Zašto odgovor na receptor retinoične kiseline1 može pospješiti razvoj glomerularnih bolesti?

Responder1 receptora retinoične kiseline potiče razvoj glomerularnih bolesti putem signalnog puta nuklearnog faktora-kB

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Mo¨ller-Hackbarth1,2, Dina Dabaghie1,2, Emmanuelle Charrin1,2, Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3, Xidan Li1,3, Annika Wernerson4, Mark Lal5 i Jaakko Patrakka1,2

1 KI/AZ Integrirani kardiometabolički centar, Karolinska Institutet pri Sveučilišnoj bolnici Karolinska, Huddinge, Stockholm, Švedska; 2 Odjel za laboratorijsku medicinu, Odjel za patologiju, Karolinska Institutet pri Sveučilišnoj bolnici Karolinska, Huddinge, Stockholm, Švedska; 3 Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet pri Sveučilišnoj bolnici Karolinska, Huddinge, Stockholm, Švedska; 4 Odjel za kliničke znanosti, intervenciju i tehnologiju, Odjel za renalnu medicinu, Karolinska Institutet, Stockholm, Švedska; i 5 Bioscience Renal, Research, and Early Development Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Göteborg, Švedska

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Autorska prava ª 2021, Međunarodno nefrološko društvo. Izdavač Elsevier Inc. Ovo je članak s otvorenim pristupom pod licencom CC BY

Korespondencija: Jaakko Patrakka, Odjel za laboratorijsku medicinu, Odjel za patologiju, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Švedska. E-pošta: jaakko.patrakka@ki.se Primljeno 27. srpnja 2020.; revidirano 11. svibnja 2021.; prihvaćen 20. svibnja 2021.; objavljeno online 18. lipnja 2021

KLJUČNE RIJEČI: glomerularniendotelna stanica; NF-kB; podocit; Rarres1

Kod većine se aktiviraju upalni putoviglomerularne bolestiali molekularni mehanizmi koji ih pokreću u tkivu bubrega su slabo poznati. Identificirali smo seretinoična kiselinareceptor responder 1 (Rarres1) kao protein visoko obogaćen podocitima u zdravim bubrezima. Studije na nokautiranim životinjama specifičnim za podocite pokazale su da Rarres1 nije bio potreban za normalan razvoj ili održavanje barijere filtracije glomerula i nije modulirao ishod bolesti bubrega u modelu glomerulonefritisa. Zanimljivo je da smo detektirali indukciju ekspresije Rarres1 u endotelnim stanicama glomerula i peritubularnih kapilara kod IgA i dijabetičke bolesti bubrega, kao i kod vaskulitisa povezanog s ANCA. Analiza javno dostupnih skupova podataka RNA pokazala je da je indukcija ekspresije Rarres1 uobičajeni molekularni mehanizam kod kroničnih bubrežnih bolesti. Uvjetna knock-in linija miša, koja prekomjerno izražava Rarres1 specifično u endotelnim stanicama, nije pokazala nikakav očiti fenotip bubrega. Međutim, prekomjerna ekspresija je pospješila progresiju oštećenja bubrega u modelu glomerulonefritisa. U skladu s tim, uvjetno nokautirani miševi, bez Rarres1 u endotelnim stanicama, bili su djelomično zaštićeni u modelu bolesti. Mehanički gledano, Rarres1 je poticao upalu i fifibrozu putem signalnog puta transkripcijskog čimbenika Nuklearnog faktora-kB aktiviranjem receptorske tirozin kinaze Axl. Stoga je indukcija ekspresije Rarres1 u endotelnim stanicama prevladavajući molekularni mehanizam u ljudskim glomerulopatijama i čini se da to ima patogenu ulogu u pokretanju upale i fifibroze putem signalnog puta nuklearnog faktora-kB.

Prijevodna izjava

Identificirali smo povećanje regulacijeretinoična kiselinareceptor protein responder 1 (Rarres1) u endotelnim stanicama (ECs) uobičajenih ljudskih glomerulopatija. Čini se da indukcija ima patogenu ulogu uglomerularna bolestbudući da je progresija glomerulonefritisa bila (i) pogoršana u miša koji je prekomjerno eksprimirao Rarres1 specifično u ECs, i (ii) poboljšana u EC-specifičnoj Rarres1 nokaut liniji. Rarres1 može biti biomarker za otkrivanje mikrovaskularnog oštećenja kod bolesti bubrega i potencijalno nova terapijska meta.

Bolest glomerulaprocesi su glavni uzrok završnog stadija bubrežne bolesti. Dijabetička nefropatija (DN) globalno je najčešći uzrok završnog stadija bubrežne bolesti, dok je IgA nefropatija (IgAN) najčešći primarni glomerulonefritis (GN).1,2 Histološki, oštećenje glomerula kod ovih uobičajenih poremećaja manifestira se vrlo sličnim moda. To uključuje aktivaciju glomerularnih endotelnih stanica (GEC), širenje izvanstaničnog matriksa, proliferaciju mezangijalnih stanica, oštećenje podocita i na kraju gubitak podocita.3

Studije profiliranja globalnog transkripta u biopsijama ljudskih bubrega pokazale su snažan upalni potpis kod glomerularnih poremećaja,4-7, a studije na miševima pokazale su da aktivacija nuklearnog faktora-kB (NF-kB) i transformirajućeg faktora rasta-b (TGF-b) signalni putovi imaju važnu ulogu u napredovanju bolesti.8,9 Važno je da farmaceutsko ciljanje puta NF-kB ima renoprotektivne učinke u životinjskim modelima, što ukazuje da je put potencijalna meta za liječenjeglomerularne bolesti.10,11 U podocitima smo nedavno identificirali član B skupine 5 skupine 5 receptora G proteina spregnutog kao modulator upalnog odgovora posredovanog NF-kB.12 Međutim, aktivaciju upalnih putova u glomerulopatijama vjerojatno pokreću više tipova stanica . Zapravo, aktivacija NF-kB signalnog puta otkrivena je u GEC-ima u mnogim ljudskim bubrežnim bolestima.13,14 Molekularni mehanizmi uključeni u aktivaciju NF-kB u GEC-ima slabo su poznati.

Responder1 receptora retinoične kiseline može pospješiti razvojBolesti glomerula

U ovoj studiji analizirali smo molekularne potpise čovjekaglomerularne bolestii identificirao indukcijuretinoična kiselinaekspresija receptora respondera 1 (Rarres1) u GEC-ovima kao uobičajeni molekularni potpis kod vaskulitisa povezanih s DN, IgAN i anti-neutrofilnim citoplazmatskim autoantitijelima (ANCA). Studije na linijama miševa s aktivacijom/inaktivacijom ekspresije Rarres1 u endotelnim stanicama (EC) pokazuju da ova indukcija ima patogenu ulogu u mišjem modelu GN. Mehanički gledano, Rarres1 aktivira receptor tirozin kinaze Axl, što dovodi do aktivacije NF-kB signalnog puta. Predlažemo Rarres1 kao novi biomarker mikrovaskularnog oštećenja koji bi mogao biti atraktivna terapeutska meta zaglomerularna bolestprocese moduliranjem upalnih odgovora.

Slika 1|(Nastavak) (c) BackSPIN analiza koja pokazuje ekspresiju Rarres1 specifično u podocitima (PD) u podacima RNAseq tkiva mišjeg bubrega (podaci iz Woroniecka et al.6). (d) Relativne razine mRNA Rarres1 u izoliranim Tub i Glom iz ljudskih uzoraka. Podaci su izraženi kao višestruka promjena ekspresije Rarres1 u Glomu u usporedbi s Tub. *P < 0.05="" u="" odnosu="" na="" tub.="" (e)="" reprezentativna="" konfokalna="" fl="" fluorescentna="" mikroskopska="" slika="" ekspresije="" rarres1="" (zeleno)="" podocita="" u="" ljudskim="" glomerulima="" normalnih="" subjekata.="" (f)="" reprezentativne="" konfokalne="" mikroskopske="" slike="" koje="" pokazuju="" ekspresiju="" rarres1="" u="" podocitima="" ljudskih="" subjekata;="" vimentin="" je="" korišten="" kao="" marker="" za="" glavne="" procese,="" a="" nefrin="" kao="" marker="" za="" nožne="" procese="" podocita.="" cd31="" korišten="" je="" kao="" marker="" za="" endotelne="" stanice,="" a="" ⍺-aktin="" glatkih="" mišića="" (⍺sma)="" korišten="" je="" kao="" marker="" mezangijalnih="" stanica.="" šipke="50/10" mm.="" podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="" sem.="" studentov="" t-test="" korišten="" je="" za="" usporedbe="" između="" 2="" skupine.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

METODE

Ekstrakcija RNK i lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu

Glomeruli su izolirani kao što je prethodno opisano.15 RNA je ekstrahirana korištenjem TRIzol reagensa (Invitrogen) i RNeasy Kit (Qiagen Inc.). Za generiranje cDNA korišten je iScript cDNA Synthesis Kit. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze provedena je korištenjem CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System sa SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Upotrijebljeni primeri navedeni su u Dodatnoj tablici S1. Relativne razine ekspresije izračunate su pomoću 2-DDCT metode.

Kultura stanica

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – plazmid (VectorBuilder Inc. Klonovi su se proširili pod selekcijom puromicina (Merck KGaA). Transfekcija kratke interferirajuće RNA (siRNA) za Axl/Rarres1 provedena je korištenjem siRNA iz Origenea. Stanice su transfektirane s 30 nM siRNA nakon čega slijedi kompleksiranje s JetPEI transfekcijskim reagensom (Polyplus-transfection SA) sa ili bez TGF-b1 podražaja (10 ng/ml u mediju kulture). Axl-inhibitor R428 (Selleck Chemicals) dodan je 1 sat prije tretmana (3 mmol/ l).

Zašto Receptor Receptor Retinoic Acid Responder1 može pospješiti razvojBolesti glomerula?

Western blot

Stanice su lizirane RIPA puferom za lizu dopunjenim koktelima za inhibiciju proteaze/fosfataze (Roche). Proteini iz nuklearnih frakcija izolirani su korištenjem Nuclear Extract Kit (Active Motif Europe). Lizati su odvojeni na 4 posto – 12 posto tris-glicin natrij dodecil sulfat – poliakrilamid gelu (Invitrogen) i prebačeni na membrane od poliviniliden difluorida (Bio-Rad). Membrane su blokirane s 5 postotnim goveđim serumskim albuminom (Merck). Inkubacija s primarnim protutijelima provedena je preko noći (antitijela u Dodatnoj tablici S2). Za otkrivanje signala korištena su sekundarna antitijela konjugirana s peroksidazom hrena i Clarity Western ECL supstrat (Bio-Rad). Western blot analize provedene su najmanje dva puta.

RNA in situ hibridizacija

Analize RNAscope su provedene u ljudskim bubrezima ugrađenim u parafin prema protokolu proizvođača (ACD). Upotrijebljene sonde bile su NPHS1 - kat br. 416071-C2, PECAM1 - kat br. 487381-C3 i RARRES1 - prilagođena sonda koja cilja nukleotide {{8 }}.

Procjena ozljede bubrega

Omjer albumina i kreatinina u urinu procijenjen je korištenjem Mouse Albumin ELISA Kit (Allbuwell M; Ethos Biosciences) i QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems). Bubrežna tkiva su fiksirana u 10 postotnoj neutralnoj puferiranoj otopini formalina i uklopljena u parafin, nakon čega je uslijedilo rezanje i periodično obojenje kiselinom po Schiffu. Elektronska mikroskopija je provedena na uzorcima fiksiranim u 2,5 postotnom glutaraldehidu.

Imunološki bojenje

Tkiva uklopljena u parafin fiksirana su 24 sata u formalinu. Sekcije od pet mikrometara su deparafinizirane i mikrovalno obrađene ili u puferu Tris-etilendiamin tetraoctene kiseline (10 mM Tris baza, 1 mM otopina pufera etilendiamintetraoctene kiseline, 0.05 posto Tween 20, pH 9.0) ili natrijev citratni pufer (10 mM natrijev citrat, 0,05 posto Tween 20, pH 6,0), nakon čega slijedi permeabilizacija s 0,3 posto Triton X-100 i blokira s 10 posto normalnog kozjeg seruma, 3 posto vodikove peroksidaze i Vector Blocking Kit (Vector Laboratories). Stakalca su razvijena korištenjem kompleta supstrata DAB peroksidaze (peroksidaze hrena), 3,30 -diaminobenzidina (Vector Laboratories).

Za smrznute rezove, rezovi fiksirani acetonom permeabilizirani su s 0.1 posto Tween 20 i blokirani s 10 posto normalnog kozjeg seruma. Primarna korištena protutijela navedena su u Dodatnoj tablici S1. Alexa-Fluor sekundarna antitijela za imunofluorescenciju dobivena su od Molecular Probes (Life Technologies). Slike su dobivene pomoću konfokalnog mikroskopa Leica SP8 (Leica Microsystems).

Ljudski uzorci

Biopsije bubrega dobivene su iz Sveučilišne bolnice Karolinska (Stockholm, Švedska). Kontrolni uzorci dobiveni su iz zdravih polova bubrega pojedinaca koji su bili podvrgnuti nefrektomiji tumora. Lokalno etičko povjerenstvo odobrilo je studiju (br. odobrenja 2010/579-31/1, Stockholm, Švedska).

u odnosu na kontrolu (Ctrl.) ili ***P < {{0}}.001="" u="" odnosu="" na="" si-negativnu="" kontrolu="" (kodiranje)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (c)="" reprezentativni="" western="" blot="" dokumenti="" i="" sažeti="" podaci="" koji="" pokazuju="" relativne="" razine="" proteina="" pp65="" u="" izoliranim="" nuklearnim="" frakcijama="" podocita="" tretiranih="" s="" 10="" ng/ml="" tgf-b1.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" naspram="" kontrolnih="" podocita="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" reprezentativni="" western="" blot="" dokumenti="" i="" sažeti="" podaci="" koji="" pokazuju="" relativne="" razine="" proteina="" pp65="" u="" izoliranim="" nuklearnim="" frakcijama="" podocita="" tretiranih="" s="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±3="" mmol/l="" r428,="" n="2." (e)="" reprezentativni="" western="" blot="" koji="" pokazuje="" da="" prekomjerna="" ekspresija="" rarres1="" konstitutivno="" aktivira="" axl.="" *p="">< 0,05="" (n="2)." (f)="" relativne="" razine="" mrna="" gena="" povezanih="" s="" emt-om="" u="" podocitima="" koji="" prekomjerno="" izražavaju="" rarres1="" (rarres1)="" ili="" kontrolnim="" podocitima="" (ctrl.)="" transficiranim="" sirna="" za="" axl="" (siaxl),="" si-negativna="" kontrola="" (scramble),="" ##p="">< 0,01,="" ##="" #p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" scramble,="" n="3," ili="" tretirano="" s="" 3="" mmol/l="" r428.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" kontrolnu="" vrijednost,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" rarres1,="" *p="">< 0,05="" u="" odnosu="" na="" rarres1,="" n="4." podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="" sd.="" studentov="" t="" test="" korišten="" je="" za="" usporedbe="" između="" 2="" skupine.="" ut,="">

Slika 3|Utvrđivanje podocit-specifičnih Rarres1 knockout (CreD/Rarres1flfl/flfl) miševa. (a) Generacija uvjetno nokautiranih miševa kod kojih je Rarres1 specifično abliran u podocitima korištenjem rekombinacijskog sustava Cre-LoxP. Ekson 3 je izbrisan na NPHS2-Cre-posredovanoj rekombinaciji. (b) Genotipizacija je potvrđena preparacijom repa i lančanom reakcijom polimeraze u dobi od 4 tjedna. (nastavak)

Slika 3|(Nastavak) (c) Reprezentativni Western blot koji pokazuje smanjenu ekspresiju Rarres1 u izoliranim glomerulima iz Rarres1 nokautiranih (Creþ/Rarres1flfl/flfl) miševa specifičnih za podocite. (d) Gubitak Rarres1 specifičan za podocite ne utječe na razine albuminurije u miševa liječenih nefrotoksičnim serumom (NTS) prema analizi omjera albumina i kreatinina u mokraći u različitim skupinama miševa (NTS-ctrl., n {{1{{ 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Fotomikrografije i kvantifikacije koje pokazuju tipične promjene strukture glomerula u različitim skupinama miševa. Glomerularne lezije identificirane su u rezovima obojenim periodičnom kiselinom po Schiffu. #P < 0.0001="" u="" odnosu="" na="" netretiranu="" kontrolu="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" reprezentativne="" fotomikrografije="" i="" kvantifikacije="" srednje="" debljine="" glomerularne="" bazalne="" membrane="" (gbm)="" i="" broja="" proreza="" po="" mm="" gbm="" u="" različitim="" skupinama="" miševa="" analizama="" transmisijske="" elektronske="" mikroskopije.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001,="" ####p="">< 0,0001="" u="" odnosu="" na="" netretiranu="" kontrolu="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="" sem.="" jednosmjerna="" analiza="" varijance="" praćena="" tukeyjevim="" naknadnim="" testom="" za="" višestruke="" usporedbe="" korištena="" je="" za="" grupe="" od="" 3="" ili="" više.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

Linije miša

Floxed Rarres1 miševi s C57Bl/6J pozadinom (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) bili su podocin (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) i Tie2 cre miševi (B6.Cg-Tg( Tek-cre)12Flv/J) za generiranje nokaut miševa specifičnih za stanice. Miševi GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J križani su s linijom Tie2-cre kako bi se aktivirala ekspresija Rarres1 specifično u EC-ima.17 Uzgoj i genotipizacija obavljeni su prema standardu postupci. Sve studije na životinjama provedene su u pretkliničkom laboratoriju (Karolinska Institutet) u skladu s relevantnim smjernicama i propisima i odobrilo ih je Etičko povjerenstvo za istraživačku skrb o životinjama (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336).

Nefropatija kod miševa izazvana nefrotoksičnim serumom (NTS).

Miševi stari sedam do 9- tjedana primili su 50 ml kompletnog Freundovog adjuvanta (Merck) sc, nakon čega je uslijedila injekcija NTS (iv; 6 ml/kg tjelesne težine; Probetex Inc.) 4.18. Urin je sakupljen 3, 7 , 10 i 14 dana nakon injekcije, a miševi su ubijeni 14. dana.

Statistička analiza

Statistička analiza provedena je pomoću softvera Prism 9.0 (GraphPad).

Podaci su prvo ispitani na normalnost (Shapiro-Wilkov test). Kada je distribucija bila Gaussova, podaci su analizirani pomoću parametarskog testa (Studentov t-test za 2 skupine i analiza varijance s Tukeyjevim post-testom za više od 2 skupine). Kada distribucija nije bila Gaussova, korišteni su neparametarski testovi (Friedmanov test s Dunnovim post-testom za više od 2 skupine i Mann-Whitney U test za 2 skupine). Razlike su se smatrale značajnim kada je P <>

REZULTATI

Rarres1 eksprimiraju podociti

Prvo smo procijenili uzorak ekspresije Rarres1 u tkivu mišjeg i ljudskog bubrega. Analize lančane reakcije polimerazom pokazale su da se Rarres1 eksprimira značajno više u glomerularnoj nego u tubulointersticijskoj frakciji mišjeg bubrežnog korteksa (Slika 1a i b6). Jednostanična analiza RNA sekvenciranja tkiva mišjeg bubrega otkrila je da se Rarres1 isključivo eksprimira u podocitima (Slika 1c). Kod ljudi je Rarres1 također bio obogaćen glomerularnim tkivom (Slika 1d). U imunofluorescenciji normalnog tkiva ljudskog bubrega, Rarres1 je pokazao visok signal u glomerulima (Slika 1e). Dvostruko bojenje pokazalo je da je Rarres1 lociran "izvan" reaktivnosti nefrina u kapilarnim petljama, što ukazuje na ekspresiju podocita (Slika 1f). Kolokalizacija vimentinom ukazuje na lokalizaciju glavnih procesa. Nije primijećena preklapajuća reaktivnost za EC marker CD31 ili mezangijski marker - aktin glatkih mišića (Slika 1f).

Rarres1 potiče NF-kB i TGF-b1 signalizaciju putem receptora tirozin kinaze Axl

Kako bismo razjasnili ulogu Rarres1 u podocitima, manipulirali smo razinama njegove ekspresije u besmrtnim ljudskim podocitima.16 Razine Rarres1 bile su značajno povišene u podocitima koji su stabilno transficirani ljudskom Rarres1 cDNA i smanjene nakon transfekcije Rarres1-ciljanom siRNA (slika 2a). Prekomjerna ekspresija Rarres1 povećala je ekspresiju gena povezanih s prijelazom epitel-mezenhim, dok je regulacija endogenog Rarres1 imala suprotan učinak (slika 2b). Budući da NF-kB signalizacija ima važnu ulogu u epitelno-mezenhimskom prijelazu koji dovodi do fifibroze i upale u GN,19 mjerili smo TGF-b1-induciranu NF-kB signalnu aktivaciju in vitro. Prekomjerna ekspresija Rarres1 uzrokovala je povećanu aktivaciju puta NF-kB na početku i nakon stimulacije TGF-b1 (Slika 2c). Kako je objavljeno da Rarres1 aktivira receptorsku tirozin kinazu Axl i na taj način promiče NF-kB signalni put kod upalnog raka dojke,20 procijenili smo je li Axl potencijalni funkcionalni partner Rarres1 u tkivu bubrega. Aktivacija NF-kB izazvana TGF-b1 mogla bi biti inhibirana R428, selektivnim inhibitorom male molekule Axl kinaze21,22 (Slika 2d), a prekomjerna ekspresija Rarres1 pozitivno je korelirala s konstitutivnom aktivacijom Axl kinaze (Slika 2e). Smanjenje aktivnosti Axl s R428, ali ne i utišavanje gena Axl pomoću siRNA, moglo bi umanjiti Rarres1-induciranu ekspresiju gena povezanih s prijelazom epitela u mezenhim, što je dokazano smanjenim razinama mRNA (Slika 2f). Treba napomenuti da nije otkrivena nikakva aktivacija nekanonskih NF-kB putova (dodatna slika S1). Stoga je Rarres1 promovirao NF-kB signalizaciju u uzgojenim podocitima putem aktivacije Axl kinaze.

Zašto odgovor na receptor retinoične kiseline1 može pospješiti razvoj glomerularnih bolesti?

Inaktivacija Rarres1 u podocitima ne dovodi do glomerularnih abnormalnosti niti modulira ishod nefropatije u GN modelu anti-glomerularne bazalne membrane (GBM)

Kako bismo analizirali ulogu Rarres1 u podocitima in vivo, generirali smo novu Rarres1flfl/flfl (floksiranu) liniju miševa i križali je s podocin-Cre miševima kako bismo proizveli Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl miševe (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) (Slika 3a ). Genotipovi za floxed/Cre alele identificirani su genotipizacijom uha (Slika 3b). Analiza polimerazne lančane reakcije tubulointersticijske i glomerularne frakcije, kao i jetrenog tkiva, potvrdila je deleciju egzona 3 posebno u glomerulu (dodatna slika S2A), a razine proteina Rarres1 smanjene su u glomerulima Creþ/Rarres1flfl/flfl miševa (slika 3c).

Slika 4|Pojačana regulacija Rarres1 u endotelnim stanicama glomerula i peritubularnih kapilara u bolesnika s kroničnom bolešću bubrega. (a) Analize ekspresije gena Rarres1, kolagen1a2 (COL1A2) i nefrina (NPHS1) u podacima mikromreža glomerula izoliranih od pacijenata s dijabetičkom nefropatijom (DN), vaskulitisom, IgA nefropatijom (IgAN) i kontrolnih (Ctrl.) subjekata. 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" u="" odnosu="" na="" kontrolne="" subjekte.="" (b)="" kvantitativna="" analiza="" lančane="" reakcije="" polimeraze="" za="" gene="" rarres1,="" col1a2="" i="" nphs1="" u="" izoliranim="" glomerulima="" pacijenata="" s="" dn="" (n="5)" i="" kontrola="" (n="5)." **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" kontrolne="" subjekte.="" (c)="" analize="" ekspresije="" gena="" rarres1="" i="" col1a2="" u="" podacima="" mikromreže="" tubularne="" frakcije="" izolirane="" iz="" dn,="" vaskulitisa,="" igan="" i="" kontrolnih="" pacijenata.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001 u="" odnosu="" na="" kontrolne="" subjekte.="" (d)="" reprezentativne="" fotomikrografije="" rarres1="" imunohistokemijskog="" bojenja="" u="" kortikalnom="" tkivu="" ljudskog="" bubrega="" od="" kontrola="" i="" pacijenata="" s="" dn="" (n="5)," vaskulitisom="" protiv="" neutrofilnih="" citoplazmatskih="" autoantitijela="" (anca)="" (n="4)" i="" igan="" (="" n="5)." strelice="" označavaju="" rarres1-pozitivne="" podocite="" (kontrola)="" i="" endotelne="" stanice="" (ec)="" (dn,="" igan="" i="" vaskulitis).="">

Slika 4|(Nastavak) (e) Reprezentativne konfokalne mikroskopske slike koje pokazuju ekspresiju Rarres1 u glomerulima pacijenata s DN. CD31 je korišten kao marker za EC. Šipke=50/10 mm. (f) Reprezentativne konfokalne FL fluorescentne slike RNAscope-a koje pokazuju ekspresiju gena Rarres1 u PECAM1-koekspresijskim stanicama u tubularnoj frakciji pacijenata s DN. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost±SEM. Studentov t-test korišten je za usporedbe između 2 skupine. Šipke=50/10 mm. Kako biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte internetsku verziju ovog članka na www.kidney-international.org.

Creþ/Rarres1flfl/flfl miševi rođeni su s očekivanim Mendelovim omjerom nasljeđivanja i bili su održivi i plodni (podaci nisu prikazani). Bubrezi se nisu razlikovali od kontrolnih srodnika iz legla (Cre- /Rarres1flfl/flfl) kako je analizirano rutinskim svjetlosnim i elektronskim mikroskopskim pregledom (dodatna slika S2B i C). Također, distribucija podocitnih proteina nefrina i sinaptopodina nije bila promijenjena u Creþ/Rarres1flfl/flfl miševa (dodatna slika S2D)

Kako bi se razjasnila uloga Rarres1 u ozljedi bubrega in vivo, Creþ/Rarres1flfl/flfl liječeni su NTS-om koji dovodi do naslaga IgG u GBM, albuminurije i progresivnog GN.23 Razine albuminurije bile su slične u Creþ/Rarres1flfl/flfl i kontrolnoj skupini miševi (slika 3d). Svjetlosni mikroskopski pregled nije otkrio značajne razlike u udjelu zahvaćenih glomerula (Slika 3e). Elektronska mikroskopija nije pokazala razliku u debljini GBM-a ili uklanjanju procesa stopala, a činilo se da su GEC-ovi podjednako pogođeni u obje skupine (Slika 3f). Markeri podocita nefrin, Wt1 i sinaptopodin bili su pogođeni na sličan način u obje skupine (dodatna slika S3A). Također, bojenje za EC pomoću CD31 nije pokazalo razlike u glomerulima ili peritubularnim kapilarama između skupina (dodatna slika S3B i C). Osim toga, ekspresija fifibroze i gena povezanih s upalom bila je na sličan način povišena u obje skupine liječene NTS-om (dodatna slika S4).

Ekspresija Rarres1 inducirana je u glomerularnim i peritubularnim kapilarnim EC kod kronične bubrežne bolesti (CKD)

Kako bismo istražili ulogu Rarres1 u CKD-u, analizirali smo njegovu ekspresiju u javno dostupnim skupovima podataka o RNK. Uočili smo značajno povišene razine Rarres1 u glomerulima izoliranim od pacijenata s DN-om, vaskulitisom povezanim s ANCA-om i IgAN-om (Slika 4a), 4,6,24-26, dok su drugi geni povezani s podocitima, na primjer, nefrin, bili značajno sniženi ili nepromijenjeni . Naša kvantitativna analiza lančane reakcije polimerazom glomerula izoliranih od pacijenata s DN (n=5) potvrdila je indukciju ekspresije Rarres1 (Slika 4b). Zbog gubitka podocita, ekspresija gena podocita obično je smanjena u progresivnomglomerularne bolesti,6 i omjer glomerularne ekspresije Rarres1 i nefrina povećan je približno 20-puta u DN u odnosu na zdrave glomerule (Slika 4b). Ekspresija Rarres1 također je bila regulirana prema gore u skupovima podataka tubulointersticijalnog tkiva u DN, vaskulitisu povezanom s ANCA i IgAN (Slika 4c).8-11

Zatim smo imunohistokemijski analizirali ekspresiju Rarres1 u biopsijama bubrega pacijenata s DN (n=5), IgAN (n=5) i vaskulitisom povezanim s ANCA (n=4). U oboljelim glomerulima, čini se da je bojenje Rarres1 lokalizirano na GEC-ove kao što je prikazano imunoreaktivnošću na unutarnjoj strani stijenki kapilara (Slika 4d, umetci), dok se signal iz podocita činio slabijim. U tubulointersticijskom prostoru, bojanje je otkriveno u peritubularnim kapilarama (Slika 4d, umetci), što ukazuje na ekspresiju EC. Dvostruko imunoobilježavanje s CD31 potvrdilo je lokalizaciju na EC u glomerulima i peritubularnim kapilarama (Slika 4e). Slično, dvostruki RNAscope eksperimenti pokazali su kolokalizaciju Rarres1 mRNA s PECAM1 mRNA u DN (Slika 4f). Uzevši zajedno, indukcija ekspresije Rarres1 u glomerularnim i peritubularnim kapilarnim EC bila je uobičajena pojava u CKD.

Generiranje i karakterizacija linije miša koja prekomjerno izražava Rarres1 u EC-ima

Kako je Rarres1 induciran u humanoj CKD, generirali smo novu transgenu mišju liniju u kojoj je Rarres1 cDNA uvedena u lokus Rosa26 ispod CAG promotora,27 s lox-STOP-lox kazetom između akceptorskih mjesta spajanja (Slika 5a). Linija je križana s linijom Tie2-cre da bi se stvorili miševi Rarres1_Tie2_KI, a miševi su identificirani genotipizacijom uha za alele knockin i Cre (Slika 5a). Rarres1_Tie2_KI miševi pokazali su značajno povećane razine proteina Rarres1 u bubrežnom tkivu (Slika 5b), a uspješna strategija kucanja dodatno je potvrđena analizom ekspresije mRNA Rarres1 u FACS-sortiranim GFP-pozitivnim GEC-ovi (Slika 5c).

Fenotipizirali smo bubrege Rarres1_Tie2_KI miševa i kontrolnih miševa u skupinama iste dobi. Svjetlosnim mikroskopskim pregledom, morfologija bubrega nije se mogla razlikovati u Rarres1_Tie2_KI miševa od kontrolnih srodnika iz legla (Slika 5d). Slično, elektronska mikroskopija pokazala je nepromijenjenu debljinu GBM-a i širinu nastavka podocita (Slika 5e). Štoviše, čini se da ekspresija podocitnih markera nefrina i sinaptopodina nije pogođena u glomerulima koji prekomjerno eksprimiraju Rarres1 (Slika 5f). Treba napomenuti da drugi glavni organi nisu makroskopski ili mikroskopski pokazali nikakve očite abnormalnosti (podaci nisu prikazani).

Slika 5|Uspostava Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) miševa specifičnih za endotelne stanice. (a) Generacija uvjetno kucajućih miševa kod kojih je ekspresija Rarres1 specifično inducirana u endotelnim stanicama (EC) korištenjem rekombinacijskog sustava Cre-LoxP. Tie2-Cre miševi križani su s miševima koji eksprimiraju ciljani vektor (Rarres1_casetteþ), koji sadrži lox-STOP-lox kazetu između spajanja (nastavak)

Slika 5|(nastavak) akceptorska mjesta i Rarres1 cDNA ispod CAG promotora, koji je uveden u lokus Rosa26, identificirani su genotipizacijom uha. Genotipizacija je potvrđena preparacijom uha i lančanom reakcijom polimerazom (PCR) u dobi od 4 tjedna. (b) Reprezentativni Western blot koji pokazuje povećanu ekspresiju Rarres1 u bubrežnom korteksu iz EC-specifičnih Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) miševa. **P < 0.01="" naspram="" kontrole="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_izjednačeno2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" test).="" (c)="" kvantitativni="" pcr="" za="" rarres1="" u="" izoliranim="" ec-ima.="" **p=""><0,01 u="" odnosu="" na="" kontrolu="" (cre-="" arres1_izjednačeno2_ki,="" n="3," studentov="" t-test).="" (d)="" reprezentativne="" fotomikrografije="" sekcija="" obojenih="" periodnom="" kiselinom="" po="" schiffu="" koje="" pokazuju="" tipične="" glomerularne="" strukture="" u="" različitim="" skupinama="" miševa.="" (e)="" reprezentativne="" fotomikrografije="" i="" kvantifikacije="" srednje="" debljine="" glomerularne="" bazalne="" membrane="" (gbm)="" i="" broja="" proreza="" po="" mm="" gbm="" u="" različitim="" skupinama="" miševa="" analizama="" transmisijske="" elektronske="" mikroskopije="" (studentov="" t-test).="" (f)="" reprezentativne="" konfokalne="" mikroskopske="" slike="" koje="" pokazuju="" ekspresiju="" podocit-specifičnog="" markera="" sinaptopodina="" i="" nefrina="" u="" ec-specifičnim="" rarres1="" knock-in="" miševima="" (rarre1_tie2_ki)="" i="" ctrl.="" miševi.="" šipke="10" mm.="" podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="" sem.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

Indukcija Rarres1 u EC-ima modulira signalni put NF-kB i ishod nefropatije reguliranjem Axl aktivacije

Kako bismo procijenili modulira li ekspresija Rarres1 u ECs napredovanje bolesti, inducirali smo GN u transgenih miševa i njihovih srodnika iz legla jednom injekcijom NTS-a. Rarres1_- Tie2_KI miševi razvili su značajno više razine albuminurije od kontrolnih nakon 3 dana, dok nije primijećena značajna razlika u albuminuriji nakon 7, 10 i 14 dana (Slika 6a). Histološka analiza 14 dana nakon indukcije pokazala je da Rarres1_Tie2_KI miševi nisu imali više glomerularnih promjena, kao što su sklerotične i polumjesečaste lezije (Slika 6b). Elektronska mikroskopska procjena pokazala je, međutim, znatno deblji GBM i više brisanja procesa stopala u Rarres1_Tie2_KI miševa (Slika 6c). Nadalje, Rarres1_Tie2_KI miševi pokazali su povećane razine -aktina glatkih mišića u korteksu bubrega (Slika 6d). Analiza markera podocita nefrina, sinaptopodina i WT1 pokazala je duboko smanjenje što ukazuje na dediferencijaciju i značajan gubitak podocita (Slika 6d). Važno je da su glomeruli Rarres1_Tie2_KI pokazali manje WT1-pozitivnih podocita u usporedbi s kontrolnim životinjama, što ukazuje da Rarres1 s ekspresijom EC potiče oštećenje podocita. Također, više fibrinskih tromba otkriveno je u glomerulima Rarres1_Tie2_KI (Slika 6e). U skladu s tim, ekspresija različitih gena povezanih s upalom, fifibrozom i oštećenjem bubrežnih tubula značajno je pojačana u Rarres1_- Tie2_KI miševa kao što je prikazano analizom lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu za Il -1beta, Col1a1, TGF-b1 i molekula oštećenja bubrega-128 u tkivu kore bubrega (Slika 6f). Međutim, nisu otkrivene razlike u vrijednostima dušika ureje u krvi i S-kreatinina između skupina (Slika 6g). Također, bojenje za EC pomoću CD31 nije pokazalo razlike u glomerulima ili peritubularnim kapilarama između skupina (dodatna slika S5A i B). Uzevši zajedno, EC-specifična indukcija ekspresije Rarres1 pogoršala je glomerularnu patologiju u nefropatiji izazvanoj NTS-om.

Mehanički, analizirali smo je li prekomjerna ekspresija Rarres1 u EC-ima potaknula aktivaciju Axl i NF-kB signalizacije in vivo, slično našim in vitro opažanjima (Slika 2). I Rarres1_Tie2_KI i kontrolni miševi tretirani NTS-om pokazali su aktivaciju Axl signalnog puta kao što je prikazano povećanom Axl fosforilacijom (Slika 6h). Međutim, ova je aktivacija bila značajnija u Rarres1_- Tie2_KI miševa (Slika 6h). Sukladno tome, aktivacija puta NF-kB bila je promovirana u ovih miševa kao što je prikazano brojem pP65-pozitivnih jezgri u glomerulima (Slika 6i). Kada su razine pP65 izmjerene Western blotingom, otkrili smo sličan trend za aktivaciju puta NF-kB iako to nije bilo značajno, vjerojatno zbog jednog outliera (dodatna slika S5C).

Inaktivacija Rarres1 u EC smanjuje oštećenje glomerula u modelu anti-GBM glomerulonefritisa

Kako bismo potvrdili patogenu ulogu Rarres1 izvedenog iz EC-a u CKD-u, generirali smo liniju miša u kojoj je Rarres1 izbrisan u EC-ima pomoću Tie2-Cre (Slika 7a). Genotipovi za floxed i Cre alele identificirani su genotipizacijom uha (Slika 7b). Postojao je trend pojačane regulacije Rarres1 u miševa tretiranih s NTS-om, koji je ukinut u Rarres1_Tie2_KO miševa (Slika 7c). Miševi nisu pokazali nikakve očite abnormalnosti bubrega (podaci nisu prikazani). Injekcija NTS-a izazvala je sličnu albuminuriju u Rarres1_Tie2_KO i kontrola (Slika 7d). Međutim, histološka analiza 14 dana nakon indukcije pokazala je manje glomerularnih promjena u Rarres1_- Tie2_KO miševa (Slika 7e). U elektronskoj mikroskopiji, miševi Rarres1_Tie2_KO pokazali su manje brisanja procesa stopala i zadebljanja GBM (Slika 7f). Imunološko bojenje nije pokazalo značajne razlike za aSMA, nefrin ili sinaptopodin (Slika 7g). Međutim, broj WT1-pozitivnih podocita bio je značajno veći u Rarres1_Tie2_KO miševa (Slika 7g). Bojanje na pP65 pokazalo je smanjeni broj pozitivnih jezgri u glomerulima Rarres1_Tie2_KO što ukazuje na uključenost NF-kB signalnog puta (Slika 7h).

Slika 6|(nastavak) kvantifikacija srednje debljine glomerularne bazalne membrane (GBM) i broja proreza po mm GBM u različitim skupinama miševa transmisijskim elektronskim mikroskopskim analizama (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Izjednačeno2_KI, n=12). (d) Reprezentativne konfokalne mikroskopske slike koje pokazuju ekspresiju nefrina, sinaptopodina, ⍺-aktina glatkih mišića (⍺Sma) i WT1 u bubrezima različitih skupina miševa. Šipke {{10}}/10 mm. ⍺Sma–pozitivno područje brojano je po kortikalnom presjeku, a WT1 je brojano po glomerulu (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Izjednačeno2_KI, n {{20}}). (e) Prisutnost fibrinskih tromba u glomerulima otkrivena bojanjem trihoma (brojeno po presjeku glomerula) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Izjednačeno2_KI, n=5). (f) Relativne razine mRNA različitih gena povezanih s upalom, fifibrozom i oštećenjem bubrežnih tubula u korteksu bubrega miševa liječenih NTS-om (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_Izjednačeno2_KI, n=6–10). (g) Razine serumskog kreatinina i dušika uree u krvi (BUN) u NTS-ctrl. (n=3) i NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3) miševi. (h) Reprezentativni Western blot dokumenti i sažeti podaci koji pokazuju relativne razine proteina Paxila u korteksu bubrega u različitim skupinama miševa tretiranih NTS-om (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Kravata2_KI, n=5). (i) Reprezentativne fotomikrografije pP65 imunohistokemijskog bojenja u bubrežnom kortikalnom tkivu iz različitih skupina miševa tretiranih NTS-om. pP65-pozitivne jezgre po glomerulima kvantificirane su u različitim skupinama miševa (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). EC-specifični Rarres1 knock-in miševi (Rarres1_Tie2_KI miševi); miševi s Rarres1 kazetom i bez Cre ekspresije (Ctrl.) korišteni su kao kontrola. #P < 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" netretiranu="" kontrolu="" (ctrl.),="" *p="">< 0,05="" u="" odnosu="" na="" nts-tretiranu="" kontrolu="" (nts-kontrola).="" podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="" sem.="" studentov="" t-test="" korišten="" je="" za="" usporedbe="" između="" 2="" skupine.="" jednosmjerna="" analiza="" varijance="" praćena="" tukeyjevim="" naknadnim="" testom="" za="" višestruke="" usporedbe="" korištena="" je="" za="" grupe="" od="" 3="" ili="" više.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

RASPRAVA

Rarres1 je prvi put identificiran u kulturama kožnih splavova tretiranih tazarotenom29 i pokazalo se da djeluje kao represor invazije u staničnim linijama raka prostate.30 Kod upalnog raka dojke, Rarres1 regulira in vitro invaziju stanica raka posredstvom Axl signalnog puta . Detaljno, Rarres1 stabilizira Axl inhibicijom razgradnje Axl-a ovisne o proteasomu. Nadalje, smanjenje Rarres1 u stanicama SUM149 smanjuje ekspresiju Axl i inaktivira NF-kB, što dovodi do smanjene invazije upalnih stanica raka dojke.20 Osim toga, ekspresija Rarres1 je inducirana u bolesnika s uznapredovalom fifibrozom, a profibrotička uloga Rarres1 je dokazana predloženo u modelu fifibroze pluća štakora i tijekom fibrogene aktivacije jetrenih zvjezdastih stanica.31 Sve zajedno, prethodne in vitro studije sugeriraju ulogu Rarres1 u fifibrozi, upali i invaziji raka.

U početku je Rarres1 pobudio naše zanimanje jer je bio visoko obogaćen stanicama podocita. Mogli bismo pokazati da je Rarres1 promicao upalno i profibrotično signaliziranje u podocitima preko Axl-posredovane aktivacije NF-kB puta. S druge strane, nokautirane životinje specifične za podocite nisu pokazale nikakvu očitu razliku u usporedbi s kontrolama u zdravim uvjetima, kao ni u mišjem modelu GN. To bi moglo biti zbog kompenzacijskih mehanizama budući da je signalni put NF-kB reguliran nizom molekula i bioloških procesa.

Molekularno profiliranje bolesnika s dijabetesom pokazalo je da je Rarres1 induciran u glomerularnim i peritubularnim kapilarnim EC-ima u DN. Važno je da ekspresija Rarres1 nije otkrivena u EC kod pacijenata s dijabetesom bez nefropatije. Stoga nagađamo da bi Rarres1 mogao biti novi marker za dijabetičku mikrovaskularnu bolest, a studije u uzorcima plazme i urina su naznačene da bi se istražila izvedivost Rarres1 kao neinvazivnog biomarkera. Identificirali smo indukciju Rarres1 također u bolesnika s IgAN-om i vaskulitisom. Primamljivo je nagađati da Rarres1 ima patogenu ulogu u ovim glomerulopatijama i pridonosi progresiji bolesti. Funkcionalno, pokazali smo da je indukcija Rarres1 u EC-ima povećala ozljedu bubrega u mišjem modelu GN-a, dok je inaktivacija Rarres1 u EC-ima ublažila ozljedu. Fenotipska analiza pokazala je da su podociti bili zahvaćeni kod miševa koji prekomjerno izražavaju Rarres1 u EC-ima. Ovo može biti izravan učinak Rarres1 na podocite budući da je opisan topljivi oblik Rares.32 Alternativno, ozljeda podocita može biti sekundarna u odnosu na oštećenje barijere filtracije glomerula.

Prije se pokazalo da aktivacija endotelnog NF-kB igra patogenu ulogu u razvoju bolesti bubrega kod vaskulitisa.13 Značajno je da je inhibicija puta endotelnog NF-kB u modelu polumjesečastog GN poništila progresiju. Axl inhibitori su se pokazali korisnima kod eksperimentalnog anti-GBM nefritisa. Miševi liječeni najselektivnijim inhibitorom malih molekula, R428, pokazali su značajno očuvanje funkcije bubrega i smanjenu proizvodnju upalnih citokina.33 To ukazuje da bi put mogao biti terapijska opcija zaglomerularna bolestprocesima. Međutim, budući da i Axl i NF-kB moduliraju brojne različite stanične procese u cijelom tijelu, malo je vjerojatno da će biti dobar kandidat za farmaceutsko ciljanje kod KBB-a. Rarres1 može pružiti cilj koji je više povezan s bubrezima.

Pokazalo se da Tie2-Cre potiče ekspresiju u subpopulaciji hematopoetskih stanica.34 Neke od tih stanica mogu modulirati upalni odgovor u NTS-induciranom modelu i stoga ne možemo isključiti da Rarres1 koji potječe iz hematopoetskih stanica doprinosi napredovanje bolesti u linijama Tie2-Cre. Međutim, kako nismo otkrili nikakvu očitu ekspresiju Rarres1 u infiltrirajućim imunološkim stanicama, mislimo da je to manje vjerojatno.

Dok je ovaj rukopis bio u pripremi, Chen et al.32 izvijestili su o topljivom obliku Rarres1 koji potičeglomerularna bolestnapredovanje. Identificirali su, slično kao i mi, pojačanu regulaciju Rarres1 u uobičajenim ljudskim glomerularnim bolestima. Studija podupire naše otkriće da povećana ekspresija Rarres1 korelira s padom bubrežne funkcijeljudska glomerularna bolest. Međutim, za razliku od naših rezultata, zaključili su da je do regulacije Rarres1 došlo zbog prekomjerne ekspresije u podocitima. Ne možemo isključiti tu mogućnost, ali otkrili smo u ljudskim bolestima izrazitu indukciju ekspresije Rarres1 u EC. Jedan mehanizam koji objašnjava naša otkrića mogao bi biti da topljivi oblik Rarres1 koji proizvode podociti preuzimaju GEC-ovi. Međutim, rezultati da smo otkrili Rarres1 mRNA u EC in situ hibridizacijom i da je Rarres1 također induciran u peritubularnim kapilarnim EC snažno podupiru ideju da je ekspresija Rarres1 u bubrežnim bolestima uglavnom endotelnog podrijetla.

Slika 7|Endotelno-specifična ablacija Rarres1 smanjuje ozljedu bubrega kod miševa tretiranih nefrotoksičnim serumom (NTS). (a) Generacija uvjetno nokautiranih miševa kod kojih je Rarres1 specifično abliran u endotelnim stanicama korištenjem rekombinacijskog sustava Cre-LoxP. Ekson 3 se briše tijekom rekombinacije posredovane Tie2-Cre. (b) Genotipizacija je potvrđena preparacijom repa i lančanom reakcijom polimeraze na (nastavak)

Slika 7|(nastavak) 4 tjedna starosti. (c) Reprezentativni Western blot dokumenti i sažeti podaci koji pokazuju relativne razine proteina Rarres1 u korteksu bubrega u različitim skupinama miševa tretiranih NTS-om (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Tie2_KO, n=4) i netretirani miševi (Kontrola [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" uacr="" (omjer="" albumin-kreatinin="" u="" mokraći)="" u="" različitim="" skupinama="" miševa="" na="" liječenju="" nts-om="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" fotomikrografije="" i="" kvantifikacije="" koje="" pokazuju="" tipične="" promjene="" strukture="" glomerula="" u="" različitim="" skupinama="" miševa.="" glomerularne="" lezije="" identificirane="" su="" u="" periodičnim="" rezovima="" obojenim="" kiselinom="" po="" schiffu="" (ctrl.,="" n="3;" kontrola="" tretirana="" nts-om="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}no,="" n="8)." (f)="" reprezentativne="" fotomikrografije="" i="" kvantifikacije="" srednje="" debljine="" glomerularne="" bazalne="" membrane="" (gbm)="" i="" broja="" proreza="" po="" mm="" gbm="" u="" različitim="" skupinama="" miševa="" putem="" transmisijske="" elektronske="" mikroskopije="" analiziraju="" sekcije="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_izjednačeno2_ko,="" n="16)." (g)="" reprezentativne="" konfokalne="" mikroskopske="" slike="" koje="" pokazuju="" ekspresiju="" nefrina,="" sinaptopodina,="" aktina="" glatkih="" mišića="" (sma)="" i="" wt1="" u="" bubrezima="" različitih="" skupina="" miševa.="" šipke="50/10" mm.="" sma-pozitivno="" područje="" izbrojano="" je="" po="" kortikalnom="" presjeku="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (h)="" reprezentativne="" fotomikrografije="" pp65="" imunohistokemijskog="" bojenja="" u="" tkivu="" kore="" bubrega="" iz="" različitih="" skupina="" miševa="" tretiranih="" nts-om.="" pp65-pozitivne="" jezgre="" po="" glomerulima="" kvantificirane="" su="" u="" različitim="" skupinama="" miševa="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0,001="" naspram="" neliječenog="" ctrl.,="" *p="">< 0,05="" naspram="" nts-ctrl.="" podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="" sem.="" studentov="" t-test="" korišten="" je="" za="" usporedbe="" između="" 2="" skupine.="" jednosmjerna="" analiza="" varijance="" praćena="" tukeyjevim="" naknadnim="" testom="" za="" višestruke="" usporedbe="" korištena="" je="" za="" grupe="" od="" 3="" ili="" više.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

U ovoj studiji postoji nekoliko ograničenja koja treba priznati. Prvo, in vitro studije su provedene na podocitima, dok smo in vivo manipulirali ekspresijom u EC-ima. Stoga ne možemo izravno povezati Rarres1 s Axl aktivacijom u EC-ima. Drugo, dok smo mogli identificirati Rarres1- induciranu (ovisnu o Axl) aktivaciju NF-kB signalizacije u podocitima, nismo istražili molekularni mehanizam koji stoji iza ovog procesa. Potrebna su dodatna istraživanja kako bi se istražilo prethodno otkriće da Rarres1 potiče aktivaciju Axla inhibiranjem njegove razgradnje ovisne o proteasomu. Naposljetku, naše smo nokaut/in životinje ispitali samo s modelom nefropatije izazvane NTS-om. Stoga je indicirano više studija na životinjskim modelima kako bi se vidjelo ima li Rarres1 patogenu ulogu iu drugim procesima bolesti.

Ukratko, naša studija pokazuje da se u uobičajenim ljudskim glomerulopatijama protein Rarres1 obogaćen podocitima inducira u EC-ima, što dovodi do upale, ozljede podocita i fifibroze. Ovo je potencijalno posredovano pojačavanjem NF-kB signalnog puta putem aktivacije receptorske tirozin kinaze Axl (Slika 7). Rarres1 je novi biomarker mikrovaskularne ozljede i potencijalno bi mogao biti nova terapijska meta za suzbijanje upale i fifibroze u KBB-u

RAZOTKRIVANJE

ML je zaposlenik AstraZenece, Göteborg, Švedska. Istraživanje JP-a podržava AstraZeneca. Svi ostali autori izjavili su da nemaju suprotstavljenih interesa.

ZAHVALA

Ovu studiju podržali su KM-H iz Diabetes Wellness Sverige i JP iz Integriranog metaboličkog centra KI/AZ, Zaklada Marianne och Marcus Wallenberg, Švedska zaklada za dijabetes, Švedska zaklada za bubrege i Centar za inovativnu medicinu.

AUTORSKI PRILOZI

KM-H, ML i JP osmislili su istraživanje; KM-H, DD, EC, SZ i GG izvršili istraživanje; KM-H i XL analizirali su podatke; AW je dostavio ljudske uzorke; a KM-H i JP napisali su rad.

Zašto odgovor na receptor retinoične kiseline1 može pospješiti razvoj glomerularnih bolesti?

DOPUNSKI MATERIJAL

Dodatna datoteka (PDF)

Tablica S1. Parovi primera ciljnih gena korišteni su za RT-PCR u stvarnom vremenu u ovoj studiji.

Tablica S2. U ovoj studiji korištena su antitijela. Dodatna datoteka (PowerPoint)

Slika S1. Prekomjerna ekspresija Rarres1 ne aktivira nekanonski signalni put NF-kB. Reprezentativni Western blot dokument i sažeti podaci koji pokazuju da prekomjerna ekspresija Rarres1 ne aktivira p100/p52 u podocitima tretiranim s 10 ng/ml TGF-b1 (n=2). Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti ± SD. Studentov t-test korišten je za usporedbu dviju skupina. UT, neliječeno.

Slika S2. Utvrđivanje podocit-specifičnih Rarres1 nokautiranih (Creþ/Rarres1flfl/flfl) miševa. (A) Konvencionalna PCR analiza u tubularnim i glomerularnim frakcijama, kao iu tkivu jetre. (B) Histološki pregled (PAS-bojenje) patologije bubrega u Cre– /Rarres1flfl/flfl i Creþ/Rarres1flfl/flfl miševa. (C) Reprezentativne transmisijske elektronske mikrografije (TEM) i kvantifikacija srednje debljine glomerularne bazalne membrane (GBM) i broja proreza po mm GBM u različitim skupinama miševa (n=3). (D) Reprezentativne konfokalne mikroskopske slike koje pokazuju ekspresiju markera specifičnih za podocite, sinaptopodina i nefrina, kod nokautiranih Rarres1 (Creþ/Rarres1flfl/flfl) i kontrolnih (Cre– /Rarres1flfl/flfl) miševa specifičnih za podocite. Šipka=10 mm.

Slika S3. Razine ekspresije markera podocita i CD31 u bubrezima miševa tretiranih NTS-om. (A) Reprezentativne konfokalne mikroskopske slike koje pokazuju ekspresiju nefrina, WT-1 i sinaptopodina u podocitima iz Rarres1 podocit-specifičnih knockout miševa tretiranih NTS-om (Creþ/Rarres1flfl/flfl) i kontrolnih kolega iz legla (Cre– /Rarres1flfl/ flfl ). Šipka=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=5). (B) Udio CD31-pozitivnih kapilara u peritubularnim područjima. Trideset peritubularnih područja procijenjeno je po mišu. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl, n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Studentov t test. (C) Semikvantitativno bodovanje signala CD31 u glomerulima: 0=nema signala, 1=slab signal, 2=umjeren signal, 3=jak signal. Deset glomerula procijenjeno od svakog miša (NTS Cre–/Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Studentov t test.

Slika S4. Razine ekspresije za markere fifibroze, upale i ozljede tubula u bubrezima miševa tretiranih NTS-om. (A) Reprezentativne konfokalne mikroskopske slike koje pokazuju ekspresiju -Sma u bubregu iz NTS-tretiranih Rarres1 podocit-specifičnih knockout miševa (Creþ/Rarres1flfl/flfl) i kontrolnih kolega iz legla (Cre– /Rarres1flfl/flfl). Šipka=100 mm. (B) Relativne razine mRNA različitih gena povezanih s upalom, fifibrozom i oštećenjem bubrežnih tubula u korteksu bubrega miševa tretiranih s NTS-om. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" u="" odnosu="" na="" kontrolu="" (ctrl.);="" podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="" sem.="" studentov="" t-test="" korišten="" je="" za="" usporedbe="" između="" 2="" grupe="" (lažni="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl="" ,="" n="3">

Slika S5. Ekspresija C31 i aktiviranog P65 u bubrezima tretiranim NTS-om. (A) Udio CD31-pozitivnih kapilara u peritubularnim područjima. Procijenjeno je trideset peritubularnih područja po mišu (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Studentov t-test. (B) Semikvantitativno ocjenjivanje signala CD31 u glomerulima: 0=nema signala, 1=slab signal, 2=umjeren signal, 3 =jak signal. Procijenjeno je deset glomerula svakog miša (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Studentov t-test. (C) Reprezentativni Western blot dokumenti i sažeti podaci koji pokazuju relativne razine proteina pP65 u bubrežnom korteksu u različitim skupinama miševa tretiranih NTS-om i netretiranih kontrola (ctrl.) (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Izjednačeno2_KI, n=10). Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti ± SEM. Studentov t-test korišten je za usporedbe između 2 skupine.

REFERENCE

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Molekularni mehanizmi dijabetičke bolesti bubrega. J Clin Invest. 2014;124:2333-2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F, et al. IgA nefropatija. Nat Rev Dis Primeri. 2016;2:16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Razumijevanje biologije podocita za razvoj novih lijekova za bubrege. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F, et al. Definiranje specifičnosti tipa stanice na transkripcijskoj razini kod bolesti čovjeka. Genome Res. 2013;23:1862-1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S, et al. Identifikacija epidermalnog faktora rasta kao biomarkera kronične bubrežne bolesti temeljena na transkriptomu tkiva. Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.

6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T, et al. Analiza transkriptoma bolesti bubrega kod ljudi s dijabetesom. Dijabetes. 2011;60:2354-2369.

7. Wiggins JE, Patel S, Shedden K, et al. NFkappaB potiče upalu, koagulaciju i fifibrozu u glomerulu koji stari. J Am Soc Nephrol. 2010;21:587-597.

8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R, et al. NFkappaB-inducirani periostin aktivira integrin-beta3 signalizaciju za poticanje oštećenja bubrega u GN. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1475-1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Transformirajući faktor rasta-beta1 i dijabetička nefropatija. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F689-F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB, et al. Aktivacija nuklearnog faktora kapa B od strane podocita u autolognoj fazi pasivnog Heymannovog nefritisa. Kidney Int. 2001;59:923-931.

11. Tomita T, Takano M, Tomita R, et al. Transkripcijski faktor mamac za NFkappaB inhibira ekspresiju citokina i adhezijskih molekula u sinovijalnim stanicama koje potječu od reumatoidnog artritisa. Reumatologija (Oxford). 2000;39:749-757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X, et al. GPRC5b modulira upalni odgovor uglomerularne bolestipreko NF-kappaB puta. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573-1586.

13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C, et al. Endotelna NF-kappaB blokada poništava ANCA-induciran GN. J Am Soc Nephrol. 2017;28:3191-3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. In situ glomerularna ekspresija aktiviranog NF-kappaB u ljudskom lupusnom nefritisu i drugoj neproliferativnoj proteinuričkoj glomerulopatiji. Virchows Arch. 2006;448:172-183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J, et al. Opsežna identifikacija gena uključenih u razvoj i funkciju bubrežnog glomerula. EMBO J. 2006;25:1160–1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J, et al. Uvjetno besmrtna stanična linija ljudskih podocita koja pokazuje ekspresiju nefrina i podocina. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630-638.

17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T, et al. Nizak krvni tlak u endotelnih stanica specifičnih endotelin 1 knockout miševa. Hipertenzija. 2010;56:121-128.

18. McAdoo SP, Pusey CD. Bolest antiglomerularne bazalne membrane. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12:1162-1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX, et al. FK506 smanjuje albuminuriju poboljšanjem ekspresije podocitnog nefrina i podocina u dijabetičkih štakora. Inflflamm Res. 2016;65:103-114.

20. Wang X, Saso H, Iwamoto T, et al. TIG1 potiče razvoj i progresiju upalnog raka dojke putem aktivacije Axl kinaze. Cancer Res. 2013;73:6516-6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C, et al. R428, selektivni malomolekulski inhibitor Axl kinaze, blokira širenje tumora i produljuje preživljenje u modelima metastatskog raka dojke. Cancer Res. 2010;70:1544-1554.

22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. AXL inhibitori kod raka: perspektiva medicinske kemije. J Med Chem. 2016;59:3593-3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Eksperimentalni membranski glomerulonefritis u štakora. Kvantitativna istraživanja stvaranja glomerularnih imunoloških naslaga u izoliranim glomerulima i cijelim životinjama. J Clin Invest. 1980;66:71-81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et al. Analiza transkripcijske mreže među vrstama definira zajedničke upalne odgovore u mišjem i ljudskom lupus nefritisu. J Immunol. 2012;189:988-1001.

25. Grayson P, Eddy S, Taroni J, et al. Metabolički putovi i imunometabolizam u rijetkim bolestima bubrega. Ann Rheum Dis. 2018; 77: 1226-1233.

26. Liu P, Lassen E, Nair V, et al. Transkriptomsko i proteomsko profiliranje daje uvid u funkciju mezangijalnih stanica u IgA nefropatiji. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 2961-2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Učinkovita selekcija za transfektante visoke ekspresije s novim eukariotskim vektorom. Gen. 1991;108:193-199.

28. Loefflfler I, Wolf G. Prijelaz epitela u mezenhim u dijabetičkoj nefropatiji: činjenica ili fikcija? Stanice. 2015;4:631-652.

29. Nagpal S, Patel S, Asano A, et al. Gen 1 induciran tazarotenom (TIG1), romanretinoična kiselinagen koji reagira na receptore u koži. J Invest Dermatol. 1996;106:269-274.

30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C, et al. Tazarotenom inducirana ekspresija gena 1 (TIG1) u karcinomima prostate i njezin odnos s tumorigenošću. J Natl Cancer Inst. 2002;94:482-490.

31. Teufel A, Becker D, Weber SN, et al. Identifikacija RARRES1 kao glavnog regulatora u fifibrozi jetre. J Mol Med (Berl). 2012;90:1439-1447.

32. Chen A, Feng Y, Lai H, et al. Topljivi RARRES1 inducira apoptozu podocita za promicanjeglomerularna bolestnapredovanje. J Clin Invest. 2020;130:5523-5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Ciljana inhibicija tirozin kinaze Axl receptora ublažava anti-GBM-inducirani nefritis sličan lupusu. J Autoimmun. 2018;93:37-44.

34. Tang Y, Harrington A, Yang X, et al. Doprinos Tie2þ loze primitivnim i definitivnim hematopoetskim stanicama. Geneza. 2010;48:563-567