Karnovskyjev fiksativ sprječava pojavu artefakata kao vakuolizacije koja proizlazi iz obrade tkiva u bubrezima tretiranim antisense oligonukleotidom Ⅰ

Sažetak: Antisense oligonukleotid(ASO) terapije identificirane su kao novi modalitet liječenja zaneizlječive bolesti. Ububrega liječenih ASO, vakuole, uz bazofilne granule, često se opažaju u proksimalnim tubulima. Neki izvještaji opisuju da su te vakuole vjerojatno sekundarni fenomen koji proizlazi izekstrakcija ASO-atijekom obrade tkiva. U ovoj smo studiji usporedili morfologiju bubrega nakon fiksacije Karnovskyjevim fiksativom ili 4% paraformaldehid fosfatnim puferom (PFA) s onom 10% neutralno puferirane otopine formaldehida (NBF). Ispitane su ženke Sprague-Dawley štakora, intravenski tretirane četiri puta s 50 mg/kg zaključane nukleinske kiseline koja sadrži antisense oligonukleotide (LNA-ASO) tijekom 1 ili 2 tjedna. Mikroskopski su uočene vakuole i bazofilne granule u proksimalnim tubulima u bubrezima fiksiranim s NBF. Bazofilne granule su indikativne za nakupljanje ASO. Štoviše, neke od vakuola također su sadržavale slabašna bazofilna zrnca, što sugerira da su vakuole bile relevantne za nakupljanje ASO. Iako je primijećena umjerena vakuolizacija u proksimalnim tubulima, većina vakuoliziranih epitela bila je negativna na molekulu ozljede bubrega-1 pri imunohistokemijskom bojenju. Vakuole u proksimalnim tubulima nisu uočene u uzorcima podvrgnutim fiksaciji po Karnovskom, iako su uočene bazofilne granule. U uzorcima podvrgnutim PFA fiksaciji uočene su vakuole i bazofilne granule u proksimalnim tubulima, slične onima u uzorcima podvrgnutim NBF fiksaciji. Sveukupno, naši su nalazi pokazali mogućnost precjenjivanja vakuolizacije zbog artefakata tijekom obrade tkiva pri korištenju konvencionalne NBF fiksacije. Karnovskyjev fiksativ smatra se korisnom alternativom za razlikovanje umjetnih vakuola od prave nefrotoksičnosti. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Ključne riječi:antisense oligonukleotid, artefakt,Fiksativ Karnovskog, vakuolizacija, bazofilne granule, bubreg

Cistanche Dodatak za podršku funkciji bubrega PhGs75% Ech 30% Act 12%

Nedavno su terapije antisens oligonukleotidima (ASO) uspostavljene kao novi modaliteti za liječenje teško izlječivih bolesti1, 2. ASO su kratki, sintetski, jednolančani oligodeoksinukleotidi koji se vežu na ribonukleinsku kiselinu i potiskuju ekspresiju gena3.

Toksikološki, toksičnosti izazvane ASO kategorizirane su u toksičnosti ovisne o hibridizaciji, koje su povezane s ASO sekvencom, i toksičnosti neovisne o hibridizaciji, koje su povezane s kemijskom modifikacijom. Toksičnost neovisna o hibridizaciji izazvana je s tri glavna mehanizma: 1) nakupljanjem ASO, 2) proupalnim učincima i 3) učincima vezanja aptamera4. Nakupljanje ASO primarno se opaža u jetri i bubrezima, a prekomjerno nakupljanje dovodi do disfunkcije ovih organa5. Proupalni učinak izazvan je stimulacijom urođenog imunološkog sustava putem vezanja na receptore slične Tollu u glodavaca i majmuna ili aktivacijom alternativnog puta komplementa putem inhibicije faktora H pomoću ASO u majmuna6. Učinak aptamernog vezanja inducira aktivaciju trombocita i agregaciju/trombocitopeniju za vezanje receptora specifičnog za trombocite7. Štoviše, aptamerno vezanje na unutarstanične proteine ​​u hepatocitima smatra se jednim od uzroka hepatotoksičnosti8-10. Kako bi otkrili te toksičnosti, istraživači su razvili nekoliko nekliničkih testova; među njima, histopatološki pregled jedan je od najosjetljivijih testova za otkrivanje nakupljanja ASO.

Histopatološki, akumulacija ASO se obično opaža kao bazofilne granule u citoplazmi Kupfferovih stanica u jetri ili proksimalnim tubulima bubrega. Izrazito nakupljanje bazofilnih granula u korelaciji je s povećanom incidencijom ili težinom degenerativnih promjena, koje se obično opažaju kao vakuolizacija ili degeneracija/nekroza proksimalnog tubularnog epitela u bubrezima4. Same bazofilne granule ne smatraju se toksikološki značajnima11; stoga je razlikovanje nakupljanja bazofilnih granula od degenerativnih promjena važno za procjenu toksičnosti povezanih s ASO.

Vakuole, koje se često opažaju u proksimalnim tubulima bubrega cynomolgus majmuna liječenih ASO, sadrže bazofilni materijal i pokazuju istu opću raspodjelu unutar stanica kao bazofilne granule11, 12. Nekoliko izvješća sugerira da proces fiksacije može utjecati na pojava nakupljanja ASO unutar fagolizosomskog odjeljka5, 11. Dodatno, Henry et al. i Engelhardt opisali su da su vakuole u proksimalnim tubulima vjerojatno sekundarni fenomen koji je rezultat ekstrakcije ASO tijekom obrade jer vakuole nema u bubrezima fiksiranim perfuzijom na paraformaldehid/glutaraldehid5, 11. Vakuole u proksimalnim tubulima cynomolgus majmuna liječenih s mipomersenom se nagađalo da se pojavljuju tijekom procesa fiksacije13.

Stoga, iako vakuolizacija zbog ASO tretmana može biti artefakt u nekim slučajevima, ova hipoteza nije jasno dokazana, a nijedno izvješće nije identificiralo odgovarajuću metodu fiksacije za toksikološku procjenu. U skladu s tim, u ovoj smo studiji usporedili morfologiju bubrega nakon fiksacije Karnovskyjevim fiksativom ili 4% paraformaldehid fosfatnim puferom (PFA) s onom 10% neutralno puferirane otopine formaldehida (NBF). Osim toga, pokazali smo korisnost Karnovskyjevog fiksativa kao alternativnog fiksativa za sprječavanje vakuolizacije uzrokovane artefaktom.

Ženke Sprague-Dawley štakora stare četiri tjedna kupljene su od Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japan) i aklimatizirane na laboratorijske uvjete. Životinje su držane u kontroliranim uvjetima (12--satni ciklus svjetlo/tama, temperatura od 23 ± 2 stupnja, relativna vlažnost od 50 ± 25%) i dopušten im je slobodan pristup standardnoj komercijalnoj prehrani (autoklavirani CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japan) i vodu iz slavine. Dvadeset životinja raspoređeno je u sljedeće četiri skupine (sa po pet životinja): 1-skupina liječena tjedan dana fiziološkom otopinom (kontrola- 1W), 2-skupina liječena tjedan dana fiziološkom otopinom (kontrola{ {14}}W), 1-tjedno zaključanu nukleinsku kiselinu koja sadrži antisense oligonukleotid (LNA-ASO) tretiranu skupinu (ASO-1W) i 2-tjednu skupinu tretiranu LNA ASO (ASO-2W). Životinje su bile stare 5 tjedana u vrijeme početka primjene 50 mg/kg LNA-ASO. LNA-ASO primijenjen je intravenski ukupno četiri puta prema sljedećem režimu: 1., 4., 8. i 11. dan u ASO-2W skupini; i 1., 2., 3. i 4. dan u skupini ASO-1W. Životinje u kontrolnim-1W i ASO-1W skupinama žrtvovane su 7. dana. Životinje u kontrolnim-2W i ASO-2W skupinama žrtvovane su na dan 14. Kod svake terminalne nekropsije, uzorci krvi za kliničku patologiju prikupljeni su iz abdominalne šuplje vene pod dubokom anestezijom izofluranom. Nakon uzorkovanja krvi, svi štakori su eutanazirani iskrvavivanjem tako što je odmah prerezana trbušna aorta. Makroskopski je pregledana vanjska površina tijela, prsna i trbušna šupljina te iznutrice, a lijevi bubrezi su izvađeni i obrađeni za mikroskopski pregled. Svi postupci provedeni su u skladu s Pravilima za hranidbu i čuvanje pokusnih životinja i pokusa na životinjama Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Uzorci seruma dobiveni su centrifugiranjem uzoraka krvi na 4 stupnja. Biokemijska analiza seruma provedena je pomoću instrumenta TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japan) za procjenu razine dušika ureje u krvi (BUN) i kreatinina (CRE).

Bubrezi su fiksirani korištenjem tri otopine za fiksiranje kako slijedi: Nakon poprečne podjele bubrega na tri segmenta, srednji dio uključujući bubrežnu zdjelicu, fiksiran je u 10% NBF-u tijekom 5 dana; kranijalni dio je fiksiran u Karnovskyjevom fiksativu (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Japan); a kaudalni dio je fiksiran u 4% PFA 17 sati na 4 stupnja i zatim stavljen u 10% NBF 24 sata. Svaki fiksirani uzorak je dehidriran i umetnut u parafin. Sekcije tkiva su pripremljene za bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E). Imunohistokemijsko bojenje provedeno je korištenjem protutijela usmjerenih na molekulu ozljede bubrega-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, SAD; razrjeđenje 1:300) i membranski protein 2 povezan s lizosomom (LAMP{{ 13}}; Waltham, MA, SAD; razrjeđenje 1:1000) nakon dobivanja antigena (citratni pufer, pH 6,0, zagrijavan 10 minuta ili 20 minuta). Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) korišten je kao sekundarno protutijelo.

Služba podrške Wecistanchea:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop