliže DCT u JN (slika 6c). Opet, ciste su zauzele srednji položaj u MN (slika 6c).
Slika 5|Tubuli nefrona imaju tendenciju da se razvijaju kao ravna struktura. (a) Tipična putanja proksimalnog tubula nefrona. Ova staza ilustrira njegovu tendenciju da leži u ravnini. Planarnost evolucije staze može se bolje vidjeti kada se ispravno zakrene i poravna s promatračevom točkom (pogledajte desni prikaz istog cjevastog segmenta, koji je na lijevoj strani predstavljen na drugom kut). (b) Shematski prikaz cjevaste staze sastavljene od 4 segmenta (između 5 točaka koje definiraju danu cjevastu stazu prikazanu kao primjer). Stupanj do kojeg staze nastoje izaći "iz svoje ravnine" može se predstaviti kutom koji je ovdje označen kao "beta". (nastavak)
Slika 5|(Nastavak) Ovaj kut se mjeri između segmenta p3-p4 u odnosu na ravninu (definiranu neposredno prethodnim točkama p3, p2 i p1) i predstavljen tamno sivim pravokutnikom u shemi. Izračun beta kutova zatim je rekurzivno izračunat duž skupa točaka u cjevastom putu. Kako bismo procijenili opseg pristranosti ovih beta kutova, simulirali smo nasumično hodanje (Monte Carlo simulacija [MCs]) korištenjem istog skupa uzastopnih alfa kutova svake cjevaste staze (mjereno između svih uzastopnih segmenata). Ova putanja generirana slučajnim hodanjem s identičnim skupom alfa kutova i nasumičnih beta kutova. (c) Violinski dijagrami globalne distribucije beta kutova i rezultata MC-ova u proksimalnom tubulu (PT), tankom kraku (TL) Henleove petlje, debelom uzlaznom kraku (TAL) Henleove petlje, distalnom zavijenom tubulu ( DCT) i vezivnog tubula (CNT). MC, P <>
RASPRAVA
Tradicionalne histološke metode ograničene su u svojoj sposobnosti otkrivanja patoloških promjena koje utječu na opći oblik nefrona. Ovdje predstavljamo snažan pristup temeljen na čišćenju tkiva koji ima potencijal za rješavanje ključnih pitanja o arhitekturi bubrega s neviđenim prostornim detaljima u normalnim i patološkim uvjetima. Naši rezultati potvrdili su postojanje 3 vrste nefrona, koji se razlikuju po položaju, obliku i veličini, sukladno svojim funkcionalnim specifičnostima. Štoviše, pokazali smo da nefroni imaju tendenciju ležati u ravninama i prilagoditi se prostornoj organizaciji plovila. Intrigantno, kada smo ovu tehniku primijenili na modelcistična bolest bubrega, primijetili smo da se ciste razvijaju kod svih
nefrona, ali samo u određenim segmentima. Zanimljivo je da smo pokazali da oblik ciste varira ovisno o segmentu nefrona, te da duž istog nefrona ciste interkaliraju s normalnim nedilatiranim tubulima. Sveukupno, ovi rezultati daju prvu 3D karakterizaciju prostornog rasporeda nefrona i krvnih žila i, što je važno, daju osnovu za razumijevanje patološkog procesa, kao što je cistogeneza.
Optičko čišćenje bubrega je izazovno zbog visoke razine autofluorescencije i gustoće stanica. Uspoređujući različite protokole čišćenja, identificirali smo BABB moćnu tehniku za implementaciju vizualizacije i rekonstrukcije struktura smještenih u najdubljem dijelububreg, odnosno medule. Štoviše, BABB je brz i skalabilan i, nakon brisanja, uzorci se mogu pohraniti mjesecima prije snimanja slike. Još jedna glavna prednost ove tehnike je niska cijena. Sredstva za pročišćavanje mogu rezultirati skupljanjem ili povećanjem struktura.9-17 Međutim, budući da su ove modifikacije veličine bubrega izotropne, ne očekuje se da će to utjecati na relativna mjerenja ili pristrano tumačenje. Jedno od najvažnijih ograničenja je označavanje struktura koje oduzima puno vremena. Unatoč tome, postoji sve veći broj tehnika temeljenih na dubokom učenju koje bi trebale brzo prevladati ovo ograničenje.
U skladu s rezultatima dobivenim klasičnim tehnikama, naše je istraživanje pokazalo da se nefroni razlikuju po obliku i duljini ovisno o položaju. Konkretno, uočili smo da JN-ovi imaju razvijenije zakrivljene PT-ove i veće glomerule te su 2 puta duži od SN-ova. Povećana duljina rezultat je skladnog procesa jer produljenje proporcionalno zahvaća sve segmente nefrona. Također smo primijetili da JN imaju veći HL. Sveukupno, ovi podaci jasno pokazuju da je mikroanatomija SN i JN značajno različita i da MN pokazuju srednje karakteristike. Zanimljivo je da su fiziološke studije pokazale da su nefroni također funkcionalno različiti.2 Morfogenetski događaji koji su u pozadini ovih razlika još nisu poznati. Stoga je primamljivo nagađati da određena struktura JN može objasniti specifičnost njihovih funkcija.
Zanimljivo, pružajući po prvi put 3D rekonstrukciju nefrona i njihovih okolnih žila, otkrili smo prostorno ograničenje između lučnih žila i podskupine nefrona. Stoga je zamislivo misliti da plovila mogu diktirati putnefronaproduljiti tijekom razvoja.34,35 Inspekcija 3D oblika nefrona u kombinaciji s računalnim simulacijama također je otkrila da se nefroni nikad ne miješaju i da svaki nefron teži ležati u ravnini. Funkcionalni značaj ovog opažanja tek treba razjasniti.
Razvoj ciste tijekompolicistična bolest bubregajoš uvijek je intrigantan proces. NPHP, patološko stanje karakterizirano razvojem ciste, najčešća je genetska bolest koja uzrokuje završni stadij bubrežne bolesti u djece i adolescenata. Do sada je identificirano dvadeset NPHP gena.36 Među njima, NEK8 kodira člana obitelji kinaza nikad u mitozi A povezanih, koja igra ulogu u funkciji cilija i napredovanju staničnog ciklusa.37 Nek8 je izvorno karakteriziran kao gen mutiran u jck miševa.32 Značajno, pokazalo se da mutacija u istoj domeni proteina dovodi do NPHP9 kod ljudi.38 2Studije su pokazale da se razvoj ciste dramatično razlikuje među različitim oblicima policistične bolesti bubrega.27,29 Posebno , u NPHP-u, čini se da ciste potječu isključivo iz CD-a i DCT-a.31 Iako su informativne, ove imunohistokemijske studije ne mogu se protiviti mogućnosti da gubitak specifičnih tubularnih markera39 umjetno objašnjava ovo opažanje. Stoga naša 3D studija daje prvi jasan dokaz da je razvoj ciste proces koji može uključivati samo specifične segmente nefrona. Zanimljivo, iako se kinaza 8 (NEK8) povezana s NIMA (Never In mitosis gen A) eksprimira u citoplazmi svih segmenata nefrona, njezina je ekspresija u resicama ograničena na DCT i CD. Budući da su samo ti segmenti skloni razvoju cista,31 možemo pretpostaviti da je poremećaj cilijarne funkcije NEK8 ključni događaj za stvaranje ciste. Intrigantno, također smo primijetili da su fuziformne ciste u kontinuitetu s normalnim nedilatiranim tubulima. Činjenica da recesivna mutacija germinativne linije dovodi do patološkog fenotipa samo u podskupu stanica sugerira da bi drugi događaj mogao potaknuti razvoj ciste u tim stanicama, kao što se sugerira za autosomno dominantnu policističnu bolestbolest bubrega.40,41
Također smo primijetili da je povećanje ciste dominantnije u JN nego u SN, barem s obzirom na ciste koje se nalaze između PT i CNT. Dosljedno, objavljeno je da se u kontekstu glomeruloskleroze lezije glomerula češće nalaze u JN nego u SN.1,21,42 Je li prekomjerni rad zbog povećanog pojedinačnognefronStope glomerularne fifiltracije i transportne/enzimske aktivnosti objašnjavaju povećanu osjetljivost JN-a na propadanje zanimljiva je hipoteza koja zaslužuje daljnje istraživanje.
Ukratko, opisujemo novu tehniku za prikaz bubrega u 3D s dovoljnom molekularnom specifičnošću i rezolucijom za izravno bilježenje prostorne i kvantitativne distribucije specifično označenih unutarnjih struktura (nefrona, krvnih žila i cista). S obzirom na pogodnost, brzinu i mogućnost izravne kvantifikacije, očekujemo da će ova tehnika postati moćan alat za razumijevanje patofiziologije bubrega.
Slika 6|Trodimenzionalna (3D) rekonstrukcija nefrona otkriva da se ciste razvijaju samo u određenim segmentima nefrona. (a) Reprezentativne 3D slike s prikazom volumena ciste cijelog nefrona (lijeve ploče) od glomerula do sabirnog kanala u površinskom korteksu (plavo), srednjem korteksu (zeleno) i jukstamedularnoj regiji (crveno) u jck miševa. Segmentacija nefrona (desne ploče) za 3 različite vrste nefrona. Šipka ¼ 150 mm. (b) Vjerojatnost razvoja cista u različitim segmentima nefrona u jck miševa. (nastavak)
Slika 6|(Nastavak) Horizontalna os je normalizirana duljina nefrona koja odgovara 50 odjeljaka (proksimalni tubul [PT], tirkiz; Henleova petlja [HL], bijela; distalni zavojiti tubul [DCT], ružičast; spojni tubul [CNT], žut) . (c) Reprezentativne 3D slike rekonstrukcije cista s prikazom volumena ciste uzlaznog uda HL (lijeve ploče), DCT-ova (srednje ploče) i CNT-ova i kortikalnih sabirnih kanala (CCD) (desne ploče) u površinskoj (gornje ploče), sredini (srednje ploče), i jukstamedularne (donje ploče) nefrone u jck miševa. Šipka ¼ 50 mm.
METODE
Životinje
Sve postupke na životinjama odobrila je "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" i etičko povjerenstvo Université Paris Descartes. Dva mjeseca stari FVB/N miševi (n=20) korišteni su za postavljanje eksperimentalnih uvjeta za čišćenje bubrega. Studija je zatim provedena na 2-tjednom starim jck muškim miševima (n=4) i kontrolnim kolegama iz legla (n=3).
Priprema bubrežnih tkiva
Prije usmrćivanja, miševi su perfundirani, intrakardijalnom kateterizacijom, s 25 ml heparinizirane fiziološke otopine (1000 IU/l), a zatim sa 75 ml 4 posto paraformaldehida u fosfatno puferiranoj fiziološkoj otopini (PBS). Eksperimenti su provedeni pod anestezijom ksilazinom (Rompun 2 posto, Bayer, Leverkusen, Njemačka, 6 mg/g tjelesne težine) i ketaminom (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Francuska, 120 mg/g tjelesne težine).
Za studije čišćenja, bubrezi su fiksirani u 4 posto paraformaldehida tijekom 4 sata i ugrađeni u 4 posto agaroze, a rezovi debljine 1 5- mm koji okružuju bubrežni hilum izrezani su i pohranjeni u PBS na 4 C.Dijelovi bubregaprvo su obojeni, a zatim očišćeni.
Za imunohistokemijske studije na tankim rezovima,bubregafiksirani su u 4 posto paraformaldehida preko noći i izrezani su dijelovi umetnuti u parafin i 4- mm.
Bojenje
Bojenje periodnom kiselinom po Schiffu. Sekcije bubrega od 15-mm su inkubirane u čistoj ili 1:100 PBS-razrijeđenoj periodnoj kiselini–Schiff 5 minuta na sobnoj temperaturi prije bistrenja.
Imunohistokemija na tankim parafinskim rezovima. Odsječci bubrega uklopljenih u parafin od četiri mikrometra zagrijavani su za pronalaženje antigena i inkubirani preko noći na 4 C s lektinima povezanim s fluorokromom kako bi se pratili tubuli (rodamin aglutinin kikirikija [RL-1072-5] i rodamin aglutinin pšeničnih klica [RL{{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, razrijeđeno na 1:200) i primarno antitijelo specifično za segment za prikaz različitih tubularnih segmenata (biotinilirani Lotus tetragonolobus lektin [B-1325], Vector Laboratories, razrijeđeno na 1: 100; mišji anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Njemačka, razrijeđen na 1:200; kozji anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, razrijeđen na 1:200) . Sljedeći dan, rezovi su inkubirani sa sekundarnim antitijelom 1 sat na sobnoj temperaturi (Alexa Fluor 488 konjugat [S32354], Invitrogen; antikozji Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mišji Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; sve razrijeđeno na 1:500) prije bojanja s 40,6-diamidino-2-fenilindolom. Sve su slike snimljene mikroskopom Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Francuska) i pripremljene pomoću softvera FiJi (verzija 1.50).
Bojenje lektinom na debelim rezovima. Sekcije bubrega debljine 1.5- mm inkubirane su na 4 C tijekom 1 mjeseca u Texas Red ili lektinima povezanim s fluorescein izotiocijanatom: aglutinin kikirikija (RL-1072-5) i aglutinin pšeničnih klica (RL{{6} }), razrijeđen u omjeru 1:100 u 0,1 posto PBS azida i 0,1 posto Triton-X. Sekcije su zatim isprane svaki dan tijekom 2 tjedna s PBS-om prije čišćenja.
Optičko čišćenje
Za čišćenje kamenca, rezovi bubrega od 1.5- mm inkubirani su u ScaleA2 (4 M urea, 0.1 posto Triton X-100, 10 posto glicerol) ili ScaleB4 (8 M urea, 0,1 posto Triton X-100) tijekom 2 tjedna, do 1 godine, na 4 C.
Za čišćenje BABB-a, dijelovi bubrega od 15-mm su dehidrirani u uzastopnim ispiranjima etanolom na sobnoj temperaturi. Uzorci su zatim inkubirani u BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) u omjeru 1:2 najmanje 2 dana na 4 C.
Snimanje slike dvofotonskom mikroskopijom
Tkiva su snimljena s vodenim gelom na invertnom multifotonskom mikroskopu (LaVision BioTec) opremljenom Mai Tai HP titan-safirnim laserom (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (dodatna slika S1A). Valna duljina ekscitacije bila je 815 nm pri 8 posto snage. Koristili smo vodeni imerzioni objektiv od 20 (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokio, Japan]; numerički otvor blende 0,95; radna udaljenost 2,0 mm). Za prikupljanje fluorescencije upotrijebili smo neskenirani detektor na 80 posto s propusnim filterom 593/40 nm.
Prvi korak sastojao se od akvizicije 2D mozaične slike na srednjem z nizu korištenjem suboptimalnih parametara akvizicije (400 mm 400 mm i 1011 1011 piksela, s preklapanjem od 10 posto i linijskim prosjekom na 2) za vođenje odabira najrelevantnijih središnjih polja polja (Dodatna slika S9A). Nakon što su xy mreža i z polja od interesa definirana, parametri su podešeni za dobivanje visokokvalitetnih slika. Takav pristup smanjio je područje interesa na 5 12 polja fi po z stogu. Zatim smo uzeli 850 z skupova/optičkih rezova (1- mm veličine koraka) koji okružuju bubrežni hilum u srednjem dijeludio bubrega.
Spajanje, obrada i iscrtavanje slika
Svaki hrp je popločan u skladu s metodom koju su razvili Preibisch et al., 43 koja omogućuje spajanje velike kolekcije slika korištenjem dodatka "Grid/Collection stitching" softvera Fiji (http://fifiji.sc/Fiji) . Budući da smo uočili važan pomak između 2 susjedne slike nakon spajanja, napisali smo prilagođeni program za podudaranje u Pythonu. Ovaj program kompenzira pomak slike, omogućujući nam da ispravno poravnamo slike (dodatna slika S9B). Spojeno ispravljene slike analizirane su pomoću Imaris verzije 8.4.2 (Bitplane, Zurich, Švicarska). Tubuli i žile praćeni su korištenjem ručnog načina rada Imaris paketa za praćenje vlakana i spojeni Imaris Xtensionom koji smo razvili s MATLAB-om (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Join{{12 }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (dodatna slika S9C). Glomeruli i ciste su 3D rekonstruirani korištenjem ručnog načina površinskog paketa Imaris. 3D prostorna organizacija glomerula prikazana je korištenjem ručnog načina rada paketa spotova Imarisa.
Morfometrija
Duljina tubularnog segmenta, duljina nefrona i ravnost određeni su korištenjem paketa za praćenje fifilamenta Imaris. Prema softveru Imaris, ravnost je kvantificirana kao omjer između udaljenosti između 2 točke i duljine staze segmenta nefrona. Trideset jedan PT i 12 cijelih nefrona rekonstruirani su i izmjereni u 3 miša divljeg tipa, dok je 37 PT i 17 cijelih nefrona rekonstruirano i izmjereno u 4 jck miša. Cista i
glomerularni volumeni određeni su korištenjem "površinskog paketa" Imarisa. Trideset jedan i 34 glomerula su izmjereni u divljeg tipa i jck miševa. Ukupno su izmjerene sedamdeset i četiri ciste.
Kutovi "izvan ravnine" cjevastih zavoja (označeni kao "beta") izmjereni su između ravnine (definirane s 3 uzastopne točke) i pravca sa sljedećom uzastopnom četvrtom točkom u prostoru (Slika 5b). Kako bismo procijenili statističku značajnost uočenog odstupanja, simulirali smo distribuciju beta kutova sa slučajnom rotacijom beta kutova (Monte Carlo simulacija) u strukturama koje su bile sastavljene od istih segmenata s istim skupom alfa kutova.
Za izračun vjerojatnosti razvoja cistične lezije dužnefronsegmentima, predstavili smo svaki nefron nizom točaka u prostoru. Svaka točka je označena s obzirom na prisutnost ciste u odnosu na normalnu strukturu i vrstu segmenta. Vjerojatnost za svaku standardiziranu duljinu (postavljenu na 50 spremnika) izračunata je kao omjer između broja točaka s cističnom oznakom i ukupnog broja točaka u spremniku.
Za izračun prosječne glomerularne međuudaljenosti, uzeli smo u obzir za svaki glomerul prosječnu glomerularnu međuudaljenost izračunatu na najbližih 5 glomerula.
Analiza podataka i statistika
Podaci su izraženi kao srednji SEM. Razlike između eksperimentalnih skupina procijenjene su pomoću analize varijance nakon koje je, ako su bile značajne (P < {{0}}.05),="" tukey-kramer="" testom.="" kada="" su="" uspoređivane="" samo="" 2="" skupine,="" korišten="" je="" mann-whitney="" test.="" statističke="" analize="" provedene="" su="" pomoću="" softvera="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" verzija="">
RAZOTKRIVANJE
Svi autori izjavili su da nema suprotstavljenih interesa.
ZAHVALA
Zahvaljujemo Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative de Recherche Necker na tehničkoj pomoći. Zahvaljujemo Pierreu Isnardu, Marie-Claire Gubler i Nicolasu Kuperwasseru na kritičkom čitanju rukopisa. Ovaj rad podržali su Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Basel) , Švicarska) i Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Pariz, Francuska).
AUTORSKI PRILOZI
TB, NG i MZ osmislili su i izveli pokuse i analizirali podatke. FB, LT, MGT i SG također su izveli neke eksperimente i analizirali podatke. MB i CN izveli su eksperimente s miševima. TB i MZ također su pridonijeli pisanju rukopisa. GF je revidirao rukopis. FT i MP dali su konceptualni okvir i izradili studiju, nadgledali projekt i napisali rad.
cistanche može tonificirati bubrege
DOPUNSKI MATERIJAL
Dodatna datoteka (PDF)
Slika S1. Eksperimentalni postav, postupak snimanja i obrada slike.
Slika S2. Granice signala autofluorescencije u xy i z rezolucijama.
Slika S3. Dvodimenzionalna slika prijelaza između PT i TL na rezovima bubrega 4- mm ugrađenim u parafin.
Slika S4. Dvodimenzionalna slika prijelaza između TAL i DCT na rezovima bubrega 4- mm ugrađenim u parafin.
Slika S5. Dvodimenzionalna slika prijelaza između DCT i CNT na rezovima bubrega 4- mm ugrađenim u parafin.
Slika S6. Trodimenzionalna rekonstrukcija otkriva 3 različita oblika proksimalnih tubula.
Slika S7. Trodimenzionalna rekonstrukcija otkriva da ciste ne utječu na duljinu i segmentaciju nefrona.
Slika S8. Gustoća glomerula u kontrolnim i cističnim bubrezima.
Slika S9. Postupak snimanja i naknadna obrada slike.
Tablica S1. Usporedba metoda kliringa. Dodatna datoteka (filmovi)
Film S1. Bojanje lektinom značajno poboljšava rezoluciju i omjer signala i pozadine.
Film S2. Praćenje staze tubula.
Film S3. Trodimenzionalna rekonstrukcija očišćenog bubrega koja prikazuje spoj između proksimalnog tubula i tankog kraka Henleove petlje.
Film S4. Trodimenzionalna rekonstrukcija očišćenog bubrega koja prikazuje spoj između debelog uzlaznog kraka Henleove petlje i distalnog zavojitog tubula.
Film S5. Trodimenzionalna rekonstrukcija očišćenog bubrega koja prikazuje spoj između distalnog uvijenog tubula i spojnog tubula.
Film S6. Oblik i veličina proksimalnih tubula razlikuju se ovisno o njihovoj dubini.
Film S7. Trodimenzionalna rekonstrukcija nefrona u kontrolnih miševa.
Film S8. Praćenje putanje žile od lučne žile do kortikalne zrakaste žile.
Film S9. Lučne žile modeliraju oblik jukstamedularnih proksimalnih tubula.
Film S10. Nefroni nastoje ležati u ravnini.
Film S11. Trodimenzionalna rekonstrukcija nefrona pokazuje specifičan obrazac razvoja ciste.
Film S12. Trodimenzionalna segmentacija nefrona otkriva da se ciste razvijaju u specifičnim segmentima nefrona.
Film S13. Prostorni raspored i međusobni odnos nefrona i krvnih žila kod policističnog bubrega
REFERENCE
1. Bogati AR. Do sada neopisana ranjivost jukstamedularnih glomerula u lipoidnoj nefrozi. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173-186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Heterogenost anatomije nefrona. Kidney Int Suppl. 1987; 20: S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al. Trodimenzionalna rekonstrukcija nefrona štakora. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664-F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Digitalna trodimenzionalna rekonstrukcija i ultrastruktura mišjeg proksimalnog tubula. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611-619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Trodimenzionalna rekonstrukcija nefrona miša. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77-88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Sada možemo jasno vidjeti: optičko pročišćavanje i morfometriju bubrega. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017;26:179-186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Tehnike čišćenja i označavanja velikih bioloških tkiva. Mol ćelije. 2016;39:439-446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Leipzig, Njemačka: S. Hierzel; 1914.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Skala: kemijski pristup za FL fluorescentno oslikavanje i rekonstrukciju prozirnog mozga miša. Nat Neurosci. 2011;14:1481-1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al. Trodimenzionalni prikaz organa pročišćenih otapalom pomoću 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983-1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: metoda čišćenja bez deterdženta i otapala za neuronsko i ne-neuronsko tkivo. Razvoj. 2013;140:1364-1368.
12. Ke MT, Imai T. Optičko čišćenje fiksiranih uzoraka mozga pomoću SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY za mapiranje živčanog sustava. Nat metode. 2013;10:508-513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY za brzo i visoko razlučivo snimanje intaktnih tkiva. Nat Protoc. 2014;9:1682-1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Fenotipizacija jedne stanice unutar prozirnog intaktnog tkiva kroz čišćenje cijelog tijela. Ćelija. 2014; 158: 945-958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Snimanje cijelog mozga s rezolucijom jedne stanice korištenjem kemijskih koktela i računalne analize. Ćelija. 2014;157:726-739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Tomografsko molekularno oslikavanje i 3D kvantifikacija unutar organa odraslih miševa. Nat metode. 2007;4:31-33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Multifotonska mikroskopija očišćenih organa miša. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: jednostavna, brza metoda za imunološko označavanje velikih uzoraka tkiva za snimanje volumena. Ćelija. 2014; 159: 896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Poboljšana primjena tehnologije elektroforetskog čišćenja tkiva, CLARITY, na intaktne čvrste organe uključujući mozak, gušteraču, jetru, bubrege, pluća i crijeva. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Povećani glomerularni kapilarni tlak i veličina posreduju glomerulosklerozu u SHR jukstamedularnom korteksu. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365-F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Snimanje bubrega: od svjetlosne do super-rezolucijske mikroskopije. Nephrol Dial transplantacija. 2021;36:19-28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validacija trodimenzionalne metode za brojanje i određivanje veličine podocita u cijelim glomerulima. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093-3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Uloga trodimenzionalne arhitekture u mehanizmu koncentriranja urina unutarnje srži bubrega štakora. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271-F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Optičko pročišćavanje u bubregu otkriva remodeliranje tubula posredovano kalijem. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Kombinirana strukturna i funkcionalna slika bubrega otkriva velike aksijalne razlike u endocitozi proksimalnih tubula. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696-2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Policistična bolest bubrega. Nat Rev Dis Prim. 2018; 4:50.
29. Wilson PD. Policistična bolest bubrega. N Engl J Med. 2004;350:151-164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Promjene u obrascu glikozilacije tijekom embrionalnog razvoja mišjeg bubrega kako je otkriveno s lektinskim konjugatima. J Histochem Cytochem. 1987;35:55-65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Razvoj policistične bubrežne bolesti u juvenilnih cističnih bubrežnih miševa: uvid u patogenezu, abnormalnosti cilijara i zajedničke značajke s ljudskom bolešću. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821-2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Defekt u novoj kinazi Nek-obitelji uzrokuje cističnu bolest bubrega kod miševa i zebrica. Razvoj. 2002;129:5839-5846.
33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J, et al. T2 mapiranje magnetskom rezonancijom i difuzijski ponderirana slika za rano otkrivanje cistogeneze i odgovora na terapiju u mišjem modelu policistične bolesti bubrega. Kidney Int. 2017;92:1544-1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Molekularne determinante vaskularne specijalizacije nefrona u bubregu. Nat Commun. 2019;10: 5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endotelno-epitelna komunikacija u policističnoj bolesti bubrega: uloga signalizacije faktora rasta vaskularnog endotela. Stanični signal. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Mnogo gena - jedna bolest? Genetika nefronoftize (NPHP) i poremećaji povezani s NPHP-om. Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Regulacija staničnog ciklusa pomoću NEK obitelji protein kinaza. J Cell Sci. 2012;125:4423-4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. NEK8 mutacije utječu na cilijarnu i centrosomalnu lokalizaciju i mogu uzrokovati nefronoftizu. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587-592.
39. Wilson PD. Apiko-bazalni polaritet u epitelu policistične bolesti bubrega. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239-1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Toksična tubularna ozljeda u bubrezima miševa s delecijom Pkd1- ubrzava cistogenezu praćenu disreguliranim polaritetom planarnih stanica i kanonskim Wnt signalnim putovima. Hum Mol Genet. 2009; 18: 2532-2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Kritična razvojna promjena definira kinetiku formiranja bubrežne ciste nakon gubitka Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490-1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mehanizam jedinstvene osjetljivosti dubokih kortikalnih glomerula sazrijevajućih bubrega na tešku žarišnu glomerularnu sklerozu. Pediatr Res. 1990;28:270-276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Globalno optimalno spajanje popločanih 3D mikroskopskih slika. Bioinformatika. 2009; 25: 1463–1465.
