Polisaharidi žižule ublažili su anemiju kod štakora s kroničnom bolešću bubrega

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang, et al

Sažetak

Polisaharidi žižule (JP) jedan su od aktivnih glikana iz hrane u plodu Ziziphus jujuba, koji se smatra za liječenje nedostatka krvi. U ovoj studiji, akroničnibubregbolest(CKD) štakorski model korišten je za procjenu učinka JP i njegovog mehanizma na anemiju povezanu s CKD. U štakora s kroničnom bubrežnom bolesti liječenje JP značajno se poboljšalobubregfunkcija, bubregpatološkiozljedai hematološke parametre, uključujući porast crvenih krvnih stanica, hemoglobina, hematokrita i broja trombocita. Štoviše, rezultati LC-MS/MS ciljane metabolomike pokazali su da JP pospješuje oslobađanje kratkolančanih masnih kiselina (SCFA) u štakora s KBB-om. Osim toga, JP je mijenjao razinu eritropoetina (EPO) u serumu, EPO mRNA bubrega ibubregEPO protein preko HIF- signalizacije. Zajedno, ovi rezultati pružaju dokaz da učinak JP na anemiju povezanu s KBB-om može biti uključen u regulaciju oslobađanja SCFA i proizvodnju eritropoetina, podržavajući daljnji razvoj JP kao dodataka prehrani u liječenju anemije povezane s KBB-om.

Ključne riječi: Polisaharidi žižuleKroničnobubreg bolestAnemija Eritropoetin Čimbenik inducibilan hipoksijom - Kratkolančane masne kiseline

Kliknite ovdje za više informacija o Cistancheu

1. Uvod

Kroničnobubreg bolest(CKD) definira se kao klinički sindrom bubrežnih strukturnih abnormalnosti ili funkcionalnih oštećenja i postaje sve veći teret za javno zdravlje u cijelom svijetu (Webster, Nagler, Morton i Masson, 2017.). Bubrežna anemija jedna je od najčešćih komplikacija KBB-a koje pridonose povećanom riziku od smrti (Locatelli i sur., 2019.). Nedovoljna proizvodnja eritropoetina (EPO) prepoznat je kao glavni pokretački čimbenik anemije kod kronične bubrežne bolesti (Pappa, Dounousi, Duni i Katopodis, 2015.). EPO se proizvodi u jetri ibubreg, koji je neophodan za proizvodnju eritrocita (Lappin & Lee, 2019). U uvjetima hipoksije faktor inducibilan hipoksijom (HIF) može aktivirati ekspresiju EPO (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019.). Ciljanje HIF-a za induciranje proizvodnje EPO-a stoga se smatra novom terapijskom strategijom za liječenje anemije povezane s CKD-om.

Žižula je plod biljke Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), poznata i kao kineska datulja. Žižula ima dugu tradicionalnu upotrebu koja obuhvaća tisuće godina kao ljekovito bilje i dodatak prehrani. Žižula se koristi kao dodatak zdravlju za osobe koje imaju hematogenu ili kroničnu pothranjenost. Polisaharidi žižule (JP), komponenta topiva u vodi sastavljena od različitih omjera monosaharida i uronske kiseline (Ji, Hou, Yan, Shi i Liu, 2020.), jedan je od aktivnih sastojaka žižule (Ji et al., 2017.). ), za koji je dobro prihvaćeno da pokazuje hepatoprotektivni učinak i imunomodulatorno djelovanje te poboljšava funkciju crijevne barijere (Liu i sur., 2015., Yue i sur., 2015.). Za JP se također obično smatra da ima potencijalne učinke na anemiju. Međutim, još je manje poznat molekularni mehanizam JP u liječenju anemije.

Posljednjih godina, metabolomika se naširoko koristi za razumijevanje potencijalnih čimbenika koji doprinose progresiji bolesti. Ciljana metabolomika naširoko se koristi u identificiranju molekularnih markera složenih ljudskih bolesti kao što je KBB. Potvrđeno je da su indoksil sulfat (IS) i p-krezil sulfat (PCS) biomarkeri progresije CKD (Meijers & Evenepoel, 2011.), a povećani stupanj trimetilamin-N-oksida (TMAO) mogao bi izravno dovesti do bubrežne tubulointersticijske fibroze i disfunkcije (Tang i sur., 2015.). Kratkolančane masne kiseline (SCFA), metaboliti ovisni o crijevnim mikrobima, energetski su supstrati sa sposobnošću utjecaja na različite fiziološke procese (LeBlanc et al., 2017.), a smanjenje SCFA pridonosi progresiji CKD-a. (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary i B¨ ackhed, 2016., Wang i sur., 2019.). Štoviše, SCFA su uspjele zaštititi strukturu bubrega od oštećenja inhibicijom oksidativnog stresa (Li, Ma i Fu, 2017.). Istodobno, otkriveno je da SCFA pokazuju povoljan učinak na apsorpciju željeza i pojačavaju ekspresiju embrionalnog/fetalnog globinskog gena, što inducira eritropoezu i ispravlja anemiju (Tako, Glahn, Knez i Stangoulis, 2014.). Mehanizam djelovanja SCFA u bubrežnoj anemiji još je potrebno razjasniti.

U ovoj studiji pretpostavljamo da bi JP mogao regulirati oslobađanje SCFA i stimulirati proizvodnju EPO posredovanu HIF-om, čiji je ishod ispravljanje bubrežne anemije. Ovdje ćemo istražiti učinak JP u ublažavanju bubrežne anemije kod 5/6 štakora s KBB izazvanih nefrektomijom, uključujući bubrežne funkcije i hematološke parametre. Ciljani metabolomički pristup pomoću LC-MS/MS razvijen je za određivanje osam SCFA uključujući octenu kiselinu, propanoičnu kiselinu, izomaslačnu kiselinu, maslačnu kiselinu, 2-metil maslačnu kiselinu, izovalerijansku kiselinu, valerijansku kiselinu i heksansku kiselinu u fekalnim i uzorci bubrega, a razine ciljanih SCFA procijenjene su u zdravih i CKD štakora. Osim toga, također je otkrivena uključenost HIF signalizacije u štakora tretiranih JP.

Slika 1. Tipična GC–MS kromatografija JP. (A) Strukturne formule monosaharida nakon derivatizacije aldononitril acetata; (B) Reprezentativni GC-MS profili miješane ionske kromatografije (MIC) standardne smjese monosaharida i JP hidroliziranih monosaharida. Vrhovi u kromatografskim profilima odgovarali su kemijskom markeru prikazanom u (A): 1. ramnoza, 2. arabinoza, 3. fukoza, 4. ksiloza, 5. manoza, 6. glukoza, 7. galaktoza, 8. inozitol (ISTD ).

2. Materijali i metode

2.1. Priprema polisaharida žižule

Plodovi Z. jujube kupljeni su od Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Materijale je ovjerio dr. Jianping Chen prema Farmakopeji Narodne Republike Kine izdanje 2015. Uzorci vaučera čuvani su u bolnici tradicionalne kineske medicine Shenzhen pod brojem 18100601.

Sirovi JP ekstrahiran je iz žižule kao što je prethodno opisano, uz manje modifikacije (Ji et al., 2020.). Ukratko, žižule su inkubirane s 10 vol vode (v/w) u vodenoj kupelji na 80 ◦C tijekom 3 sata i ekstrahirane 3 puta. Nakon filtracije, spojite filtrate i kondenzirajte ovu kombinaciju u rotacijskom isparivaču pod kontroliranim vakuumom. Otopina koncentrata je dalje istaložena dodavanjem četiri puta etanola (v/v) na 4 ◦C tijekom 12 h. Talog je sakupljen centrifugiranjem i osušen pod sniženim tlakom do suhoće da se dobije sirovi JP. Kalorimetrijom je utvrđeno da je čistoća JP 80 posto.

2.2. Karakterizacija monosaharidnog sastava polisaharida žižule

Shimadzu GC–MS sustav (Shimadzu GC–MS TQ8040 povezan sa Shimadzu GC 2010 plus) opremljen EI izvorom, SH-Rxi-5Sil MS kapilarnom kolonom (30 m × 0,25 mm ID, 0,25 µm debljine filma, Shimadzu) korišteno je za određivanje derivatiziranih hidroliziranih monosaharida s omjerom dijeljenja od 10:1. Temperatura ubrizgavanja, izvora iona i sučelja bili su 250 ◦C, 200 ◦C i 250 ◦C. Početna temperatura kolone održavana je na 120 ◦C tijekom 1 minute, zatim je povećana na 15 ◦C/min do 160 ◦C i održavana 4 minute, 2 ◦C/min do 165 ◦C i održavana 2 minute, 20 ◦C /

min do 195 ◦C, 5 ◦C/min do 250 ◦C, i držano 3 min. Brzina protoka plina nosača helija održavana je na 46 cm/s, a 2 μL svakog uzorka je ubrizgano u instrument. Analiti su kvantificirani u odabranom načinu praćenja iona (SIM), ciljni ion: ramnoza (m/z 129.00), arabinoza (m/z 115.00), fukoza (m/ z 103.00), ksiloza (m/z 115.00), manoza (m/z 115.00), glukoza (m/z 115.00 ), galaktoza (m/z 115.00), inozitol (m/z 126.00). Standardi monosaharida navedeni su kako slijedi: L ( plus )-arabinoza (1506–200202), fukoza (112014–201902), D-ksiloza (111508–201605), D-glukoza (110833–201908), ramnoza (111683–201502). ), galaktoza (100226–201807), D-manoza (140651–201805) kupljeni su od Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova. Inozitol je dobiven od Sigme (I7508-50 g).

Ekstrahirani JP (10 mg) je hidroliziran u monosaharide s 10 mL 2 mol/L trifluorooctene kiseline (TFA) na 105 ◦C tijekom 3 h, a hidrolizirani monosaharidi iz JP su koncentrirani i isprani pod sniženim tlakom na 60 ◦C do ukloni TFA, a ostaci se rekonstituiraju s 2 mL vode. Dodano je 250 µL otopine hidroksilamin hidroklorida/piridina od 20 mg/mL u 100 µL otopine hidroliziranih monosaharida i držano u vodenoj kupelji na 90 ◦C 45 minuta. Zatim je dodano 250 µL anhidrida octene kiseline i držano u vodenoj kupelji na 90 ◦C još 45 minuta. Na kraju reakcije, smjesa je ekstrahirana s 1 mL cikloheksana 5 puta, a cikloheksanski sloj je koncentriran do 1 mL. Ubrizgan 1 µL supernatanta u GC-MS za analizu (Li & Shi, 2013.).

2.3. Životinje

Svi eksperimenti izvedeni su prema protokolima koje je odobrio Odbor za institucionalnu skrb o životinjama Sveučilišta kineske medicine Guangzhou. Štakori Sprague–Dawley, mužjaci i ženke, težine 180–220 g, dobiveni su iz Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Foshan, Kina, dozvola br. SCXK (Yue) 2008–0002) i držani u posebnoj prostoriji bez patogena (SPF). ) objekt za životinje u ciklusu svjetlo-tama od 12 sati, s slobodnom hranom i vodom.

Za inducirano zatajenje bubrega učinjena je 5/6 nefrektomija prema prethodnom opisu (Chen i sur., 2019.). Cijeli kirurški zahvat izveden je u anesteziji s 10 postotnim kloralhidratom. Grupa za lažnu operaciju (n=6) poduzela je iste korake za otvaranje trbušne šupljine i otkrila bubreg. 5/6 nefrektomirani štakori nasumično su podijeljeni u dvije skupine. Štakori bez liječenja (CKD skupina, n=6) i štakori koji su primali JP (CKD plus JP skupina, n=6) ​​oralno putem sonde u dozi od 1,2 g/kg/dan. Nakon 90 dana rada počelo je 90 dana administracije. 90. dan je bilo posljednje vrijeme davanja JP štakorima, a nakon 24 sata životinje su žrtvovane uzimanjem krvi iz trbušne aorte, a uzorci urina, fecesa, seruma i bubrega sakupljeni su od svakog štakora. Svi su uzorci pohranjeni na -80 ◦C prije daljnje analize.

2.4. Biokemijska analiza

U skladu s uputama proizvođača, urea dušik u krvi (BUN) i serumski kreatinin (Scr) izmjereni su priborom za otkrivanje kreatinina u serumu i priborom za otkrivanje BUN (WAKO, Ginza, Japan), a proteini u urinu izmjereni su priborom Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanjing, Kina). Crvena krvna zrnca (RBC), hemoglobin (Hb), hematokrit (HCT) i broj trombocita (PLT) analizirani su Hematološkim sustavima (Siemens 2021i, Erlangen, Njemačka) prema uputama proizvođača.

2.5. Histološki pregled

Periodična kiselina-Schiff (PAS) i Masson bojanje korišteno je za procjenu bubrežne patološke ozljede, među njima, PAS bojanje korišteno je za otkrivanje bubrežne tubularne atrofije i glomerularnog područja, a Massonovo bojanje za bubrežnu intersticijsku fibrozu (Xie et al. , 2020). Metoda kvantitativne analize provedena je prema prethodnim studijama (Chen et al., 2019). Ukratko, rezultat tubularne atrofije u PAS bojenju definiran je na sljedeći način: 1. rijedak pojedinačni atrofični tubul; 2. nekoliko nakupina atrofičnih tubula; 3. masivna atrofija. Glomerularno područje mjereno je softverom ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Njemačka). Fibrotično područje kod Massonovog bojenja mjereno je korištenjem softvera Image J (NIH, Bethesda, MD, SAD). Najmanje deset mikroskopskih polja (200×) od 6 štakora po skupini nasumično je uhvaćeno kako bi se izmjerio rezultat atrofije, glomerularno područje i fibrotično područje, s najmanje jednim glomerulom u svakom mikroskopskom polju.

2.6. Imunohistokemijska analiza

Renalni parafinski dio (4 μm) iz svakog uzorka postupno je dehidriran ksilenom dva puta i gradijentom etanola (100–95–90–80–70 posto), antigen je vraćen puferom limunske kiseline (pH 6,0 ) 30 minuta, blokiran 3 posto vodikovim peroksidom 10 minuta i kozjim serumom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Sekcije tkiva inkubirane su odvojeno s primarnim protutijelom HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, Lot: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1: 500, Lot: BJ2044786) na 4 ◦C tijekom 10 h i HRP konjugirano kozje anti-zečje sekundarno protutijelo (Abcam, ab6712, 1:1000) na sobnoj temperaturi tijekom 30 minuta, DAB (diaminobezid in) korišten je za otkriti HRP aktivnost, jezgra je obojena hematoksilinom. the. Imunohistokemija je analizirana pod mikroskopskim poljima 400× iz svake skupine i fiksirana je skala=20 μm pomoću Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Njemačka. Jezgra je bila plavo obojena hematoksilinom, a imunopozitivnost DAB-a bila je smeđa, dublje DAB bojenje znači jaču imunohistokemijsku pozitivnu reakciju.

2.7. EPO otkrivanje

Sadržaj EPO u serumu detektiran je ELISA kitom (Abcam, ab274398), a eksperiment se odnosio na protokol ELISA kita. Kao što je sažeto, u uzorak je dodan EPO koktel antitijela i inkubiran 1 h. nakon inkubacije, isprati svaku jažicu puferom za ispiranje 3 puta, dodati TMB u drugu inkubiranu 15 minuta i zaustaviti reakciju.

Ukupna mRNA bubrega ekstrahirana je iz smrznutog bubrežnog tkiva pomoću Trizola i prevedena mRNA u cDNA. PCR u stvarnom vremenu proveden je s Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA SAD, K0223) u skladu s protokolom proizvođača. SYBR zeleni signal je dobiven i izmjeren ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Početnice su bile: 5'-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3' i 5'-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3' za EPO štakora (214 bps, NM_017001). 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ i 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ za GAPDH (181 bps, NM_017008.3), housekeeping gens kao unutarnja kontrola u svim slučajevima. A relativna kvantifikacija ekspresije gena izračunata je metodom normalizirane ekspresije gena (2− ΔΔCT).

Jednake količine proteina lizata korteksa bubrega napunjene su i odvojene 10-postotnim SDS gelom i zatim prebačene na nitrocelulozne membrane. Nakon što su blokirane u 5 postotnom nemasnom mlijeku 2 sata na sobnoj temperaturi, membrane su inkubirane s primarnim antitijelima na 4 ◦C preko noći. Zatim su membrane inkubirane s HRP (peroksidazom hrena) konjugiranim anti-mišjim IgG (Life Technologies) na sobnoj temperaturi 45 minuta. Aktivnost HRP-a vizualizirana je korištenjem Clarity Western ECL supstrata i analizirana Tanon slikovnim sustavom. Sljedeća primarna protutijela korištena su u ovoj studiji: monoklonski EPO (B- 4) iz miševa (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, 1/500 razrjeđenje), monoklonski -aktin iz miševa (tehnologija stanične signalizacije, 8H10D10, 1/1000 razrjeđenje).

2.8. Analiza kratkolančanih masnih kiselina

Shimadzu UHPLC-LCMS/MS sustav (Shimadzu LC-MS 8045 povezan sa Shimadzu LC-20AD) opremljen ESI izvorom.

Kromatografska separacija provedena je na koloni Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm), upotrebom {{10}}.1 posto mravlje kiseline u vodi ( otapalo A) i acetonitril (otapalo B) pri brzini protoka od 0,3 mL/min gradijentnom elucijom: 0–9 min, 25–30 posto B; 9-11 min, 30-40 posto B; 11–20 min, 40–50 posto B; 20-20,1 min, 50-100 posto B; 20,1–23 min, 100 posto B; 23,1 min–25 posto B za ponovno ekvilibriranje. Temperatura kolone bila je 35 ◦C, a autosampler je držan na 4 ◦C tijekom analize, 1 μL svakog uzorka ubrizgan je u instrument. Detekcija analita provedena je u načinu rada praćenja višestrukih reakcija (MRM), u načinu rada pozitivnih iona. MS parametri: Protok plina za raspršivanje: 3,0 L/min; Protok plina za sušenje: 10 L/min; Grijanje Protok plina: 10 L/min; DL temperatura: 250 ◦C; temperatura sučelja: 300 ◦C; Blok grijanja: 400 ◦C. MRM prijelazi i energija sudara (CE) odabrani su i optimizirani izravnom infuzijom svakog standardnog derivata. MRM prijelazi količina analita sažeti su u tablici S1.

Fekalne SCFA: Dodano je 100 μL 50 posto acetonitrila u 3 mg liofiliziranog fecesa i vrtloženo 2 minute. Zatim se smjesa centrifugira na 12000 okretaja u minuti 10 minuta na 4 ◦C i pipetira se supernatant.

Bubrežni SCFA: Izvagano 100 mg bubrežnog tkiva i vorteksirano na ledu s 4 puta normalnom fiziološkom otopinom (100 mg/400 μL) za pripremu tkivnog homogenata. Dodan je 3 puta hladni metanol u 300 μL tkivnog homogenata i miješan 2 minute, zatim je smjesa centrifugirana na 12000 okretaja u minuti 10 minuta na 4 ◦C i pipetira se supernatant. Supernatant je osušen pomoću N2 i rekonstituiran sa 100 μL 50 postotnog acetonitrila.

Dodano 500 mmol/L N-(3-dimetil aminopropil)-Ń -etil karbodiimid hidroklorida (EDC, Aladdin, Shanghai, Kina), 50 mmol/L 3H-[1,2,3]-Triazolo[4, 5-b] piridin-3-ol (HOAT, Aladdin, Shanghai, Kina) i 50 mg/mL 12C-dansilhidrazina (12C-DnsHz, J&K, Peking, Kina) u 20 μL ekstrakcije uzorka u niz s istim volumenom. EDC i HOAT su pripremljeni sa svježim 500 mmol/L 2-(N-morfolino) etansulfonske kiseline (MES, Macklin, Šangaj, Kina). Nakon inkubacije na 20 ◦C tijekom 90 minuta, 20 μL 50 mmol/L CuCl2 (Macklin, Šangaj, Kina) je dodano u smjesu kako bi se reakcija derivatizacije zaustavila na 40 ◦C tijekom 30 minuta (Zhao & Li, 2018). Na kraju derivatizacije smjesa je 10 puta razrijeđena s 25 postotnim acetonitrilom. Prije analize, 100 μL supernatanta je pomiješano sa 100 μL otopine internog standarda. Oznaka 13C-DnsHz korištena je kao interni standard (ISTD1-8) u skladu s istom reakcijom derivatizacije. Standard SCFA: octena kiselina (AA, A116173), propanska kiselina (PA, P110446), izomaslačna kiselina (IBA, I103524), maslačna kiselina (BA, B110438), 2-metil maslačna kiselina (2- BA, M107377), izovalerijanska kiselina (IVA, I108280), valerijanska kiselina (VA, V108271), heksanska kiselina (HA, H103632) isporučene su iz Aladdina (Šangaj, Kina).

2.9. Statistička analiza

Podaci svake skupine izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Statistička značajnost među skupinama provedena je jednosmjernom ANOVA i post hoc analizom sa Student-Newman-Keuls (SNK) testom ili Dunnettovim T3 testom. Vrijednost P < 0.05="" smatra="" se="" statistički="" značajnom.="" svi="" podaci="" izvedeni="" su="" korištenjem="" spss="" statističkog="" softvera="" (verzija="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

3. Rezultati

3.1. JP je poboljšao funkciju bubrega štakora s kroničnom bubrežnom bolesti

Monosaharid JP karakteriziran je prije tretmana na životinjama. JP korišten u ovoj studiji sastavljen je od sedam monosaharida, to jest ramnoze (1,62 posto), arabinoze (15,79 posto), fukoze (0.21 posto), ksiloze (4,56 posto), manoze (3. 00 posto), glukoza (73,44 posto) i galaktoza (4,99 posto) (slika 1). Našu metodu analize potvrdili su linearnost, preciznost, ponovljivost, stabilnost i oporavak (tablice S2-S3). Potvrđeno je da su analiti stabilni na sobnoj temperaturi 24 sata. Iskorištenje JP treba biti veće od 8,63 posto, a čistoća ne manja od 77,16 posto. Gore navedena kemijska analiza JP poslužila je kao pristup kontroli kvalitete kako bi se osigurala ponovljivost dolje navedenih studija na životinjama.

Scr, BUN i proteini u mokraći bili su najreprezentativniji za funkcije bubrega. Scr, BUN i razine proteina u urinu kod štakora s kroničnom bubrežnom bolesti bile su značajno više nego u lažnoj skupini (P < {{0}}.01).="" nakon="" 90="" dana="" liječenja="" jp-om,="" razine="" scr,="" bun="" i="" proteina="" u="" mokraći="" smanjene="" su="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" s="" kroničnom="" bubrežnom="" bolesti="" (p=""><0,01) (slika="">

3.2. JP je ublažio bubrežnu patološku ozljedu kod štakora s kroničnom bubrežnom bolesti

Težina cijelog desnog bubrega za lažnu skupinu i ostatka desnog bubrega za CKD i CKD plus JP skupinu korištena je za procjenu morfologije bubrega prema težini bubrega (KW) i težini bubrega/tjelesnoj težini (KW/TT). Na kraju pokusa, KW i KW/TT grupe s kroničnom bubrežnom bolesti povećani su u usporedbi s lažnom grupom (svi P < {{0}}.05).="" u="" 5/6="" modelu="" ckd="" izazvanog="" nefrektomijom,="" smanjenje="" aktivnosti="" bubrežne="" proteinaze="" uzrokovalo="" je="" kompenzacijski="" rast="" bubrega,="" tvrtke="" s="" bubrežnom="" hipertrofijom="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985.),="" a="" naša="" je="" izjava="" potvrdila.="" nakon="" tretmana="" jp,="" kw="" je="" značajno="" smanjen="" (p="">< 0.05)="" i="" zatvoren="" za="" lažnu="" skupinu="" (p="" ˃="" 0.05);="" dok="" je="" kw/bw="" blago="" smanjen="" (p="" ˃="" 0,05).="" (slika="">

Slika 2. JP je zaštitio funkciju bubrega kod štakora s kroničnom bubrežnom bolesti. Razina Scr (A), BUN (B) i proteina u mokraći (C) u različitim skupinama. (D) težina bubrega, (E) KW/TT. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD, n=6 po skupini (**P < 0.01="" u="" usporedbi="" s="" lažnom="" grupom;="" #p="">< 0).05="" ,="" ##p="">< 0,01="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="">

U skupini s kroničnom bubrežnom bolesti, bubrežna tubula pokazala je masivnu atrofiju u usporedbi s lažnom skupinom (P < {{0}}.01),="" a="" područje="" glomerula="" i="" bubrežna="" intersticijska="" fibroza="" bile="" su="" gotovo="" dvostruko="" veće="" od="" onaj="" lažne="" skupine="" u="" kvantitativnoj="" analizi="" (p="">< 0.01).="" nakon="" liječenja="" jp,="" rezultat="" tubularne="" atrofije="" smanjen="" je="" za="" gotovo="" dva="" puta="" (p=""><0,01), područje="" glomerula="" gotovo="" je="" vraćeno="" u="" lažnu="" skupinu="" (p=""><0,01), a="" bubrežna="" intersticijska="" fibroza="" smanjena="" je="" za="" jednu="" trećinu="" (p=""><0,01) kao="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" ckd="" (slika="">

Slika 3. JP je zaštitio strukturu bubrega kod štakora s kroničnom bubrežnom bolesti. (A) PAS bojenje. (B) Massonovo bojenje. (C) Rezultat tubularne atrofije. (D) Glomerularno područje (E) Fibrotično područje. Sve slike prikazane su pri identičnom povećanju, 200×, skala=100 μm. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD, n=6 po skupini (**P < 0.01="" u="" usporedbi="" s="" lažnom="" grupom;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" u="" usporedbi="" s="" ckd="" grupom="">

3.3. JP je modulirao hematološke parametre kod štakora s KBD-om

Za hematološke parametre mjerena je biokemijska analiza, RBC, Hb, HCT i PLT. U štakora s kroničnom bubrežnom bolesti, razina RBC-a pala je s 9.06 na 7,20 × 1012 /L, Hb s 15,28 na 13,22 g/dL, HCT s 47,1 na 40,4 posto, a PLT je porastao od 1012 do 1526 × 109 /L u usporedbi s lažnom skupinom (P < 0,01),="" što="" je="" pokazalo="" da="" su="" znakovi="" anemije="" uočeni="" u="" štakora="" s="" kbb-om.="" snižene="" razine="" crvenih="" krvnih="" zrnaca,="" hb,="" hct="" i="" plt="" u="" štakora="" s="" ckd-om="" liječenih="" jp-om="" su="" vraćene="" (p=""><0,01) (slika="">

Slika 4. JP je rehabilitirao hematološke parametre kod štakora s KBB-om. Razina PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD, n=6 po skupini (**P < 0.01="" u="" usporedbi="" s="" lažnom="" grupom;="" #p="">< 0).05="" ,="" ##p="">< 0,01="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="">

3.4. JP stimulirao ekspresiju EPO

U usporedbi s lažnom skupinom, razina EPO u serumu i količina mRNA EPO u bubrezima bile su značajno smanjene u štakora s kroničnom bubrežnom bolesti anemije (P < 0.01).="" western="" blotting="" analiza="" otkrila="" je="" da="" se="" razina="" proteina="" epo="" blago="" smanjila="" u="" skupini="" s="" kroničnom="" bubrežnom="" bolesti="" bez="" značajne="" razlike.="" nakon="" liječenja="" jp,="" razina="" epo="" u="" serumu,="" epo="" mrna="" bubrega="" i="" protein="" značajno="" su="" poboljšani="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" s="" kroničnom="" bubrežnom="" bolesti="" (p="">< 0.01="" ili="" p="">< 0.05)="" (slika="">

U korteksu bubrega, HIF-1 su uglavnom proizvodile epitelne stanice bubrežnih tubula, HIF-2 se uglavnom eksprimirao u endotelnim stanicama i bubrežnim intersticijskim fibroblastima (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019.). Imunohistokemijska analiza pokazala je da su, kao i za HIF-1, kod štakora s kroničnom bubrežnom bolesti tubulari bili jače obojeni od lažne skupine. Nakon liječenja JP-om, bubrežni tubulus je imao jače i veće obojenje u usporedbi sa skupinom s kroničnom bubrežnom bolesti kao što je prikazano crvenom strelicom na slici 5E. HIF-2 je pokazao relativno slabu imunohistokemijsku pozitivnu reakciju na bubrežni intersticij u skupini Sham. U skupini s kroničnom bubrežnom bolesti, HIF-2 pokazao je pozitivan imunohistokemijski rezultat. Nakon liječenja JP-om, HIF-2 pokazao je jaču imunohistokemiju u usporedbi sa skupinom s kroničnom bubrežnom bolesti (slika 5F).

Slika 5. JP je stimulirao ekspresiju EPO. (A) Sadržaj EPO u serumu. (B)BubregEPO relativna mRNA. GAPDH se smatrao kućnim genom. (C) Reprezentativne Western blot slike ekspresije EPO proteina. (D) Denzitometrijska analiza EPO. (E) Imunohistokemija HIF{{0}}. (F) Imunohistokemija HIF- 2 normalizirana na sadržaj -aktina. Imunohistokemijske slike prikazane su pri identičnom povećanju, 400×, skala=20 μm. Jezgra je bila plavo obojena hematoksilinom, a imunopozitivnost DAB-a bila je smeđa, dublje DAB bojenje znači jaču imunohistokemijsku pozitivnu reakciju. Crvena strelica pokazuje da je imunohistokemijski pozitivan. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD, n=6 po skupini (*P < 0,05="" u="" usporedbi="" s="" lažnom="" grupom;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" u="" usporedbi="" s="" ckd="">

3.5. JP je inducirao oslobađanje SCFA

Ciljani metabolomički pristup temeljen na LC-MS razvijen je za kvantificiranje otpuštanja osam SCFA u fekalnim uzorcima. Utvrđena metoda potvrđena je procjenom linearnosti, osjetljivosti, preciznosti, učinka matrice, točnosti i stabilnosti. Uzorci za kontrolu kvalitete niske, srednje i visoke koncentracije (LQC, QMC, HQC) za provjeru osjetljivosti, preciznosti, točnosti i stabilnosti odabrani su prema točkama najniže, srednje i najviše koncentracije matrične standardne krivulje, a rezultati prikazani su u tablicama S4–S6. Potvrđeno je da su analiti stabilni na 4 ◦C 48 h. LC-MS/MS kromatogram SCFA je prikazan na slici 6.

Slika 6. UHPLC-MS/MS kromatografija SCFA. (A) Gornja je bila kemijska jednadžba derivatizacije SCFA; ispod je strukturna formula SCFA nakon derivatizacije dansilhidrazina; (B) UHPLC/MRM-MS kromatogram mješavine standarda i fekalnog uzorka, kromatografski vrhovi u (B) odgovarali su kemijskom markeru prikazanom u (A):1. 12C-octena kiselina; 2. 13C-octena kiselina (ISTD1); 3. 12C-propanska kiselina; 4. 13C-propanska kiselina (ISTD2); 5. 12C-izomaslačna kiselina; 6. 12C-maslačna kiselina; 7. 13C-izomaslačna kiselina (ISTD3); 8. 13C-maslačna kiselina (ISTD4); 9. 12C-2-metilmaslačna kiselina; 10. 12C-izovalerijanska kiselina; 11. 12C valerijanska kiselina; 12. 13C-2-metilmaslačna kiselina (ISTD5); 13. 13C-izovalerijanska kiselina (ISTD6); 14. 13C-valerijanska kiselina (ISTD7); 15. 12C-heksanska kiselina; 16. 13C-heksanska kiselina (ISTD8).

Što se tiče fekalnog uzorka, u skupini s CKD, razine AA i PA bile su značajno smanjene gotovo 4 puta i 5 puta u usporedbi s lažnom skupinom (P < 0.01);="" dok="" su="" nakon="" tretmana="" jp,="" količine="" aa="" i="" pa="" vraćene="" na="" 4/5="" lažne="" skupine="" (p="">< {{10}}.01).="" slično="" tome,="" razine="" ba="" i="" va="" bile="" su="" značajno="" smanjene="" gotovo="" 30="" puta="" i="" 4="" puta="" u="" skupini="" s="" kroničnom="" bubrežnom="" bolesti="" u="" usporedbi="" s="" lažnom="" skupinom="" (p="">< 0.01).="" liječenje="" jp="" pokazalo="" je="" trend="" povećanja,="" ali="" ne="" i="" značajno="" poboljšanje.="" sadržaj="" iba,="" iva="" i="" 2-ba="" nije="" pokazao="" značajnu="" promjenu="" između="" ckd="" i="" lažne="" skupine.="" nakon="" liječenja="" jp,="" razina="" iba,="" iva="" i="" 2-ba="" bila="" je="" povećana="" (p="">< 0,01).="" međutim,="" ha="" nije="" pokazao="" očitu="" promjenu="" među="" tri="" skupine="" (slika="" 7a).="" štoviše,="" što="" se="" tiče="" bubrežnog="" tkiva,="" u="" skupini="" s="" kroničnom="" bubrežnom="" bolesti,="" količine="" svih="" osam="" scfa="" bile="" su="" značajno="" smanjene="" (p=""><0,01), dok="" su="" nakon="" liječenja="" jp="" razine="" scfa="" povećane="" osim="" za="" ba="" i="" ha="" (p=""><0,01 ili="" p="">< 0,5).="" ba="" je="" bio="" blago="" povećan="" bez="" značajnije,="" a="" ha="" nije="" pokazao="" promjenu="" nakon="" tretmana="" jp="" (slika="">

Slika 7. Sadržaj SCFA u različitim skupinama. (A) Fekalne SCFA. (B) SCFA bubrega. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD, n=6 po skupini (**P < 0.01="" u="" usporedbi="" s="" lažnom="" grupom;="" ##p="">< 0).="" 01,="" #p="">< 0,05="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" s="">

4. Rasprava

U sadašnjem modelu štakora 5/6 nefrektomije CKD,bubregfunkcijapokazatelji (Scr, BUN i proteini u urinu) su značajno povećani, pojavila se zaostala bubrežna hipertrofija i patološko oštećenje bubrega, praćeno promjenom hematoloških parametara. Ovi su podaci bili u skladu s prethodnim studijama (Garrido et al., 2015., Morton & Griffiths, 1985.). Gore navedeni pokazatelji pokazali su da je CKD-anemija štakora izazvana 5/6 nefrektomijom uspješno utvrđena i da se može potvrditi koristan učinak JP-a u liječenju CKD-anemije štakora. sbubregfunkcijadodatno pogoršala, anemija je prepoznata kao poznata oportunistička komplikacija KBB-a, koja je negativno utjecala na kvalitetu života bolesnika (Locatelli, Fishbane, Block i Macdougall, 2017.). Razumijevanje čimbenika rizika povezanih s napredovanjem bubrežne anemije pomoći će u razvoju terapijskih pristupa. U današnje vrijeme veza između bolesti i metabolizma crijevne mikrobiote privlači sve više pozornosti, dok je veza između SCFA i bubrežne anemije još uvijek manje poznata. SCFA, koje uglavnom metaboliziraju Clostridium, Coprococcus i Bacteroides (Koh et al., 2016.), ciljaju specifične receptore vezane na membranu, koji igraju važnu ulogu u održavanju ravnoteže crijevnog okoliša i zdravlja cijelog tijela. Već je dokazano da SCFA imaju neraskidivu vezu s kroničnom bubrežnom bolesti, a razine octene kiseline, propionske kiseline i maslačne kiseline smanjene su u kroničnoj bubrežnoj bolesti (Wang et al., 2019). U štakora s kroničnom bubrežnom bolesti izazvanom adeninom, brojnost i raznolikost crijevne mikrobiote značajno su se promijenile, a tvrtke su smanjile razinu propanske kiseline, maslačne kiseline i valerijanske kiseline (Lakshmanan, Al, Ali i Terranegra, 2021.). Na temelju naše prethodne studije, sekvencioniranje 16S rDNA pokazalo je da je disbioza crijevne mikrobiote prikazana u 5/6 štakora izazvanih kroničnom bubrežnom bolesti (CKD) u usporedbi s lažnom skupinom. Neki od SCFA koji proizvode rodove, posebno maslačnu kiselinu iz Clostridium, Coprococcus, pokazali su razlike u štakora s kroničnom bubrežnom bolesti (Zheng et al., 2020.). U skladu s tim, naši su rezultati pokazali da su količine octene kiseline, propionske kiseline, maslačne kiseline, valerijanske kiseline smanjene za oko 60 posto, 80 posto, 85 posto i 60 posto u štakora s KBB-om, što ukazuje da smanjenje SCFA odgovara s neravnotežom crijevne okoline. Valja napomenuti da je poremećaj crijevne okoline izazvan KBB-om pokrenuo abnormalni metabolizam crijevne mikrobiote (Feng i sur., 2019.). Osim toga, otkrili smo da je kod štakora s kroničnom bubrežnom bolesti smanjena razina osam vrsta SCFA. Na primjer, abnormalnost krajnjih produkata metabolizma, tj. SCFA može biti rezultat progresije CKD.

Polisaharidi, jedan od aktivnih sastojaka, pronađeni su u raznim biljkama, kao što su Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix i Jujubae Fructus. Polisaharide može fermentirati i razgraditi crijevna mikrobiota. Kao rezultat toga, polisaharidi se predstavljaju kao supstrat za crijevnu mikrobiotu za metaboliziranje u SCFA ili se smatra da imaju učinak sličan prebioticima za poboljšanje sastava crijevne mikrobiote kako bi se olakšala proizvodnja SCFA (Cai et al., 2019). U ovoj studiji, naša su otkrića otkrila da polisaharidi iz žižule stimuliraju oslobađanje SCFA iz crijevne mikrobiote, kao što su octena kiselina, propanska kiselina, izomaslačna kiselina, 2-metilmaslačna kiselina u štakora s KBB-om. Nadalje, nakon tretmana JP, razina SCFAs u bubrezima štakora oboljelih od CKD-anemije je poboljšana, a tendencija promjene bila je u skladu s fekalnim uzorkom. Na temelju postojećeg istraživanja, odnos između SCFA i kronične bubrežne bolesti postupno je postao jasan. Na primjer, objavljeno je da octena kiselina modulira imunološki sustav i ublažava akutne bolestibubregozljedainhibicijom signalizacije NADPH oksidaze u T stanicama (Al-Harbi i sur., 2018.). Dokazano je da propanska kiselina sprječava napredovanje adeninom izazvane kronične bolesti bubrega putem receptora 2 za slobodnu masnu kiselinu (FFA2) i FFA3 (Mikami et al., 2020.). Stoga smo zaključili da je ponovno postizanje razine SCFA u bubregu bilo korisno za oboljeli bubreg. Zabilježeno je da je JP povećao raznolikost crijevne mikrobiote i povećao relativnu brojnost aktivne mikrobiote SCFA (Bacteroides) kod miševa raka debelog crijeva (Ji et al., 2020.). Osim toga, JP je povećao koncentraciju ukupnih SCFA u fekalnim uzorcima (Ji i sur., 2019.). Stoga smo zaključili da JP može stimulirati proizvodnju SCFA kako bi se postigla svrha usporavanja napredovanja CKD-a. JP bi također mogao biti metabolički supstrat za dominantnu mikrobiotu SCFA za stimulaciju proizvodnje SCFA u CKD-u, ili komponenta slična prebiotiku za obnovu crijevnog okoliša, posebno raznolikost mikrobiote dominantne SCFA, i daljnje promicanje oslobađanja SCFA, kako bi se spriječiti progresiju CKD.

Općenito, SCFA (bez ugljika od 6) male molekularne težine i visoke kemijske polarnosti teško je analizirati izravno kromatografskim pristupima. Strategija kemijske derivatizacije SCFA s obilježenim izotopom mogla bi poboljšati osjetljivost instrumenta i smanjiti pogreške analize, što je pružilo korisnu strategiju za određivanje SCFA u LC-MS/MS analizi (Higashi & Ogawa, 2016.). Nedavno su se pristupi obilježeni dansil hidrazinom na zadovoljavajući način koristili u otkrivanju ciljnih metabolita ljudske plazme koji sadrže karboksilnu kiselinu (Chen & Zhang, 2020.). U prilog tome, u ovoj smo studiji dalje razvili kemijsku derivatizaciju temeljenu na LC-MS/MS pristupu za određivanje 8 SCFA u izmetu štakora. SCFA proizvodi crijevna mikrobiota, a gotovo 10 posto SCFA izlučuje se izmetom (Boets et al., 2015.). Stoga analiza fekalnog uzorka SCFA može izravno odražavati promjene u crijevnom okolišu i ima veću referenciju u multi-omičkoj zajedničkoj analizi između SCFA i crijevne mikrobiote. Značajno, validacijom nestabilnosti, otkrili smo da su SCFA obilježene dansil hidrazinom nestabilne na sobnoj temperaturi, a njihov intenzitet na spektru mase pokazao je tendenciju pada s vremenom, ali je mogao ostati stabilan 48 h na 4 ◦C. Stoga, nakon derivatizacije SCFA, analite treba držati na 4 ◦C prije analize.

U uznapredovalim stadijima KBB-a 4-5, nedostatak proizvodnje EPO-a ograničava eritropoezu, što pridonosi najkritičnijem čimbeniku u razvoju bubrežne anemije (Sakashita, Tanaka i Nangaku, 2019.). Smjernice kliničke prakse predlažu rutinsko liječenje anemije lijekovima za stimulaciju eritropoeze (ESA). Međutim, sigurnost ESA-a koja je povezana s povećanim rizikom od smrti i kardiovaskularnih događaja mora biti zabrinuta (Thavarajah & Choi, 2019.). U bolesnika s bubrežnom anemijom ekspresija EPO-a trebala je biti dosljedna ili vidljivo povišena u usporedbi sa zdravim tijelima (Babitt & Lin, 2012.). U ranoj fazi, razina EPO-a predstavljala je trend nadogradnje, dok je u kasnoj fazi, razina EPO-a pokazala trend pada u usporedbi s ranom fazom, čak nižu od normalne (Panjeta, Tahirović, Sofi's, ´ Cori's, & Derviˇsevi ´c, 2017). U skladu s prethodnim eksperimentima (Chen i sur., 2019.; Wang i sur., 2020.), naši su rezultati pokazali da je razina EPO u serumu smanjena u štakora s kroničnom bubrežnom bolesti (CKD-anemija). Otkrili smo bubrežnu EPO mRNA i razinu proteina u CKD štakora, a razina bubrežnog EPO proteina bila je neznatno smanjena u usporedbi s lažnom grupom, dok je bubrežna EPO mRNA količina degradirana i njezin je stupanj bio veći od razine EPO u serumu. Bubrezi su primarni izvor sinteze EPO u odraslih i pacijenata s ERSD-om.bubregajoš uvijek zadržava sposobnost stvaranja eritropoetina (Bernhardt i sur., 2010.). Kako bi se korigirala razina endogenog serumskog EPO i prilagodila bubrežnoj anemiji, aktivirana je proizvodnja EPO u bubrezima, iakobubregozljedasmanjena ekspresija EPO mRNA (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Nakon tretmana JP, razina EPO u serumu je bila povećana, kao i razina mRNA EPO bubrega i proteina su poboljšane. U našoj prethodnoj studiji, JP je mogao stimulirati HRE transkripcijsku aktivnost i poboljšati EPO gen (Chen et al., 2014). Stoga smo nagađali da bi JP mogao vratiti razinu EPO u serumu štakora s kroničnom bolesti bolesti bubrega na reguliranu bubrežnu anemiju, čemu može pridonijeti stimulirana ekspresija EPO gena bubrega na razini mRNA.

U korteksu je HIF-1 pronađen uglavnom u tubularnom, a HIF-2 u bubrežnom intersticiju. Budući da EPO uglavnom proizvode fibroblasti u kojima je HIF-2 kolociran, to potvrđuje da bi HIF-2 mogao biti odgovoran za regulaciju proizvodnje EPO (Maxwell, 2003.). U našoj smo studiji otkrili da se HIF-1 i HIF-2 mogu aktivirati CKD-om, a liječenje JP-om može stimulirati aktivnost HIF-1 i HIF-2 u usporedbi sa štakorima CKD-a . Dokazano je da HIF-2 ima glavnu ulogu u regulaciji proizvodnje EPO (Kapitsinou et al., 2010.), dok pojačana regulacija HIF-1 može imati učinak zaštite bubrega u bubrezima (Jiang et al. al., 2020.), što neizravno poboljšava proizvodnju EPO. Proizvodnja EPO u bubrezima prvo je regulirana na razini mRNA, pod anemijom ili hipoksijom, ekspresija EPO mRNA mogla se povećati stimulacijom HIF proteina. Prethodno su farmakološka istraživanja pokazala da žižula stimulira ekspresiju EPO putem regulacije razine HIF-proteina u staničnom modelu (Chen i sur., 2014., Lam i sur., 2016.). Stoga smo zaključili da JP može povećati ekspresiju EPO mRNA putem HIF-proteina kako bi se postigla svrha ublažavanja bubrežne anemije.

Nadalje, na temelju trenutnih rezultata, nagađamo da bi smanjenje SCFA moglo imati ključnu ulogu u ekspresiji EPO posredovanoj HIF-om, što pridonosi KBB-anemiji. U suprotnosti s ovim, ilustrirano je da je povećana razina octene kiseline bila korisna za acetilaciju HIF-2 i stvaranje kompleksa CREB-vezujući protein-HIF 2, te dodatno inducirala ekspresiju EPO (Xu et al., 2014.). Propionska kiselina ublažila je poremećaj mitohondrija, apoptozu hipokampusa i neurološke nedostatke putem HIF-1 /ERK puta (Cheng et al., 2019.). Dodatno, otkriveno je da maslačna kiselina stabilizira HIF-1, aktivne HIF ciljne gene na stanicama debelog crijeva i ublažava upalni odgovor debelog crijeva (Kelly et al., 2015.). U našoj smo studiji otkrili da su razine octene kiseline, propanske kiseline i maslačne kiseline značajno smanjene popraćene abnormalnom ekspresijom proteina HIF-a kod štakora s kroničnom bubrežnom bolesti, što ukazuje da bi stabilnost HIF-a mogla biti povezana sa smanjenjem SCFA, a SCFA bi mogli imati učinak stabilizacije HIF-a za regulaciju ekspresije EPO.

5. Zaključci

Zaključno, dokazali smo da je JP poboljšao CKD i s njim povezanu anemiju, čiji je mehanizam bio uključen u regulaciju oslobađanja SCFA i proizvodnju EPO. A JP bi mogao biti bioaktivni sastojak žižule za liječenje anemije. Ovi nalazi mogu pružiti dokaze za daljnji razvoj JP kao dodataka prehrani za liječenje anemije povezane s CKD-om.

Etička izjava

Svi pokusi na životinjama u našem istraživanju provedeni su prema protokolima koje je odobrio Etički odbor Sveučilišta kineske medicine Guangzhou i u skladu sa Smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje za brigu i korištenje laboratorijskih životinja (NIH publikacije br. 80-23, revidirano 1996). U našem istraživanju nema kršenja gore navedenih smjernica.

Priznanja

Ovaj rad podupiru Zaklada za prirodne znanosti provincije Guangdong (2018A030313305), Zaklada za prirodne znanosti Kine (81804052, 81973577 i 82004248), Shenzhen Science and Technology Plan Project (JSGG20191129102216637 i ZDSYS201606081515458), Burdong Traditional Chinese Provine Medicine 20201320).

Reference

Al-Harbi, NO, Nadeem, A., Ahmad, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA, … Ibrahim, KE (2018). Masna kiselina kratkog lanca, acetat, ublažava akutne sepse izazvanebubregozljedainhibicijom signalizacije NADPH oksidaze u T stanicama. Međunarodna imunofarmakologija, 58, 24–31.
Babitt, JL, i Lin, HY (2012). Mehanizmi anemije u CKD. Časopis Američkog društva za nefrologiju, 23(10), 1631–1634.
Bernhardt, WM, Wiesener, MS, Scigalla, P., Chou, J., Schmieder, RE, Günzler, V., …Eckardt, KU (2010.). Inhibicija prolil hidroksilaza povećava proizvodnju eritropoetina u ESRD. Journal of the American Society of Nephrology, 21(12),
2151–2156.
Boets, E., Deroover, L., Houben, E., Vermeulen, K., Gomand, SV, Delcour, JA, … Verbeke, K. (2015.). Kvantifikacija in vivo proizvodnje masnih kiselina kratkog lanca debelog crijeva iz inulina. Hranjive tvari, 7 (11), 8916–8929.

Cai, Y., Liu, W., Lin, Y., Zhang, S., Zou, B., Xiao, D., … Xie, Z. (2019.). Složeni polisaharidi ublažavaju eksperimentalni kolitis modulacijom sastava i funkcije crijevne mikrobiote. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 34(9),1554–1562.

Chen, G. i Zhang, Q. (2020). Simultana kvantifikacija slobodnih masnih kiselina i acilkarnitina u uzorcima plazme korištenjem dansilhidrazinskog obilježavanja i tekućinske kromatografije – trostruka kvadrupolna masena spektrometrija. Analitički i bioanalitičkiKemija, 412(12), 2841–2849.

Chen, J., Lam, CT, Kong, AY, Zhang, WL, Zhan, JY, Bi, CW, … Tsim, KW (2014.). Ekstrakt ploda Ziziphus jujuba (žižule) inducira ekspresiju eritropoetina putem faktora inducibilnog hipoksije-1 u uzgojenim stanicama Hep3B. PlantaMedica, 80(17), 1622–1627.

Chen, J., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Li, Z., Qi, A., … Li, S. (2019.). Uvarak Jian-Pi-Yi-Shen ublažava bubrežnu anemiju u 5/6 nefrektomiranih štakora: Proizvodnja eritropoetina putem signalizacije čimbenika induciranog hipoksijom. Komplementarna i alternativna medicina utemeljena na dokazima, 2019., 1–8.
Cheng, Y., Mai, Q., Zeng, X., Wang, H., Xiao, Y., Tang, L., … Ding, H. (2019). Propionat ublažava napadaje izazvane pentilentetrazolom, posljedični poremećaj mitohondrija, nekrozu neurona i neurološke nedostatke kod miševa. Biokemijska farmakologija, 169, članak 113607.
Feng, YL, Cao, G., Chen, DQ, Vaziri, ND, Chen, L., Zhang, J., … Zhao, YY (2019.). Metabolomika mikrobioma otkriva crijevnu mikrobiotu povezanu s metabolitima konjugiranim glicinom i metabolizmom poliamina u kroničnoj bolesti bubrega. Cellular and Molecular Life Sciences, 76(24), 4961–4978.
Garrido, P., Ribeiro, S., Fernandes, J., Vala, H., Bronze-da-Rocha, E., Rocha-Pereira, P., … Reis, F. (2015.). Dismetabolizam željeza i hepcidina, anemija i hipoksija bubrega, upala i fibroza u modelu ostatka bubrega štakora. PLoS ONE, 10(4), članak e124048.
Higashi, T. i Ogawa, S. (2016). Izotopski kodirani ESI-poboljšani derivatizacijski reagensi za diferencijalnu analizu, kvantifikaciju i profiliranje metabolita u biološkim uzorcima pomoću LC/MS: pregled. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 130, 181–193.
Ji, X., Hou, C., Gao, Y., Xue, Y., Yan, Y. i Guo, X. (2020.). Metagenomska analiza modulatornih učinaka polisaharida žižule (Ziziphus jujuba Mill.) na crijevnu mikrobiotu u mišjem modelu raka debelog crijeva. Hrana i funkcija, 11 (1), 163–173.
Ji, X., Hou, C., Yan, Y., Shi, M. i Liu, Y. (2020.). Usporedba strukturne karakterizacije i antioksidativnog djelovanja polisaharida iz ploda žižule (Ziziphus jujuba Mill.). Međunarodni časopis za biološke makromolekule, 149, 1008–1018.

Ji, X., Hou, C., Zhang, X., Han, L., Yin, S., Peng, Q., … Wang, M. (2019.). Mikrobiomemetabolomska analiza utjecaja Zizyphus jujuba cv. Konzumacija Muzao polisaharida na fekalnoj mikrobioti i metabolitima miševa raka debelog crijeva.Međunarodni časopis za biološke makromolekule, 131, 1067–1076.

Ji, X., Peng, Q., Yuan, Y., Shen, J., Xie, X., i Wang, M. (2017.). Izolacija, strukture i bioaktivnost polisaharida iz ploda žižule (Ziziphus jujuba Mill.): Pregled. Kemija hrane, 227, 349–357.
Jiang, N., Zhao, H., Han, Y., Li, L., Xiong, S., Zeng, L., … Sun, L. (2020.). HIF-1 ublažava ozljedu tubula kod dijabetičke nefropatije preko HO-1-posredovane kontrole mitohondrijske dinamike. Proliferacija stanica, 53(11), članak e12909.
Kapitsinou, PP, Liu, Q., Unger, TL, Rha, J., Davidoff, O., Keith, B., … Haase, VH (2010.). Jetreni HIF-2 regulira eritropoetske odgovore na hipoksiju kod bubrežne anemije. Krv, 116(16), 3039–3048.
Kelly, CJ, Zheng, L., Campbell, EL, Saeedi, B., Scholz, CC, Bayless, AJ, … Colgan, SP (2015.). Preslušavanje između kratkolančanih masnih kiselina izvedenih iz mikrobiote i intestinalnog epitelnog HIF-a povećava funkciju tkivne barijere. Cell Host & Microbe, 17 (5), 662–671.
Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P. i B¨ ackhed, F. (2016.). Od dijetalnih vlakana do fiziologije domaćina: masne kiseline kratkog lanca kao ključni bakterijski metaboliti. Ćelija, 165(6), 1332–1345.
Lakshmanan, AP, Al, ZM, Ali, BH i Terranegra, A. (2021). Utjecaj prebiotika gume akacije na sastav crijevnog mikrobioma u štakora s eksperimentalnom kroničnom bubrežnom bolešću. Biomedicina & Pharmacotherapy, 133, Članak
110992.
Lam, C., Chan, PH, Lee, P., Lau, KM, Kong, A., Gong, A., … Tsim, K. (2016.). Kemijska i biološka procjena biljnih dekokata koji sadrže žižulu (Ziziphus jujuba): Indukcija ekspresije eritropoetina u kulturama. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1026, 254–262.
Lappin, TR i Lee, FS (2019). Najnovije informacije o mutacijama u HIF: EPO putu i njihovoj ulozi u eritrocitozi. Pregledi krvi, 37, članak 100590.
LeBlanc, JG, Chain, F., Martín, R., Bermúdez-Humaran, ´ LG, Courau, S. i Langella, P. (2017.). Blagotvorni učinci kratkolančanih masnih kiselina i vitamina koje proizvode komenzalne i probiotičke bakterije na energetski metabolizam domaćina. Tvornice mikrobnih stanica, 16 (1), 79.
Li, L., Ma, L. i Fu, P. (2017.). Kratkolančane masne kiseline izvedene iz crijevne mikrobiote i bolesti bubrega. Razvoj dizajna lijekova i terapija, 11, 3531–3542.
Li, L. i Shi, JY (2013). Analiza polisaharidnih i lipidnih komponenti kore cimeta GC-MS. Zhong Yao Cai, 36(4), 578–580.
Liu, G., Liu, X., Zhang, Y., Zhang, F., Wei, T., Yang, M., … Zhao, Z. (2015.). Hepatoprotektivni učinci polisaharida ekstrahiranih iz Zizyphus žižule cv. Huanghetanzao. Međunarodni časopis za biološke makromolekule, 76, 169–175.

Locatelli, F., Fishbane, S., Block, GA i Macdougall, IC (2017.). Usmjeravanje na čimbenike koji izazivaju hipoksiju za liječenje anemije u bolesnika s kroničnom bubrežnom bolešću. American Journal of Nephrology, 45(3), 187–199.

Locatelli, F., Hannedouche, T., Fishbane, S., Morgan, Z., Oguey, D. i White, WB (2019.). Kardiovaskularna sigurnost i smrtnost od svih uzroka metoksi polietilena

Glikol-epoetin beta i drugi agensi za stimulaciju eritropoeze u anemiji CKD: randomizirano ispitivanje neinferiornosti. Klinički časopis Američkog društva za nefrologiju: CJASN, 14(12), 1701–1710.
Maxwell, P. (2003). HIF-1: Sustav reakcije kisika od posebne važnosti za bubrege. Časopis Američkog društva za nefrologiju, 14(11), 2712–2722.
Meijers, BK i Evenepoel, P. (2011). Os crijevo-bubreg: indoksil sulfat, p-krezil sulfat i progresija CKD. Nephrology Dialysis Transplantation, 26(3), 759–761.
Mikami, D., Kobayashi, M., Uwada, J., Yazawa, T., Kamiyama, K., Nishimori, K., … Iwano, M. (2020.). Kratkolančana masna kiselina ublažava kroničnu bubrežnu bolest izazvanu adeninom putem FFA2 i FFA3 puteva. Biochimica Biophysica Acta-Molekularna i stanična biologija lipida, 1865(6), članak 158666.
Morton, DB i Griffiths, PH (1985). Smjernice za prepoznavanje boli, distresa i nelagode u pokusnih životinja i hipoteza za procjenu. Veterinarski zapisnik, 116(16), 431–436.
Panjeta, M., Tahirović, I., Sofijić, E., Cori ´ ´c, J., & Dervišević, A. (2017). Interpretacija razine eritropoetina i hemoglobina u bolesnika s različitim stadijima kronične bubrežne bolesti. Journal of Medical Biochemistry, 36(2), 145–152.
Pappa, M., Dounousi, E., Duni, A. i Katopodis, K. (2015.). Manje poznati patofiziološki mehanizmi anemije u bolesnika s dijabetičkom nefropatijom. Međunarodna urologija i nefrologija, 47(8), 1365–1372.
Sakashita, M., Tanaka, T. i Nangaku, M. (2019). Inhibitori domene faktora inducibilnog hipoksije prolil hidroksilaze za liječenje anemije kod kronične bolesti bubrega. Prilozi za nefrologiju, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel, ¨ J. i Ratcliffe, PJ (2019). Mehanizmi signaliziranja hipoksije: Nove implikacije za nefrologiju. Nature Reviews Nephrology, 15(10), 641–659.
Tako, E., Glahn, RP, Knez, M. i Stangoulis, JC (2014.). Učinak prebiotika pšenice na populaciju crijevnih bakterija i status željeza u tovnih pilića s nedostatkom željeza. Nutricionistički časopis, 13, 58.
Tang, WH, Wang, Z., Kennedy, DJ, Wu, Y., Buffa, JA, Agatisa-Boyle, B., … Hazen, SL (2015.). Put trimetilamin N-oksida (TMAO) ovisan o crijevnoj mikrobioti doprinosi i razvoju bubrežne insuficijencije i riziku smrtnosti kod kronične bolesti bubrega. Istraživanja cirkulacije, 116(3), 448–455.
Thavarajah, S. i Choi, MJ (2019). Primjena sredstava za stimulaciju eritropoeze u bolesnika s CKD i rakom: klinički pristup. American Journal of Kidney Diseases, 74(5), 667–674.
Wang, F., Yu, H., Huang, S., Zheng, L., Zheng, P., Zhang, S., … Chen, J. (2020.). Jian-PiYi-Shen regulira EPO i ekspresiju proteina za recikliranje željeza u anemičnih štakora s kroničnom bolešću bubrega: Akumulacija faktora inducibilnog hipoksije-2 putem ERK signalizacije. Komplementarna i alternativna medicina utemeljena na dokazima, 2020., 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F., … Chen, Y. (2019). Kvantitativno smanjenje kratkolančanih masnih kiselina, posebice butirata, pridonosi progresiji kronične bubrežne bolesti. Clinical Science, 133(17), 1857–1870.
Webster, AC, Nagler, EV, Morton, RL i Masson, P. (2017.). Kronična bolest bubrega. Lancet (London, Engleska), 389(10075), 1238–1252.
Xie, X., Yang, X., Wu, J., Ma, J., Wei, W., Fei, X., … Wang, M. (2020.). Trib1 doprinosi oporavku od akutne ozljede bubrega izazvane ishemijom/reperfuzijom reguliranjem polarizacije bubrežnih makrofaga. Frontiers in Immunology, 11, 473.
Xu, M., Nagati, JS, Xie, J., Li, J., Walters, H., Moon, YA, … Garcia, JA (2014.). Acetatni prekidač regulira stresnu eritropoezu. Nature Medicine, 20(9), 1018–1026.
Yue, Y., Wu, S., Li, Z., Li, J., Li, X., Xiang, J., … Ding, H. (2015.). Polisaharidi divlje žižule štite od eksperimentalne upalne bolesti crijeva omogućujući poboljšanu funkciju crijevne barijere. Hrana i funkcija, 6(8), 2568–2577.

Zhao, S. i Li, L. (2018). Označavanje izotopa dansilhidrazina LC-MS za sveobuhvatno profiliranje submetaboloma karboksilne kiseline. Analitička kemija, 90(22), 13514–13522.

Zheng, L., Chen, S., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Yang, X., … Chen, J. (2020.). Izraziti odgovori crijevne mikrobiote na dekokciju Jian-Pi-Yi-Shen povezani su s poboljšanim kliničkim ishodima u 5/6 nefrektomiranih štakora. Frontiers in Pharmacology, 11, 604.