Kaempferol ublažava LD-mitohondrijsko oštećenje promicanjem autofagije: Implikacije u Parkinsonovoj bolesti 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Novi dokazi pokazuju da neočekivano taloženje lipidnih kapljica (LD) i peroksidacija mogu ubrzati stres organela i igraju ključnu ulogu u patogenezi neurodegenerativnih bolesti (NDD). U našoj prethodnoj studiji potvrdili smo da je kempferol (Ka), mala molekula prirodnog flavonoida, pokazao neuroprotektivne učinke na miševe s Parkinsonovom bolešću (PD) izazvanom LPS-om. Osim toga, prethodne studije su pokazale da autofagija igra važnu ulogu u regulaciji staničnog taloženja LD. U trenutnoj smo studiji pokazali da Ka štiti od gubitka neurona i poremećaja u ponašanju kod MPTP/p-induciranog PD miševa, praćenog smanjenim lipidnim oksidativnim stresom u substantia nigra pars compacta (SNpc). U uzgojenim neuronskim stanicama, Ka je pokazao relativno siguran raspon koncentracija i značajno je potisnuo nakupljanje LD i staničnu apoptozu induciranu s MPP plus. Daljnje studije su pokazale da zaštitni učinak Ka ovisi o autofagiji, točnije lipofagiji. Kritično, Ka je poticao autofagiju da posreduje u razgradnji LD u lizosomima, što je zatim ublažilo taloženje lipida i peroksidaciju i rezultirajuće oštećenje mitohondrija, posljedično smanjujući neuronsku smrt. Nadalje, AAV-shAtg5-posredovano obaranje Atg5 ukinulo je neuroprotektivne učinke Ka protiv oksidacije lipida u PD miševa. Ovaj rad pokazuje da Ka sprječava dopaminergičku neuronalnu degeneraciju u PD-u putem inhibicije oštećenja mitohondrija posredovanog peroksidacijom lipida promicanjem lip-ofagije i pruža potencijalnu novu terapijsku strategiju za PD i srodne NDD-ove.

Kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Parkinsonova bolest (PD) je uobičajena neurodegenerativna bolest (NDD) koja je patološki karakterizirana progresivnim gubitkom dopaminergičkih (DA) neurona u substantia nigra pars compacta (SNpc). Iako točna etiologija i prirodni tijek ove bolesti još nisu u potpunosti razjašnjeni,brojniprocesi i disfunkcije na razini sustava, uključujući funkcije mitohondrija, homeostazu dopamina, neuroinflamaciju i autofagiju, uključeni su u patogenezu PD [1,2]. Nedavna izvješća otkrila su da su kapljice lipida (LD) povezane slipotoksičnostmogu sudjelovati u patologiji PD [3,4]. LD su visoko dinamične organele koje izlaze iz membrane endoplazmatskog retikuluma (ER) i normalno služe kao unutarstanična mjesta skladištenja neutralnih lipida [5]. Nedavno je pokazano da LD imaju mnogo širu ulogu od pohrane masnih kiselina (FA) i da sudjeluju u mnogim bolestima. Na primjer, mijeloične stanice, uključujući makrofage, leukocite i eozinofile, tvore LD kao odgovor na upalu i stres, a LD su mjesta upalne proizvodnje i skladištenja citokina te su dalje uključeni u prezentaciju antigena i uklanjanje patogena [6]. Važno je napomenuti da je kod ateroskleroze dokazano da su pjenaste stanice bogate LD-om štetne u svim stadijima bolesti [7].

Cistanche može poboljšati imunitet

Međutim, LD nisu opsežno proučavani u središnjem živčanom sustavu (CNS), s nekoliko radova koji izvješćuju o histološkoj prisutnosti LD u tkivu ljudskog mozga [8,9]. Unatoč tome, LD mogu imati važne funkcije u mozgu, budući da su nedavne studije potvrdile da agregirani LD u gliji ubrzavaju neurodegeneraciju u modelu Drosophila [10]. Nedavno je objavljeno da su kod miševa masnocrvene O-pozitivne stanice natovarene lipidima, uključujući neurone, glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP) plus astrocite i ioniziranu adaptornu molekulu za vezanje kalcija-1 (IBA{{7} }) plus mikroglija, prisutni su u mnogim regijama mozga i pokazalo se da sudjeluju u procesima povezanim sa starenjem [1]. Naš prethodni rad također je pokazao povećano nakupljanje LD u mozgu u modelu PD miša [12]. Uzete zajedno, ove studije sugeriraju da bi LD-ovi mogli biti uključeni u patogenezu PD-a, kao i drugih NDD-ova.

Normalno, unutarstanični LD se razgrađujulizosomii isporučuju FA u mitohondrije za njihovu potrošnju kao alternativni izvor energije tijekom razdoblja iscrpljenosti hranjivih tvari [13]. Međutim, neuroni imaju nizak kapacitet mitohondrijske potrošnje FA za proizvodnju energije [14]. Ova karakteristika čini neurone posebno osjetljivima na nakupljanje i peroksidaciju LD. Nadalje, nakupljanje LD povećava brzinu oksidacije FA i nameće trajni pritisak na mitohondrijski transportni lanac elektrona, što povećava proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) kompleksima I i II transportnog lanca elektrona [15] kako bi se pojačao oksidativni stres. Preopterećenje lipidima također dovodi do proizvodnje ROS ekstramitohondrijskih izvora kao što su nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH)oksidaze i drugi oksidativnienzima. U kombinaciji sa smanjenom ekspresijom antioksidativnih enzima i niskom sposobnošću potrošnje FA u neuronima, nakupljanje LD posreduje u oksidativnom stresu i može dalje dovesti do oštećenja mitohondrija,lizosomska disfunkcija, neispravna autofagija i aktivacija upalnih odgovora [6,17]. Osim ako se akumulirani LD ne mogu inhibirati ili ukloniti, visoko aktivni neuroni prolaze kroz patofiziologiju, što dovodi do neurodegeneracije [17]. Dokazi pokazuju da katabolički proces posredovan lizosomima, nazvan autofagija, igra ključnu ulogu u održavanju stanične homeostaze LD u više tkiva [17,18]. Detaljnije, LD se mogu selektivno odvojiti u autofagosomima i dostaviti lizosomima na razgradnju pomoću lizosomalnih kiselih lipaza, proces posebno poznat kao lipofagija [19]. Stoga bi ciljanje LD-a i njihovog autofagičnog puta uklanjanja moglo predstavljati novi pristup upravljanju neurodegeneracijom.

Proučavanje prirodnih proizvoda i prehrambenih agenasa kao izvora potencijalnih NDD tretmana i strategija je posljednjih godina steklo ogroman interes [20]. Kemferol (Ka) je prirodna polifenolna mala molekula koja se može naći u nizu kineskih ljekovitih biljaka i prehrambenih izvora [21]. Prijavljeno je da Ka djeluje antibakterijski, protiv starenja i imunomodulatorno, kao i antioksidativno i neuroprotektivno djelovanje [20,22,23]. Prethodno je objavljeno da Ka inhibira upalu u mikroglijalnim stanicama BV2 in vitro [24] i povećava otpornost DA neurona na neuroupalu in vivo [25]. Međutim, učinak Kaon LD-a na PD još nije istražen.

S obzirom na važnost LD-ova i blisku vezu između LD-ova, mitohondrija i autofagije [16], koji su svi uključeni u PD, pretpostavljamo da Ka inhibira peroksidaciju LD-a i sprječava neurodegeneraciju DA u PD-u. U ovoj studiji pokazali smo da Ka značajno štiti od neurodegeneracije u mišjem PD modelu inhibicijom nakupljanja LD. Daljnja studija otkrila je da je Ka pokrenuo autofagiju i smanjio nakupljanje oksidiranih LD-a kako bi se ublažila mitohondrijska disfunkcija i mitohondrijska proizvodnja ROS (mtROS), čime se spriječila apoptotička smrt neurona. Nalazi dobiveni u ovoj studiji mogu pomoći u usmjeravanju kliničkih odluka u vezi s upotrebom prirodne molekule Ka u NDD-ovima kao što je PD.

2. Materijali i metode

2.1. Pokusne životinje

C57BL/6J miševi (muški, stari 4-mjeseci) dobiveni su od Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Miševi su držani i uzgajani u Centru za životinjske resurse Medicinskog fakulteta Medicinskog sveučilišta u Nanjingu, au objektu za životinje u bolnici Nanjing Drum Tower, miševi imaju slobodan pristup hrani i vodi u prostoriji s temperaturom okoline od 22 stupnja ± 2 stupnja C i ciklus svjetlo/tama od 12:12 h. Svi postupci na životinjama provedeni su u strogom skladu sa smjernicama Nacionalnog zdravstvenog vodiča za njegu i korištenje laboratorijskih životinja.

2.2. Reagensi

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 posto,96,353) za in vitro eksperimente dobiveno je od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). BODIPY 493/503(D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) kupljeni su od Thermo Fisher Scientific. Za pokuse na životinjama, Ka je otopljen u otopini od 10 posto DMSO u 16 posto SBE- -CD u sterilnoj fiziološkoj otopini. Za stanične eksperimente, Ka je pripremljen u DMSO (Sigma-Aldrich) i PBS (konačna koncentracija DMSO je 0,01 posto), pH 7,4.

2.3. Indukcija i liječenje metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)-induciranog PD mišjeg modela

Za procjenu učinaka Ka u PD modelu MPTP/p-toksičnosti, miševi (mužjaci, stari 4-5 mjeseci) nasumično su podijeljeni u skupinu liječenu fiziološkom otopinom, skupinu liječenu MPTP-om, skupinu liječenu MPTP-om plus Ka skupina, i samo Ka tretirana skupina. U skupini liječenoj MPTP-om, miševi su primali kroničnu primjenu MPTP-a s protokolom sličnim prethodno opisanom [26]: MPTP je otopljen u fiziološkoj otopini i ubrizgan supkutano u dozi od 25 mg/kg nakon čega je slijedilo 250 mg/kg probenecida (otopljenog u dimetil sulfoksidu) intraperitonealna (ip) injekcija u intervalima od 1 h svaka 3,5 dana tijekom razdoblja od 5 tjedana. Kontrolni miševi primili su fiziološku otopinu i injekciju probenecida. U skupini koja je primala MPTP plus Ka, miševi su primali Ka (50 mg/kg, jedna injekcija/dan tijekom pokusa, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kina) intraperitonealno (ip) dnevno 3 dana prije tretmana MPTP-om i tijekom 5 MPTP-a. tjedna injekcije. Tjedan dana nakon posljednje injekcije MPTP-a, miševi su podvrgnuti ispitivanju ponašanja zaslijepljenih skupina. Nakon toga, svi miševi su anestezirani s 40 mg/kg natrijevog pentobarbitala i žrtvovani za detekciju moždanih proteina i imunohistokemijsku ili qPCR analizu.

2.4. In vivo stereotaksična kirurgija i eksperimentalni tretmani

Stereotaksična kirurgija pod anestezijom natrijevim pentobarbitalom (40 mg/kg, ip) izvedena je kako je opisano [25]. Mišji Atg5 i kontrolna shRNA transficirani su vektorima za pakiranje (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) za stvaranje AAV. Za mikroinjekciju, anestezirani miševi se stavljaju u stereotaksički aparat. Ubrizgan im je 1μL AAV staklenom elektrodom usmjerenom na DG(AP:-0.3 mm; ML:±0.13 mm; DV:-0.45 mm） na brzinom od 0,25 μL/min. Zatim je igla zadržana dodatnih 2- min. 2 tjedna nakon mikroinjektiranja virusa, miševi su podvrgnuti MPTP-induciranom PD modelu provođenja i (ili) tretmanu Ka.

Atg5 shRNA dobivena je od Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Za Atg5 tišinu, početnice su prikazane u Dodatnoj tablici 1.

2.5. Analiza ponašanja

Tjedan dana nakon završne injekcije MPTP-a ili slane otopine, obavljeni su rotarod test i pole test kao što je prethodno opisano [27]. Za rotacioni test, miševi su aklimatizirani na rotacioni štap u dva pokusa (6 min s ubrzanom brzinom od 12-20 o/min) dnevno tijekom 2 uzastopna dana prije početka eksperimenta. Zatim su miševi testirani na 20 okretaja u minuti tijekom 300 s tijekom druga 3 uzastopna dana. Kašnjenje do pada zabilježeno je korištenjem Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Kina). Za test na stupu, miševi su postavljeni glavom gore na vrh okomitog drvenog stupa (hrapave površine, visine 50 cm, promjera 1 cm). Svi miševi su naviknuti na aparat 2 dana prije testiranja, a zatim su testirani tri puta u trećem danu. Zabilježeno je ukupno vrijeme (T-ukupno, dok miš nije došao do poda sa svoje četiri šape) i vrijeme okretanja (T-okret, da se miš potpuno okrene glavom prema dolje). Eksperiment je bio slijep za skupine miševa za svako testiranje ponašanja i test je izveden tri puta.

2.6. Prikupljanje uzoraka mozga

Nakon završnih testova ponašanja, miševi su anestezirani natrijevim pentobarbitalom (40 mg/kg, ip). Za qPCR, western blotting i analizu tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC), cijeli mozgovi su brzo ekstrahirani iz životinja, zatim su tkiva srednjeg mozga i strijatuma brzo secirana, prethodno zamrznuta tekućim dušikom. Svi su uzorci pohranjeni na -80 stupnjeva do analize.

Za imunohistokemijsku analizu, miševi su perfundirani transkardijalno s 4 posto paraformaldehida (PFA). Mozgovi su izvađeni, naknadno fiksirani, dehidrirani, ugrađeni u OCT (Tissue-Tek), a serijski dijelovi mozga su kriopresječeni (30 μm po rezu) kroz svaki cijeli stratum i međumozak korištenjem mikrotoma za zamrzavanje (Leica CM1950, Nussloch, Njemačka ). Svi su dijelovi sakupljeni u šest odvojenih serija, a rezovi mozga pohranjeni su u 50-postotnom glicerinu i zamrznuti na -20 stupnjeva do analize.

Za TEM, miševi su perfundirani s 2,5 posto glutaraldehida i 2 posto paraformaldehida kao što je opisano 【12】. Mala porcija (<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Imunohistokemijska analiza

Kriške mozga isprane su u PBS-u, a zatim u 3-postotnoj H2O, 10 min, a zatim su inkubirane s 0.3-postotni Triton X-100 u PBS-u s dodatkom 5 posto BSA tijekom 1 sata. Nakon toga, stakalca su inkubirana s primarnim antitijelima na 4 stupnja preko noći u PBS-u koji sadrži 5 posto BSA na 4 stupnja preko noći, zatim su isprana i inkubirana u sekundarnim antitijelima 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega je uslijedila inkubacija s diaminobenzidinom (DAB) ili stavljanje u DAPI (Life Technologies, Cat P36931) kao imunofluorescentno bojenje tijekom 5 minuta. Za bojenje Nisslom stakalca su spojena u otopini krezil ljubičaste (CV) (0,1 g krezil ljubičaste, 99 ml H, O i 1 posto octene kiseline 1 ml) 30 minuta na sobnoj temperaturi, zatim dehidrirana s alkoholom i ksilolom. Slike su promatrane i fotografije su snimljene pod mikroskopom Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Sjedinjene Države). Ukupan broj TH-pozitivnih i Nissl-pozitivnih neurona u SNpc dobiven je serološki metodom optičkog frakcionatora sa softverom MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, SAD).

2.7. Analiza tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC).

Uzorci strijatuma miševa homogenizirani su s {{0}}.1 M perklornom kiselinom （1 mg tkiva u 100 μL perklorne kiseline） i 0,1 mM EDTA, tretirani ultrazvukom i centrifugirani na 20,000 okretaja u minuti tijekom 30 minuta kako je navedeno [27]. Zatim su tekućine supernatanta sakupljene za mjerenje. Mobilna faza je miješana otopina koja se sastoji od 90 mM monobazičnog natrijevog fosfata, 1,7 mM 1-oktan sulfonske kiseline, 50 mM citrata, 50 μM EDTA, 10 posto acetonitrila uz brzinu protoka od 0,2 ml/min. Paralelno, za izračun kvantitativne standardne krivulje, pripremljene su osnovne standardne otopine za dopamin i dihidroksi-fenil octenu kiselinu (DOPAC) (Sigma-Aldrich, SAD) u 0,1 M HClO4. Ubrizgana je količina od 10 ul pripremljenog supernatanta ili standardne otopine u mobilnu fazu i ispitan elektrokemijskim detektorom ESA Coulochem ⅢI (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Uzorci su izmjereni i vršne vrijednosti su kvantificirane. Koncentracije monoamina su kvantificirane usporedbom sa standardom pomoću softvera ClarityChrom (Knauer, Njemačka) i zatim sadržaji u stratumu pretvoreni su prema omjeru razrjeđenja. Standardna krivulja DA i DOPAC prikazana je na Dodatnoj slici 1a i b.

2.8. Kulture stanica i tretmani

Kulture mezencefaličnih primarnih neurona provedene su kako je prethodno opisano [12]. Ukratko, mezencefalna tkiva C57BL/6 miševa na embrionalni dan 14/15 (E14/15) pažljivo su uklonjena, mehanički disocirana kako bi se uklonile membrane i velike krvne žile, a zatim secirao. Zatim su digestirane s tripsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, SAD) i zatim filtrirane kroz 100- μm filter da se dobije jednostanična suspenzija. Nakon toga, stanice su nasađene na poli-L-lizin - prethodno obložene 12-/24-jažične ploče na 2,5×10 stupnjeva stanica/ml koje sadrže Neurobasal medij (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Rockford, SAD) s dodatkom B27 (2 posto v:v, Cat 17504044, GibcoTM) i penicilin/streptomicin (0,5 posto v:v). Kulture su držane u vlažnoj komori (37 stupnjeva, 5 posto CO2 inkubator). Medij kulture je mijenjan svaka 3 dana a ćelije se mogu koristiti nakon 7-10 dana.

Stanične linije: SH-SY5Y stanične linije uzgajane su u 10 posto FBS-a i 1 posto penicilina/streptomicina u vlažnom inkubatoru na 37 stupnjeva i 5 posto CO2. U pokusima su stanice SH-SY5Y tretirane s MPP（200 μM） ili različitim dozama Ka（0,3,30,60,100,300,600 μM） tijekom 24 sata. Stanice Ka （3,10,30,60 μM, 3 h）primirane-SH-SY5Y stimulirane su s MPp plus （400 μM） tijekom 24 h. Ka （30 μM, 3 h） sa （ili bez） 3-MA （3 mM, 1 h） ili -tokoferol（50 μM, 1 h, Sigma-Aldrich, 47783）primirane-SH-SH5Y stanice su stimulirane s MPP plus （200 μM） tijekom 24 h.

2.9. Preživljavanje stanica CCK8 test

Promijenjena održivost stanica tretmana Ka otkrivena je kompletom za brojanje stanica-8(CCK-8 komplet, Selleck, Houston, TX, SAD). Ukratko, stanice SHSY5Y posađene su u 96- ploču s jažicom i zatim tretirati različitim koncentracijama Ka（3, 30, 60, 100, 300, 600 μM） tijekom 24 h. Zatim je u svaku jažicu dodano 10ulof CCK-8 reagensa tijekom 4 h. Konačno, apsorbancija je detektirana Multiskan Spectrumom (Thermo Fisher Scientific) na 450 nm.

2.10. Određivanje ATP-a

Stanične razine ATP-a detektirane su ATP Bioluminescence Assay Kitom (Beyotime Biotechnology Co., Kina〕prema uputama proizvođača. Nakon tretmana, stanice su lizirane i centrifugirane na 12,000 okretaja u minuti 5 minuta na 4 stupnja i supernatanti su sakupljeni. Radna otopina (100 μL) dodana je u 20 μL uzorka u 96-ploči s jažicama, a luminescencija je odmah izmjerena na automatskom čitaču mikroploča. Mjerenja iz svih uzoraka normalizirana su na koncentraciju proteina.

2.11. Na plus -K -ATPaza analiza

Za mjerenje Na plus -K plus -ATPaze (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Kina), stanice su sonikirane i centrifugirane na 6000 okretaja u minuti 10 minuta da se dobije supernatant. Dodane su reakcijske otopine detekcije Na plus -K plus -ATPaze i inkubirane prema uputama proizvođača. Zatim je detektirana apsorbancija na 660 nm. Mjerenja svih uzoraka normalizirana su na koncentraciju proteina.

2.12. Western blotting analiza

Stanice ili moždana tkiva lizirana su u RIPA puferu (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 posto NP-40 (FNNO021, Thermo), 0,5 posto natrija deoksikolat (D6750, Sigma), 0,1 posto SDS (74255, Sigma) s dodatkom inhibitora proteaze i fosfataze (Roche, Shanghai, Kina). Koncentracije proteina određene su s Micro BCA Kitom (Beyotime, Shanghai, Kina). A {{13 }}ug proteina svakog uzorka odvojeni su pomoću SDS-PAGE pomoću poliakrilamidnih TGX gelova (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD), a zatim prebačeni na membrane od poliviniliden difluorida (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Nakon blokiranja, PVDF membrane su inkubirane s različitim specifičnim primarnim antitijelima u TBST na 4 stupnja preko noći, zatim su isprane i inkubirane u odgovarajućim sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom (HRP) hrena 1 h na sobnoj temperaturi. Imunoreaktivne trake su vizualizirane i detektirane poboljšanom kemiluminiscencijom (ECL) plus detekcijskim reagensom (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) i analiziran pomoću ImageQuantM LAS 4000 sustava za snimanje (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, SAD).

2.13. Kvantitativna (Q) i reverzna transkripcija (RT) PCR u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz tkiva mozga i kultiviranih stanica pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). Reverzna transkripcija je provedena pomoću kompleta reagensa TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japan). qPCR u stvarnom vremenu proveden je pomoću SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) u instrumentu StepOnePlus (Applied Bio-systems). Početnice je kupio i validirao General (Šangaj, Kina). Primeri korišteni za qPCR prikazani su u Dodatnoj tablici 2.

2.14. Analiza laktat dehidrogenaze (LDH).

U skladu s uputama proizvođača, stanice su stavljene u 96-ploču s jažicama od 5000 stanica po jažici, a medij za kulturu je sakupljen za mjerenje razine LDH pomoću pribora za ispitivanje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Tada je apsorbancija uzoraka detektirana Multiskan Spectrumom (Thermo Fisher Scientific) na 450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 i MitoTracker tamno crveno bojenje

Žive stanice su isprane s PBS-om i inkubirane s 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) ili BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1）（2.0 μM , InvitrogenTM, Cat D3861）u PBS-u 15 minuta na 37 stupnjeva. Za bojenje MitoTracker Deep Red, žive stanice su inkubirane s 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) u PBS-u 30 minuta na 37 stupnjeva. Zatim su stanice dvaput su isprani u PBS-u i fiksirani u 3,5 posto PFA 10 minuta, nakon čega je uslijedilo ispiranje i suprotno bojenje s Hoechst 33342 (Sigma, Cat B2261) 10 minuta prije nego što su prekriveni stakalcima za snimanje. Slike su promatrane i fotografije snimljene fluorescentnom mikroskopijom (Olympus, Tokio, Japan).

2.16. Hoechst i PI bojenje

Stanice su obojene s Hoechst 33,342（1 ul razrijeđeno u 500 ul PBS, Sigma, Cat B2261） i (ili)PI （0,1 ul razrijeđeno u 500 ul PBS, Solarbio, CA1020) 10 minuta i zatim fiksirane i promatrana fluorescentnom mikroskopijom (Olympus, Tokyo, Japan).

2.17. Protočna citometrija

Stanice su probavljene i isprane s D-hankom, a zatim obojene s aneksinom V-FITC（5 ul razrijeđeno u 500 ul PBS）/PI（0,1 ul razrijeđeno u 500 ul PBS) komplet za apoptozu (CA1020, Solarbio, Peking, Chian) prema protokolu proizvođača. Nakon toga, apoptotičke stanice su analizirane protočnom citometrijom (guava easyCyteTM 8, Millipore, SAD). Mjerenja mitohondrijskog ROS-a i potencijala mitohondrijske membrane provedena su kako je objavljeno 【12】. SH-SY5Y stanice su obojene s MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, SAD) ili s Jul (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, SAD) na 37 stupnjeva tijekom 30 minuta. Nakon dva puta ispiranja s PBS-om, stanice su zatim resuspendirane u hladnom PBS-u koji je sadržavao 1 posto FBS-a za protočne citometrijske analize. Podaci su analizirani softverom FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, SAD).

2.18. Testovi disanja morskog konjica

Mitohondrijska respiratorna funkcija u živim SH-SY5Y stanicama mjerena je pomoću Seahorse extracelular flux (XFe96) analizatora (Agi-lent, Santa Clara, SAD) preko promjena u stopi potrošnje kisika (OCR). SH-SY5Y stanice zasađene na 3 × 103 stanicama/jažici ostavljeno je da prianjaju na ploče s kulturom stanica Seahorse i da postignu približno 80 posto konfluentnosti u vrijeme eksperimenta. Sljedeći dan, stanice su prethodno tretirane s Ka, a zatim izložene MPp plus još 24 sata. OCR je otkriven u bazalnim uvjetima nakon čega je uslijedilo uzastopno dodavanje 1 µM oligomicina, 1 µM FCCP, kao i 1 µM rotenona i antimicina A.

2.19. Statistička analiza

Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Značajnost razlike određena je Studentovim t-testom, dvosmjernom analizom varijance ili jednosmjernom analizom varijance (ANOVA) nakon čega je slijedio Tukeyev post hoc test. Razlika se smatrala značajnom kod P<>

3. Rezultati

Rezultat 1. Ka obnavlja motoričku disfunkciju i povećava razinu dopamina u striatumu miševa MPTP/p PD modela

Da bi se istražio neuroprotektivni učinak Kaon PD patogeneze, 4-mjesečnim mužjacima C57BL/6 miševa ubrizgan je neurotoksin MPTP da se uspostavi model MPTP/p PD i liječeni su s Ka (Slika la). Nakon indukcije modela, test rotarod testa i test pola korišteni su za procjenu motoričkih i bihevioralnih performansi miševa u različitim skupinama. Kao što je prikazano, vrijeme izvedbe rotarodne šipke bilo je značajno smanjeno kod miševa tretiranih MPTP-om, a ovaj je učinak spriječio Ka (slika 1b). Ka je također obnovio poremećaje u ponašanju izazvane MPTP-om, kao što je naznačeno smanjenjem vremena okretanja i ukupnog vremena u testu s motkom (Slika lc i d), bez utjecaja na tjelesnu težinu miševa (Slika le). Nadalje, HPLC analiza pokazala je da je razina dopamina u striatumu bila značajno smanjena u MPTP/p-izazvanih miševa, a ta je razina vraćena tretmanom Ka (Slika 1f. Liječenje Ka je također ublažilo MPTP/p-induciranu redukciju dihidroksila -fenil octene kiseline (DOPAC, metabolit dopamina) u striatumu (Slika 1g). Ovi rezultati sugeriraju da Ka obnavlja motoričku disfunkciju i povećava razinu dopamina u striatumu kod MPTP-induciranih PD miševa.

Rezultat 2. Ka ublažava gubitak DA neurona u SNpc MPTP/p PD modela miševa

Zatim, kako bismo dodatno procijenili neuroprotektivni učinak Kaon MPTP/p-induciranog DA neuronskog oštećenja, ispitali smo tirozin hidroksilazu (THD plus neurone u mišjem SNpc imunološkim bojenjem. Kao što je prikazano na sl. 2a i b, MPTP/p je izazvao značajno smanjenje u broju TH plus neurona, koji je ublažen tretmanom Ka. Nadalje, stereološki brojevi ukupnih neurona u SNpc, kako je definirao Nissl

Sl. 1. Liječenje Ka ublažava motoričku disfunkciju i povećava razinu dopamina u striatumu MPTP/p PD modela miševa.

(a) Shematski dijagram eksperimentalnog dizajna. (b) Vrijeme na štapu je izmjereno za test rotarod tri uzastopna dana. (cd) Vrijeme potrebno za okretanje (vrijeme okretanja) i spuštanje sa motke (vrijeme penjanja) zabilježeno je za test štapa. (e) Tjelesne težine miševa izmjerene su na kraju studije. (fg) Dopamin (DA) i dihidroksi-fenil octena kiselina (DOPAC) u striatumu analizirani su tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.n =9-10 za svaku skupinu u (b,c,d); n =6-8 za svaku skupinu u (f, g).ns, nije značajno, *P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

bojenjem, potvrdio je da gubitak TH stanica odražava staničnu smrt, ali ne i smanjenu regulaciju ekspresije TH i pokazao je da je liječenje Ka obnovilo smanjenje broja Nissl-pozitivnih neurona u SNpc miševa tretiranih MPTP-om s 43,3 posto na 25,4 posto ( Slika 2c i d). Osim toga, Ka je značajno poboljšao MPTP-induciranu redukciju ekspresije TH i DAT proteina, kako je izmjereno Western blotom (Slika 2e-g). Ovi dokazi potvrđuju neuroprotektivni učinak Ka na PD mišji model.

Rezultat 3. Ka smanjuje nakupljanje LD vakuola i oksidativni stres u SNpc MPTP/p-tretiranih miševa

Sve više dokaza pokazalo je uključenost LD-ova u NDD-ove[10], dosljedno, naš prethodni rad identificirao je povećane LD-ove u SNpc MPTP-induciranog PD-a miševa[12]. LD se mogu lako identificirati i pokazuju okrugle strukture niske gustoće s homogenim amorfnim sadržajem [28]. Normalno, LD se mogu razgraditi autofagijom kako bi se izbjeglo nakupljanje [29]. Kako bi se istražilo može li Ka regulirati LD-ove u PD-u, analizirano je nakupljanje LD-ova transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) u SNpc kontrolnih, MPTP/p i MPTP/p plus Ka miševa. Kao što je prikazano u našem prethodnom radu [12], broj i veličina LD-ova bili su povećani u MPTP/p miševa u usporedbi s kontrolama tretiranim fiziološkom otopinom (Slika 3a i b) i značajno su smanjeni u miševa tretiranih Ka (Slika 3c- e). Štoviše, u miševa tretiranih Ka-om, LD-ovi su češće uočeni u blizini autolizosoma, zatvoreni u njih ili razgrađeni od strane autolizosoma, koji su definirani kao granule lipofuscina gustih elektrona. Daljnje histološko bojenje TH* neurona s BODIPY, bojom koja specifično označava neutralne lipide i obično se koristi za otkrivanje LD-ova [30], pokazalo je da su i broj i veličina BODIPY LD-ova u SNpc bili veći u PD miševa nego u kontrolnih, i značajno su smanjeni tretmanom Ka (Slika 3f-h).

Ako se LD-ovi ne mogu razgraditi na vrijeme, akumulirani LD-ovi mogu biti podvrgnuti peroksidaciji i pridonijeti mitohondrijskom ROS-posredovanom stresu [4], što pojačava neurotoksičnost i progresiju bolesti. Stoga smo dodatno ispitali profile ekspresije gena povezanih sa zaštitom od toksičnosti slobodnih FA (Gpx8), neutralizirajućih oksidativnih vrsta, superoksidnih radikala (Sod3) i vodikovog peroksida (Cat) i metabolizma FA (Acsbg1 i Dbi) kako je objavljeno [31] , svi su bili izrazito smanjeni u SNpc miševa tretiranih MPTP-om u usporedbi s kontrolama, a ti su učinci poboljšani kod PD miševa tretiranih Ka-om (Slika 3i). Slično, MPTP/p je također povećao razine ekspresije mRNA

sl.2. Ka ublažava gubitak DA neurona u SNpc MPTP/p PD modela miševa.

(ab) Mikrofotografije tirozin hidroksilaza(TH)-pozitivnih neurona (a) i stereološki brojevi TH-pozitivnih neurona u substantia nigra pars compacta (SNpc)(b). Mjerne trake su kao što je naznačeno. (cd) Mikrofotografije krezil ljubičaste -pozitivne stanice(c) i stereološki brojevi krezil violet-pozitivnih stanica u SNpc(d). Ljestvica, 120 μm.（npr.） Western blot analiza ekspresije TH i DAT proteina u SNpc（e） i kvantitativna analiza（f,g）. Kvantificirani podaci su normalizirani na kontrolnu skupinu s fiziološkom otopinom. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM.*P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Rezultat 4. Ka štiti SH-SY5Y stanice od MPP plus-inducirane apoptoze

MPP plus, aktivni metabolit MPTP-a, inhibira enzime mitohondrijskog kompleksa i uzrokuje staničnu smrt koja je izravno povezana s PD-om[32]. Zatim smo istražili može li Ka spriječiti neuronsku apoptozu induciranu MPP plus in vitro. Kao što je prikazano na slikama 4a i b, MPPt（400 μM, 24 h) inducirao je otpuštanje LDH iz SH-SY5Y stanica, a Ka (30 i 60 μM） značajno je oslabio otpuštanje LDH bez utjecaja na preživljavanje stanica (Slika 4a). Budući da je Ka inducirao značajan zaštitni učinak pri koncentraciji od 30 μM（Slika 4b）, koristili smo ovu koncentraciju u narednim eksperimentima. Rezultati Hoechst/PI bojenja također su pokazali da je Ka značajno smanjio postotak stanica s MPP plus -induciranom kondenzacijom kromatina (Sl. 4c i d) i stanične apoptoze, što je dokazano povećanim intenzitetom Hoechst fluorescencije (Sl. 4c) i postotkom Hoechst/PI-obojenih stanica (Hoechst plus /PI plus ) (Sl. 4e). Također, kao otkrivena protočnom citometrijom, MPPt inducirana stanična apoptoza, što je dokazano povećanim postotkom stanica obojenih aneksinom V (AV plus /PI- i AV plus /Prt) zaštićeno je s Ka (Slika 4f i g). Dodatno, Ka je značajno preokrenut MPP plus-inducirane promjene u ekspresiji proteina povezanih s apoptozom, što je dokazano pojačanom regulacijom B cl-2, niža regulacija Baxa (Slika 4hi-j) i smanjeno cijepanje kaspaze-3(Slika 4h, k). Ovi podaci sugeriraju da Ka može poništiti štetne učinke MPp plus na preživljavanje stanica.

Rezultat 5. Ka potiskuje MPp plus-induciranu akumulaciju LD i peroksidaciju lipida, koji posreduju oštećenje mitohondrija u SH-SY5Y stanicama

Nedavne studije su pokazale da neočekivano nakupljanje LD može rezultirati povećanim stresom posredovanim peroksidacijom lipida i ubrzati disfunkciju mitohondrija, što potiče neurodegeneraciju [10]. Naš prethodni rad također je pokazao da su povećani LD-ovi u SNpc bili povezani s PD patologijom u miševa [12]. Kako bismo istražili je li zaštitni učinak Ka povezan s nakupljanjem LD-a in vitro, prvo smo izveli LD-specifično bojenje u SH-SY5Y stanicama pomoću BODIPY 493/503 i uočili povećano taloženje LD-a (povećane razine neutralnih lipida)

Slika 3. Ka je smanjio nakupljanje elektron-gustih LD vakuola i oksidaciju lipida u SNpc MPTP/p-tretiranih miševa.

(ac) Reprezentativne EM slike koje prikazuju elektron-sjajne vakuole (kapljice lipida), elektron-guste autofagne vakuole koje sadrže autolizosome (ALS) ili lizosome koji sadrže lipofuscin (Lys) u SNpc miševa tretiranih fiziološkom otopinom (a), MPTP/p (b), i MPTP/p plus Ka (c). Ljestvice, 500 nm. S(a,b) kao što je naznačeno u našem prethodnom radu (PMID:29967574). (de) Kvantifikacija elektron-sjajnih LD vakuola po neuronu u SNpc u naznačenih miševa. n =3 miševa, 10-12 neurona po skupini. (fh) Sekcije srednjeg mozga miševa tretiranih fiziološkom otopinom, MPTP/p- i MPTP/p plus Ka obojene su na BODIPY (LDs) i TH (DA neurone). Krajnje desne ploče prikazuju povećanja BODIPY plus TH plus neurona. Strelice pokazuju LDs.(gh), Kvantifikacija BODIPY plus LD broj i veličina. (ii) Analizirana je ekspresija mRNA gena povezanih s toksičnošću FFA (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1 i Dbi) (i) i gena za oksidativni stres (Nox1, Nox2 i Nox4) (j) u SNpc navedenih miševa qPCR-om u stvarnom vremenu.n=4-5 po skupini, tri neovisna eksperimenta. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM; ns, nije značajno, *P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Ovaj je članak izdvojen izhttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101911Primljeno 23. studenog 2020