Istraživanje učinka hipertireoze na stres endoplazmatskog retikuluma i prolazni receptorski potencijal Canonical 1 Channel u bubregu

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Nuriye Ezgi BEKTUR AYKANAT^1,*,Erhan ŞAHİN², Sedat KAČAR², Rıdvan BAĞCI³Şerife KARAKAYA²,Dilek BURUKOĞLU DÖNMEZ², Varol ŞAHİNTÜRK²

¹Odjel za histologiju i embriologiju, Medicinski fakultet, Sveučilište Atılım, Ankara, Turska²Odjel za histologiju i embriologiju, Medicinski fakultet, Sveučilište Osmangazi, Ankara, Turska ³Odjel IVF jedinice Androloški laboratorij, Adana City Education and Research Hospital, Adana, Turska

Pozadina/cilj:Hipertireozaje povezan s rezultatima u povećanoj brzini glomerularne filtracije, kao i povećanoj aktivaciji renin-angiotenzin-aldosterona. Poremećaj homeostaze Ca2 plus u endoplazmatskom retikulumu (ER) povezan je s mnogim bolestima, uključujući dijabetičku nefropatiju ihipertireoza. Kanonski 1 (TRPC1) kanal prijelaznog receptorskog potencijala prvi je klonirani protein obitelji TRPC. Iako je izražena na mnogim mjestima ububreg, njegova je funkcija neizvjesna. TRPC1 je uključen u regulaciju Ca2 plus homeostaze, a njegova regulacija povećava razinu ER Ca2 plus, aktivira nesmotani proteinski odgovor, što dovodi do oštećenja stanica ububreg. Ova studija istraživala je ulogu TRPC1 ububregahipertiroidnih štakora u smislu ER markera stresa koji su glukozom regulirani protein 78 (GRP78), aktivirajući faktor transkripcije 6 (ATF6), (protein kinaza R (PKR)-slična endoplazmatskom retikulum kinaza) (PERK), enzim 1 koji zahtijeva inozitol (IRE1).

Materijali i metode: Dvadeset mužjaka štakora raspoređeno je u kontrolnu i hipertireoidnu skupinu (n=10).Hipertireozainduciran je dodavanjem 12 mg/L tiroksina u vodu za piće štakora tijekom 4 tjedna. Mjereni su T3 i T4 bez seruma (fT3, fT4), TSH, dušik uree u krvi (BUN) i kreatinin. Histokemijska analizabubregpresjeci za morfološke promjene te također imunohistokemijska i western blot analiza isječaka bubrega obavljene su na antitijela GRP78, ATF6, PERK, IRE1, TRPC1.

Rezultati: razine TSH, BUN i kreatinina su se smanjile dok su razine fT3 i fT4 porasle kod štakora s hipertireozom. Morfološka analiza rezultirala je zadebljanjem bazalne membrane kapilara u glomerulima i također Western blotom, a imunohistokemijski rezultati pokazali su povećanje TRPC1, GRP78 i ATF6 u hipertireoidnog štakora (p <>

Zaključak: Zaključno, u našoj smo studiji po prvi put pokazali da je odnos između ER stresa i TRPC1, te njihove povećane ekspresije uzrokovao oštećenje bubrega kod hipertireoidnih štakora.

Ključne riječi:Hipertireoza, stres endoplazmatskog retikuluma (ER), kanonski prolazni receptorski potencijal 1 (TRPC1),bubreg, štakor

1. Uvod

Trijodtironin (T3) i tiroksin (T4) su hormoni štitnjače neophodni za normalan razvoj organa i metaboličke funkcije [1]. Osim toga, reguliraju brzinu rasta, funkciju natrijeve/kalijeve pumpe, rad srca, krvni tlak, disanje, potrošnju kisika, probavu, metabolizam lipida, ugljikohidrata i proteina, funkciju središnjeg živčanog sustava, pokrete i metaboličke funkcije drugih endokrinih žlijezda [2] .

Hipertireozaima mnoge učinke na kolesterol, trigliceride, lipide, oksidaciju, antioksidanse, malondialdehid (MDA), enzim katalizator katalazu (CAT), enzime jetre, mokraćnu kiselinu, ureu, kreatinin i histopatološke promjene u jetri i bubrezima [3]. Disfunkcija štitnjače utječe na fiziologiju i razvoj bubrega. U slučaju hipotireoze kod koje štitnjača slabije radi smanjuje se bubrežna masa (omjer bubrezi/tjelesna masa), dok kodhipertireozakod kojih žlijezda intenzivno radi, povećava se bubrežna masa [4]. Međutim, teška hipertireoza rezultira razgradnjom proteina i konačno atrofijom bubrega. Hipertireoza uzrokuje povećanje bubrežnog krvotoka (RBF) i brzine glomerularne filtracije (GFR) [5]. Kod hipertireoze povećana je reapsorpcija natrija u proksimalnom tubulu, bazolateralna aktivacija Na plus /K plus ATPaze [6], apikalnog Na plus /H plus modifikatora [7] i Na plus /Pi kotransportera [8]. Također, hormon štitnjače aktivira Na plus /Ca2 plus modifikator, vjerojatno putem cAMP-povezanog puta, čime se povećava apsorpcija kalcija ububrega[9].

Kalcij je sekundarni glasnik koji regulira većinu staničnih funkcija, uključujući ekspresiju gena i staničnu homeostazu [10], otpuštanje neurotransmitera i funkciju neurona [11], metabolizam i modulaciju života stanice [12]. Obitelj kanala prolaznog receptorskog potencijala (TRP) jedna je od najvećih obitelji kationskih kanala. Obitelj TRP podijeljena je na podskupine TRPC (kanonička), TRPM (melastatin), TRPP (policistin), TRPV (vaniloid), TRPML (bukolik), TRPA (ankirin) i TRPN (slično NOMPC-u). Poznato je da TRPC proteini tvore Ca2 plus propusne, neselektivne kationske kanale i stoga igraju važnu ulogu u Ca2 plus prijenosu signala. Obitelj TRPC sisavaca ima sedam članova koji se nazivaju TRPC1-TRPC7 [13]. Članovi TRPC obitelji izraženi su u različitim dijelovimabubreg. TRPC1, koji igra važnu ulogu posebno u dijabetičkoj nefropatiji, izražen je gotovo posvuda, u bubrežnim mezangijskim stanicama, glomerulima, stanicama proksimalnih tubula i u tankom silaznom dijelu Henleove petlje, ali njegova točna funkcija još uvijek nije poznata [14].

Teški Ca2 plus poremećaji mogu izazvati oštećenje stanica uzrokovano stresom endoplazmatskog retikuluma (ER) kao odgovor na različita patološka stanja [5,15]. Poremećaji Ca2 plus homeostaze u ER povezani su s mnogim bolestima [16]. ER je unutarstanična organela koja je važna za regulaciju Ca2 plus homeostaze te sinteze i savijanja proteina. Modulacija ekspresije/funkcije Ca2 plus propusnih kanala također utječe na intracelularne Ca2 plus koncentracije i posljedično Ca2 plus povezane procese kao što su stanična proliferacija, ER stres, apoptoza i autofagija. ER stres je stanje koje remeti redoks ravnotežu i luminalnu Ca2 plus homeostazu, uzrokujući nakupljanje nesamotanih/pogrešno savijenih proteina. Aktivacija odgovora nesavijenog proteina (UPR) uzrokuje povećanje glukozom reguliranog proteina 78 (GRP78), ER šaperona, koji povećava kapacitet savijanja proteina ER [17]. Aktivacija ER stresa pokreće evolucijski očuvani UPR pomoću tri glavna pretvarača signala ER membrane: PERK, IRE1 i ATF6. Stanična disfunkcija i stanična smrt javljaju se u uvjetima u kojima je ER stres kronično produljen i proteinsko opterećenje na ER znatno premašuje. Poznato je da je jedan od puteva koji uzrokuju staničnu smrt uočen u kroničnim bolestima kao što su hipoksija, ishemija/reperfuzijska ozljeda, neurodegeneracija, srčana bolest i dijabetes uzrokovan ER stresom [12].

U svjetlu svih ovih informacija, cilj nam je bio istražiti odnos između putova transdukcije signala TRPC1 i ER-stresa ububrega, koji su općenito pogođeni uhipertireoza.

Kliknite zaCistanche se koristi za simptome bolesti bubrega

2. Materijali i metode

2.1. Životinje

Našu studiju odobrio je lokalni Etički odbor za životinje Sveučilišta Eskişehir Osmangazi (odluka br. 634 na sastanku br. 117 od 30.11.2017.) i slijedila je Vodič za njegu i korištenje laboratorijskih životinja koji su objavili Nacionalni instituti za zdravlje. Dvadeset odraslih (7-8 tjedana starih) Wistar albino muških štakora, dobivenih iz Medicinskog i kirurškog eksperimentalnog istraživačkog centra (TICAM), držano je na 24 ± 2 stupnja i 55 ± 5 posto vlažnosti 12 sati u svijetlom/mračnom okruženju tijekom eksperiment, pokus. Životinje su stavljene u polikarbonatne kaveze 2 tjedna prije eksperimenta i ostavljene su da se prilagode na uvjete okoline, a zatim su nasumično raspoređene u kontrolnu i hipertiroidnu skupinu. Kontrolna skupina (eutireoidna) tijekom eksperimenta hranjena je standardnom hranom za štakore i vodom iz slavine. Skupina s hipertireozom uspostavljena je standardnom hranom za štakore tijekom 4 tjedna i pitkom vodom iz slavine koja je sadržavala 12 mg/L tiroksina [18]. Na kraju četvrtog tjedna štakori su eutanazirani intramuskularnom injekcijom ketamina (45 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg). Svim su životinjama odmah uzeti uzorci intrakardijalne krvi. Cijelibubregauklonjeni su postupkom nefrektomije. Zatim, desno i lijevobubregaštakora izrezani su uzdužno na dva dijela. Komadići desnog i lijevog bubrega korišteni su za Western blot analizu i svjetlosnu mikroskopsku analizu

2.2. Biokemijske analize

Uzorci krvi su centrifugirani na 11,000 okretaja u minuti 10 minuta. Serumi su stavljeni u epruvete i pohranjeni na -80 stupnjeva do dana analize. Zatim su mjerene razine T3 bez seruma (fT3), slobodnog T4 (fT4) i hormona koji stimulira štitnjaču (TSH) pomoću ELISA tehnike prema protokolu proizvođača. Razine ekspresije optičke gustoće (OD) očitane su na 450 nm BioTek čitačem mikropločica 800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, SAD), a zatim su rezultati izračunati. Komercijalni setovi za fT3 (YLA0127RA), fT4 (YLA0239RA) i TSH (YLA0047RA) kupljeni su od Shanghai YL Biotech, Kina. Također, mjerene su razine ureje u serumu (BUN) i kreatinina metodom fotometrije apsorbancije Cobas Integra 400 Plus Roche (Roche Diagnostics Ltd., Švicarska).

2.3. Histološka procjena

Bubregkomadići uzeti za ispitivanje na razini svjetlosnog mikroskopa fiksirani su u 10 posto formaldehida 48 h. Nakon rutinske obrade tkiva dobiveni su parafinski blokovi. Zatim su uzeti serijski isječci od 5 µm i obojeni tehnikom Periodna kiselina–Schiff (PAS). Provedena je mikroskopska procjena glomerula i tubula pod mikroskopom Olympus BX-51 (Olympus America, Inc., New York, SAD). Sekcije su bodovane na slijepi, polukvantitativni način korištenjem utvrđene skale bodovanja. Za svakog štakora u skupinama ispitano je najmanje 10 polja velike snage (×1000). Postotak glomerula koji su pokazali zadebljanje bazalne membrane glomerula ocijenjen je na sljedeći način: 0=ništa, 1 manje ili jednako 25 posto, 2=25 posto do 50 posto, 3 =50 posto do 75 posto , 4 Veći ili jednak 75 posto [19]. Debljina glomerularne bazalne membrane (µm) mjerena je softverom za mikroskop ZEISS ZEN 3.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH ZEISS Group, München, Njemačka).

2.4. Imunohistokemijska evaluacija

Odsjeci parafinskog bloka od svakogbubregtkivo je uzeto na pozitivno nabijena stakalca. Nakon deparafinizacije, stakalca su prebačena kroz niz razgrađenog etanola, a zatim ksilola. Sekcije su inkubirane s 3 posto vodikovim peroksidom kako bi se spriječilo djelovanje endogene peroksidaze. Nakon pronalaženja antigena citratnim puferom, sekcije su omeđene papa-olovkom, isprane 3 × 5 minuta fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS), a zatim blokirane Ultra V-blokom 1 sat na sobnoj temperaturi. Sekcije su inkubirane sa zečjim poliklonskim ATF6 protutijelom (ab203119, Abcam Inc., Cambridge, SAD), zečjim poliklonskim IRE1 protutijelom (YID5384, Shanghai YL Biotech Co., Ltd, Kina), mišjim monoklonskim PERK protutijelom (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc. ., Heidelberg, Njemačka) i mišje monoklonsko antitijelo TRPC1 (sc133076, Santa Cruz Biotechnology Inc.) preko noći na plus 4 stupnja u vlažnim uvjetima. Nakon ispiranja 3 x 5 minuta s PBS-om, sekcije su inkubirane s odgovarajućim sekundarnim protutijelima (sc2359, sc2781, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim su ponovno isprani 3 × 5 min s PBS-om i obojeni hematoksilinom. Na stakalce je naneseno pokrovno stakalce korištenjem medija na bazi vode. Mikroskopski pregled obavljen je pomoću mikroskopa Olympus BX51 i računalno potpomognutog sustava za snimanje (Olympus America, Inc., New York, SAD).

Sve imunološki obojene dijelove procijenio je na kodirani način glavni autor, koji nije znao naziv grupe eksperimenata. Ekspresije TRPC1, ATF6, IRE1 i PERK otkrivene su uglavnom u tubulima i/ili glomerulima. Ekspresije su semikvantitativno određene prema postotku pozitivnihbubregodjeljci. Intenzitet bojenja razvrstan je u četiri stupnja: nikakav ({{0}}), slab (1), umjeren (2) i jak (3). Postotak pozitivnih histoloških presjeka bubrega klasificiran je u 4 stupnja: 0 (0 posto), 1 (1 posto –10 posto), 2 (11 posto –49 posto) i 3 (50 posto –100 posto). Ukupni rezultat bio je proizvod dvaju rezultata, a konačni rezultat jednog uzorka bio je srednja vrijednost 10 mikroskopskih polja. TRPC1, ATF6, IE1 i PERK procijenjeni su prema navedenoj metodi [20].

Cistanche-funkcija bubrega

2.5. Western blot analize

Kako bi se utvrdile promjene u količini specifičnog proteina ububregtkiva odhipertireozai kontrolnih skupina, bubrezi su izrezani na male komadiće, a homogenizacija je izvedena dodavanjem pufera za lizu RIPA u epruvete s kuglicama od 2 mL. Nakon homogenizacije, epruvete su inkubirane na 4 stupnja najmanje 30 min, a zatim su tkivni lizati centrifugirani na 4°, 15,000 g 20 min. Supernatant koji je sadržavao ukupni protein prebačen je u novu epruvetu. Određivanje proteina provedeno je iz supernatanta s uređajem Qubit 2.0 (Invitrogen Inc., Waltham, MA, SAD). Pedeset µg proteina stavljeno je u svaku jažicu, podvrgnuto elektroforezi sa SDS-PAGE Bio-Rad MiniTrans Blot (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornija, SAD), a zatim prebačeno na PVDF membranu s Bio-Rad Trans Turbo uređajem. Membrane su blokirane s 5 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim su inkubirane s mišjim monoklonskim GRP78 protutijelom (sc166490, Santa Cruz Biotechnology Inc.), zečjim poliklonskim ATF6 protutijelom (ab203119, Abcam Inc., Cam most, SAD), zečje poliklonsko IRE1 protutijelo (YID5384, Shanghai YL Biotech Co. Ltd., Kina), mišje monoklonsko PERK protutijelo (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc.), mišje monoklonsko TRPC1 protutijelo (sc133076, Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) i mišje monoklonsko antitijelo na aktin (sc47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (za kontrolu punjenja) preko noći na 4 stupnja . Nakon toga, membrane su isprane 3 x 10 min otopinom za pranje (TBST), nakon čega je uslijedila inkubacija s odgovarajućim sekundarnim protutijelima (sc2005, sc2030, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Nakon što su membrane isprane 3 x 10 min s TBST, razine ekspresije proteina u imunoreaktivnim vrpcama praćene su sustavom za snimanje (C-Digit, Licor, Cambridge, UK). Rezultati slika analizirani su programom Image J 1.49v.

2.6. Statistička analiza

Sve statističke analize provedene su s IBM SPSS 21.0 programom statističkog paketa (IBM Corp., Armonk, NY, SAD). Western blot eksperiment ponovljen je tri puta za svaku skupinu. Razina značajnosti prihvaćena je kao p < 0.05.="" za="" određivanje="" normalne="" distribucije="" podataka="" korišten="" je="" shapiro-wilkov="" test.="" test="" homogenosti="" varijance="" (levenov="" test)="" korišten="" je="" za="" procjenu="" imaju="" li="" skupine="" jednake="" varijance.="" proveden="" je="" t-test="" neovisnih="" uzoraka="" za="" podatke="" koji="" pokazuju="" normalnu="" distribuciju.="" mann-whitney="" u="" test="" je="" proveden="" za="" podatke="" koji="" pokazuju="" nenormalnu="">

3. Rezultati

3.1. Biokemijski rezultati

Serumske razine fT3, fT4 i TSH, serumske razine BUN i kreatinina u skupinama štakora prikazane su na slici 1. Rezultati pokazuju da su se razine fT3 i fT4 značajno povećale u skupini s hipertireozom u usporedbi s kontrolnom skupinom (obje p < {{5="" }}.05).="" osim="" toga,="" pronađeno="" je="" značajno="" smanjenje="" razine="" tsh="" u="" skupini="" s="" hipertireozom="" u="" usporedbi="" s="" kontrolnom="" skupinom="" (p="">< 0.05)="" (slika="" 1a).="" razine="" bun="" (slika="" 1b)="" i="" kreatinina="" (slika="" 1c)="" u="" serumu="" značajno="" su="" se="" smanjile="" u="" skupini="" s="" hipertireozom="" u="" usporedbi="" s="" kontrolnom="" skupinom="" (obje="" p=""><>

3.2. Histokemijski rezultati

Histološke promjenebubregaskupina štakora prikazani su na slici 2. Histologija bubrega (glomeruli, tubuli i vaskularne strukture) bila je tipična u kontrolnoj skupini (slika 2A). Međutim,hipertireozauzrokovao je zadebljanje kapilarne bazalne membrane u glomerulu (Slika 2B). Debljina bazalne membrane glomerula značajno se povećala u skupini s hipertireozom u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 3–4), (p < 0.05).="" nije="" bilo="" očite="" razlike="" između="" kontrolne="" i="" hipertireoidne="" skupine="" u="" smislu="" tubularne="">

Slika 1. Razine slobodnog trijodtironina (fT3), slobodnog tiroksina (fT4) i hormona koji stimulira štitnjaču (TSH) u skupinama štakora (a). * Različito od kontrolne skupine (p < 0.05).="" razine="" bun="" (b)="" i="" kreatinina="" (c)="" u="" serumu="" skupina="" štakora.="" *za="" razliku="" od="" kontrolne="" skupine="" (p="">< 0,001),="" proveden="" je="" t-test="" neovisnih="">

Slika 2. Mikrografije odbubregtkiva kontrolne (A) i hipertireoidne (B) skupine. U kontrolnoj skupini vidi se tipična histologija bubrega (A). U skupini hipertireoze,hipertireozauzrokovala zadebljanje kapilarne bazalne membrane u glomerulu. Uočeno je zadebljanje bazalne membrane kapilara u glomerulu (strelica) (B). Nema očitih razlika u srži bubrega u obje skupine štakora. (Periodna kiselina-Schiff (PAS) bojenje). Šipke su 20 µm i 50 µm.

3.3. Imunohistokemijski rezultati

Imunohistokemijske reakcije TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, PERK i njihova ekspresija se semikvantitativno određuju prema postotku pozitivnihbubregaskupina štakora (Slika 5–9). Također, njihova prosječna varijacija prikazana je u tablici. U usporedbi s kontrolnom skupinom, ekspresija proteina TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1 i PERK značajno se povećala u skupini s hipertireozom u glomerulima i tubulima (Slika 5–9) (p < 0,000).="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" je="" trpc1="" izražen="" u="" glomerularnim="" i="" tubularnim="" strukturama="" u="" kontrolnoj="" skupini="" (slika="" 5-1ab),="" a="" njegova="" je="" ekspresija="" bila="" povećana="" u="" skupini="" s="" hipertireozom="" (slika="" 5-2ab).="" grp78="" nije="" bio="" izražen="" u="" kontrolnoj="" skupini="" (slika="" 6-1ab),="" a="" njegova="" pozitivna="" reakcija="" primijećena="" je="" u="" oba="" tubula="" i="" glomerula="" u="" skupini="" s="" hipertireozom="" (slika="" 6-2ab);="" dok="" atf6="" nije="" bio="" izražen="" u="" kontrolnoj="" skupini="" (slika="" 7-1ab),="" njegova="" je="" ekspresija="" reagirala="" pozitivno="" u="" oba="" tubula="" i="" glomerula="" u="" skupini="" s="" hipertireozom="" (slika="" 7-2ab).="" ire1="" nije="" bio="" izražen="" u="" kontrolnoj="" skupini="" (slika="" 8-1ab),="" a="" njegova="" pozitivna="" reakcija="" primijećena="" je="" u="" oba="" tubula="" i="" glomerula="" u="" skupini="" s="" hipertireozom="" (slika="" 8-2ab).="" dok="" perk="" nije="" bio="" izražen="" u="" kontrolnoj="" skupini="" (slika="" 9-1ab),="" ekspresija="" perk-a="" bila="" je="" ograničena="" na="" tubule="" u="" hipertiroidnoj="" skupini="" (slika="">

Slika 3. Usporedba debljine bazalne membrane glomerula između kontrolne i hipertireoidne skupine. *Za razliku od kontrolne skupine (p < 0.05),="" proveden="" je="" t-test="" neovisnih="">

Slika 4. Usporedba bodovanja debljine bazalne membrane glomerula između kontrolne i hipertireoidne skupine. *Za razliku od kontrolne skupine (p < 0.05),="" proveden="" je="" mann–whitney="" u="">

3.4. Rezultati Western blota

Rezultati Western blota (Slika 10) pokazali su statistički značajno povećanje ekspresije TRPC1, PERK, ATF6 i GRP78 u skupini s hipertireozom u usporedbi s kontrolnom skupinom (p < 0.05).="" povećanje="" ire1="" bilo="" je="" statistički="" značajno,="" iako="" ne="" toliko="" kao="" ostale="" razine="" proteina="" (p=""><>Hipertireozaizazvalo povećanje ekspresije GRP78 (2,16 puta), ATF6 (2,82 puta), PERK (1,95 puta), IRE1 (1,60 puta) i TRPC1 (1,53 puta) u usporedbi s kontrolnom skupinom.

4. Rasprava

U ovoj smo studiji prvi put predložili kako bubrežno tkivo utječe nahipertireozau smislu uloge ER stresa i TRPC1 kanala u ovom procesu. U našoj studiji, povećana ekspresija TRPC1 uzrokovala je povećanje koncentracije Ca2 plus u stanici, posebice zadebljanje bazalne membrane kapilara i povećanu ekspresiju GRP78 u tubulima, osobito u glomerulima. Mislimo da ER stres igra aktivnu ulogu u ovom procesu oštećenja stanica, posebno putem ATF6 i PERK signalnog pretvarača u UPR (odmotani proteinski odgovor) putu.

Kao što se vidi u mnogim studijama, kao iu našoj [18], vrijednosti fT3 i fT4 rastu u slučaju hipertireoze, dok se razina TSH smanjuje. Svaki poremećaj u radu štitnjače može utjecati na proizvodnju fT3 i fT4 što se može povezati s različitim patologijama u cijelom tijelu [21]. Thebubregaigraju vitalnu ulogu u izlučivanju otpadnih tvari i toksina kao što su urea, kreatinin i mokraćna kiselina. Procjena bubrežne funkcije važna je u liječenju bolesnika s bubrežnom bolešću ili patologijama koje utječu na bubrežnu funkciju. Testovi bubrežne funkcije korisni su u utvrđivanju prisutnosti bubrežne bolesti, praćenju odgovora bubrega na liječenje i određivanju progresije bubrežne bolesti. Razine serumskog kreatinina smanjuju se kod hipertireoze, ne samo zbog povećanja GFR-a, već i zbog povećanja mišićne destrukcije. Također, smanjenje koncentracije BUN-a uhipertireozasmatra se da je posljedica smanjene ekspresije akvaporina 1 i 2. Stoga su se razine BUN i kreatinina smanjile u mnogim studijama [22] kao iu našoj studiji. U patološkim uvjetima, stanice mogu izgubiti proteostazu što rezultira nakupljanjem nesmotanih i pogrešno savijenih proteina u ER-u, što pokreće UPR ili ER stres [23].

Slika 5. Imunohistokemijsko bojenje za TRPC1 u kontrolnim (1A-B) i hipertiroidnim (2A-B) skupinama ububregtkivo. Ekspresija TRPC povećana je u skupini s hipertireozom u usporedbi s kontrolnom skupinom (strelice). Šipke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne skupine (p < 0.000),="" proveden="" je="" mann–whitney="" u="">

Slika 6. Imunohistokemijsko bojenje za GRP78 u kontrolnim (1A-B) i hipertiroidnim (2A-B) skupinama ububregtkivo. Ekspresija GRP78 je povećana u skupini hipertireoze (strelice). Prečke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne skupine (p < 0.000),="" proveden="" je="" mann–whitney="" u="">

Slika 7. Imunohistokemijsko bojenje za ATF6 u kontrolnim (1A-B) i hipertiroidnim (2A-B) skupinama ububregtkivo. Ekspresija ATF6 je povećana u hipertiroidnoj skupini (strelice). Prečke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne skupine (p < 0.000),="" proveden="" je="" mann–whitneyjev="" u="">

Slika 8. Imunohistokemijsko bojenje za IRE1 u kontrolnim (1A-B) i hipertireoidnim (2A-B) skupinama ububregtkivo. Ekspresija IRE1 povećana je u skupini s hipertireozom (strelice). Prečke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne skupine (p < 0.000),="" proveden="" je="" mann–whitney="" u="">

Slika 9. Imunohistokemijsko bojenje za PERK u kontrolnim (1A-B) i hipertireoidnim (2A-B) skupinama ububregtkivo. Ekspresija PERK-a je povećana u skupini hipertireoze (strelice). Šipke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne skupine (p < 0.000),="" proveden="" je="" mann–whitney="" u="">

Poremećaji u ER i citosolnoj homeostazi Ca2 plus povezani su s mnogim bolestima, uključujućibubreg. Poremećaj ER Ca2 plus homeostaze pokreće UPR, koji sprječava daljnje nakupljanje novosintetiziranih proteina u ER. Stoga pokazuje obrambeni mehanizam za preživljavanje smanjenjem opterećenja na ER [24].

Poznato je da različiti čimbenici izazivaju ER stres i izazivajububregšteta. ER stres u bubregu može uzrokovati diferencijaciju tubularnih epitelnih stanica mezenhimalnim prijelazom iz epitela, gubitak bubrežnih tubularnih epitelnih stanica apoptozom i konačno bubrežnu patologiju uključujući gubitak nefrona, što smanjuje kapacitet filtracije bubrega. U studiji Dickhouta i sur. prikazan je ER stresom induciran epitelno-mezenhimalni tranzicijski proces u staničnoj liniji proksimalnih tubula bubrega HK-2 za kroničnu bolest bubrega [25]. Uz mnoge studije [9] kao što se vidi u našoj studiji,hipertireozauzrokovala zadebljanje kapilarne bazalne membrane u glomerulu. Pretpostavlja se da je povećano zadebljanje bazalne kapilarne membrane u glomerulima nastalo kao rezultat epitelno-mezenhimalnog tranzicijskog procesa zbog povećane ekspresije GRP78 i pretvarača signala ER-stresa. Važnost ER stresa pokazala se u kroničnombubregbolesti u mnogim patološkim stanjima. U modelu dijabetesa izazvanog streptozotocinom u C57BL/6 miševa, razvio se ER stres, a teška nefropatija koja se pojavila u dvadeset drugom mjesecu bila je povezana s regulacijom CHOP/GADD153, jedne od komponenti puta apoptoze posredovane ER stresom [26]. ]. U bolesnika s nefrotskim sindromom, IgA nefropatijom, primarnim mezangijskim proliferativnim glomerulonefritisom i membranskom nefropatijom, uključujući pacijente s minimalnim simptomima, imunohistokemijske ekspresije GRP78 i inducibilnog endoplazmatskog retikuluma (ER) molekule šaperona molekule kisikom regulirane 150 (ORP150) bile su povećane u usporedbi s kontrolama. Ekspresija CHOP/GADD153 također je bila povećana i uočena je lokalizacija jezgre u epitelu proksimalnih tubula nefrotičnih pacijenata. U stanicama ljudskih bubrega izloženih visokim razinama serumskog albumina, uočena je indukcija ER stresa i pokazalo se da uzrokuje apoptozu putem CHOP/GADD153 puta [25]. Tubulointersticijski ER odgovor na stres pronađen je u glomerularnim bolestima s apoptozom tubularnih stanica povezanom s nefrozom puromicin amino nukleozida, preopterećenjem proteinima i proteinurijom povezanom s eksperimentalnom ili humanom dijabetičkom nefropatijom [27]. Lorz i sur. izvijestio je da paracetamol, analgetik i antipiretik, uzrokuje oštećenje bubrežnih tubula i apoptozu zbog ER stresa [28]. Paracetamol izaziva ER odgovor na stres uključujući indukciju CHOP-a i cijepanje kaspaze-12. Pretjerano nakupljanje sekretornih proteina izaziva ER stres, uzrokujući oštećenje podocita [29]. Napad komplementa također izaziva ER stres i aktivira PERK put što dovodi do oštećenja glomerularnih epitelnih stanica. Sva ova otkrića pokazuju da je hitni stres jedan od glavnih uzroka oštećenja bubrega, a odgovor na hitni stres obrambeni mehanizam protivbubregoštećenje [30]. U našem istraživanju smatramo da hipertireoza izazvana tiroksinom od 12 mg/L uzrokuje ER stres u bubrežnom tkivu i oštećenje uzrokovanohipertireozau tkivu bubrega povezan je s regulacijom posebno ATF6 i PERK.

Prvi klonirani TRP kanal sisavaca, ionski kanal TRPC1, nalazi se u stanici unutar ER, plazma membrane, unutarstaničnih vezikula i primarne cilijarne stanice. Eksprimira se gotovo posvuda u tkivima ljudi i glodavaca. TRPC1 stupa u interakciju s različitim skupinama proteina, uključujući podjedinice ionskih kanala, receptore i citosolne proteine ​​kako bi posredovao svoj učinak na Ca2 plus signal. Djeluje kao neselektivni kationski kanal u putevima koji kontroliraju Ca2 plus priljev kao odgovor na aktivaciju receptora na površini stanice. Kroz ovu funkciju također su dostupni proliferacija, preživljavanje, diferencijacija, sekrecija i migracija stanica, kao i značajke kao što su konusi rasta neurona i fuzija mioblasta kemotropnih funkcija specifičnih za stanice [12].

Postoje mnoge studije o promjeni ekspresije TRPC1 u mnogim patološkim stanjima koja uzrokuju ER stres. Sukumaran i sur. pokazalo je da postoji korelacija između ER stresa i ekspresije TRPC1 koja bi mogla promijeniti preživljavanje stanica u žlijezdi slinovnici. Izrazili su da se ekspresija TRPC1 smanjila u uvjetima ER stresa, a također je smrt stanica zbog ER stresa ovisila o ekspresiji CHOP. Uočen je povećani ER stres i infiltracija u stanicama žlijezda slinovnica TRPC1-/- knock-out miševa [16].

Slika 10. ThebubregRazine ekspresije proteina GRP78, ATF6, TRPC1, IRE1 i PERK i grafikon promjene puta. Povećanje svih proteina bilo je statistički značajno (*p < 0.05),="" proveden="" je="" t-test="" neovisnih="">

Kadabubregaispitanih modela dijabetičkih štakora, objavljeno je da je ekspresija TRPC1 mRNA smanjena [31]. U bolesnika s dijabetičkom nefropatijom ili Zucker dijabetičkih štakora u usporedbi s kontrolama, smanjena ekspresija TRPC1 sugerira da TRPC1 utječe na razvoj dijabetičke nefropatije [32]. TRPC1 igra vitalnu ulogu u održavanju ER Ca2 plus homeostaze, a smanjena funkcija dovodi do produljene aktivacije UPR puta i remeti aktivaciju AKT, što zatim dovodi do neurodegeneracije. Smanjenje ekspresije TRPC1 primijećeno je u modelu mišje Parkinsonove bolesti izazvane neurotoksinom. Povećana ekspresija TRPC1 povećava preživljavanje neurona reguliranjem AKT/mTOR puta, unatoč ER stresu i UPR-u uzrokovanom neurotoksinom [33]. Li et al. izvijestili su da je ekspresija TRPC1 također bila povećana u hipertrofiji kardiomiocita izazvanoj Namptinom, ovisno o vremenu. Kada je gen TRPC1 utišan, to je rezultiralo inhibicijom srčane hipertrofije izazvane nikotinamid fosforibozil transferazom. Međutim, smatralo se da prekomjernom ekspresijom TRPC1 nikotinamid fosforiboziltransferaza inducira hipertrofiju kardiomiocita ER putem izazvanim stresom. S ove točke gledišta, utišavanje gena TRPC1 može imati zaštitnu ulogu u prevenciji srčane hipertrofije [34]. U našoj studiji, ER stres i TRPC1 također su značajno porasli. Ovo sugerira da je zadebljanje bazalne membrane kapilara uzrokovano povećanim ER stresom u bubrežnom tkivu zboghipertireozaje zbog povećane ekspresije TRPC1.

Ova studija ima neka ograničenja. Genetski modificirani miševi mogli su se koristiti umjesto modela štakora hipertireoze izazvane tiroksinom. S urinom prikupljenim pomoću metaboličkih kaveza, nekibubregfunkcionalni testovi mogli su se također mjeriti u urinu. Promjena razine ER stresa mogla bi se istražiti korištenjem inhibitora TRPC1.

Kao rezultat našeg pregleda literature, učinak hipertireoze na odnos između ER stresa i TRPC1 kanala u bubrežnom tkivu prvi je put prikazan u ovoj studiji. Utvrđeno je dahipertireozauzrokovao je povećanje ekspresije TRPC1 koja inducira ER stres. Predlažemo da smanjenje ekspresije TRPC1 može biti potencijalna terapijska strategija za hipertireozu izazvanububrega možda i oštećenja drugih organa.

Reference

1. Kim D, Kim W, Joo SK, Bae JM, Kim JH et al. Subklinička hipotireoza i niska normalna funkcija štitnjače povezani su s nealkoholnim steatohepatitisom i fibrozom. Klinička gastroenterologija i hepatologija 2018; 16 (1): 123-131. DOI: 10.1016/j.cgh.2017.08.014

2. Bolkiny Y, Toulson E, El-Atrsh A, Akela M, Farg E. Ekstrakt korijena koštunice ublažava biokemijske poremećaje krvi eksperimentalno izazvanih hipo-ihipertireozakod miševa. Annual Research & Review in Biology 2019; 31 (5): 1-10. DOI: 10.9734/arb/2019/v31i530063

3. Sakr S, Abdel-Ghafar FR, Abo-El-Yazid SM. Selen ublažava hepatotoksičnost izazvanu karbimazolom i oksidativni stres u albino štakora. Časopis Coastal Life Medicine 2015; 3 (2): 930-936. DOI: 10.1016/j.jtemb.2010.07.002

4. Vargas F, Moreno JM, Rodríguez-Gómez I, Wangensteen R, Osuna A, et al. Vaskularna i bubrežna funkcija u eksperimentalnim poremećajima štitnjače. European Journal of Endocrinology 2006; 154 (2): 197-212. DOI: 10.1530/tee.1.02093

5. Rhee CM. Interakcija između štitnjače ibubregbolest: pregled dokaza. Current Opinion in Endocrinology 2016; 23 (5): 407-415. DOI: 10.1097/Med.0000000000000275

6. Wijkhuisen A, Djouadi F, Vilar J, Merlet-Benichou C, Bastin J. Hormoni štitnjače reguliraju razvoj enzima metabolizma energije u štakorskom proksimalnom zavojitom tubulu. American Journal of Physiology-Renal Physiology 1995; 268 (4): 634-642. DOI: 10.1152/ajprenal.1995.268.4.F634

7. Baum M, Dwarakanath V, Alpern RJ, Moe OW. Učinci hormona štitnjače na neonatalni renalni kortikalni Na plus /H plus antiporter. Kidney International 1998; 53 (5): 1254-1258. DOI: 10.1046/j.1523-1755.1998.00879.x

8. Alcalde AI, Sarasa M, Raldúa D, Aramayona J, Morales R et al. Uloga hormona štitnjače u regulaciji bubrežnog transporta fosfata u mladih i starih štakora. Endokrinologija 1999.; 140 (4): 1544-1551. DOI: 10.1210/endo.140.4.6658

9. Iglesias P, Bajo MA, Selgas R, Díez JJ. Disfunkcija štitnjače i bolest bubrega: ažuriranje. Prikazi u endokrinim i metaboličkim poremećajima 2017.; 18 (1): 131-144. DOI:

10,1007/s 11154-016-9395-710. Selvaraj S, Watt JA, Singh BB. TRPC1 inhibira apoptotičku degeneraciju stanica izazvanu dopaminergičkim neurotoksinom MPTP/MPP plus. Cell Calcium 2009; 46 (3): 209-218. DOI: 10.1016/j.ceca.2009.07.008

11. Goda Y, Südhof TC. Kalcijeva regulacija oslobađanja neurotransmitera: pouzdano nepouzdano? Current Opinion in Cell Biology 1997; 9 (4): 513-518. DOI: 10.1016/s0955-0674(97)80027-0

12. Sukumaran P, Schaar A, Sun Y, Singh BB. Funkcionalna uloga TRP kanala u modulaciji ER stresa i autofagije. Stanični kalcij 2016; 60 (2): 123-132. DOI: 10.1016/j.ceca.2016.02.012

13. Goel M, Sinkins WG, Zuo CD, Estacion M, Schilling WP. Identifikacija i lokalizacija TRPC kanala u štakorabubreg. American Journal of Physiology-Renal Physiology 2006; 290 (5): 1241-1252. DOI: 10.1152/ajprenal.00376.2005

14. Chubanov V, Kubanek S, Fiedler S, Mittermeier L, Gudermann T i sur. Bubrežne funkcije TRP kanala u zdravlju i bolesti. U: Emir TLR (urednik). Neurobiologija TRP kanala. 1. izd. Boca Raton, Florida, SAD: CRC Press/Taylor & Francis; 2017. str. 187-212.

15. Jeschke MG, Gauglitz GG, Song J, Kulp GA, Finnerty CC et al. Kalcij i ER stres posreduju jetrenoj apoptozi nakon opekline. Journal of Cellular and Molecular Medicine 2009; 13 (8b): 1857-1865. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2009.00644.x

16. Sukumaran P, Sun Y, Zangbede FQ, Nascimento da Conceicao V, Mishra B et al. Ekspresija i funkcija TRPC1 inhibiraju ER stres i staničnu smrt u stanicama žlijezda slinovnica. FASEB BioAdvanc es 2019; 1 (1): 40-50. DOI: 10.1096/fab.1021

17. Zhao Y, Yan Y, Zhao Z, Li S, Yin J. Dinamičke promjene markera puta stresa endoplazmatskog retikuluma GRP78 i CHOP u hipokampusu dijabetičkih miševa. Brain Research Bulletin 2015; 111: 27-35. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2014.12.00618. Araujo A, Schenkel P, Enzveiler A, Fernandes T, Partita W et al. Uloga redoks signalizacije u srčanoj hipertrofiji izazvanoj eksperimentalnohipertireoza. Journal of Molecular Endocrinology 2008; 41 (6): 423-430. DOI: 10.1677/JME-08-002419. Wang Z, Carmo JM, Aberdein N, Zhou X, Williams JM et al. Sinergijska interakcija hipertenzije i dijabetesa u poticanju oštećenja bubrega i uloga stresa endoplazmatskog retikuluma. Hipertenzija 2017; 69 (5): 879-891. DOI: 10.1161/hipertenzijaha.116.08560

20. Zhang LY, Zhang YQ, Zeng YZ, Zhu JL, Chen H et al. TRPC1 inhibira proliferaciju i migraciju raka dojke pozitivnog na estrogenske receptore i daje bolju prognozu inhibicijom PI3K/AKT puta. Istraživanje i liječenje raka dojke 2020.; 182 (1): 21-33. DOI: 10.1007/s10549-020-05673-8

21. Aldubayan MA. Proantocijanidin sjemenki grožđa ublažava oksidativni stres i apoptozu uključenu u jetru hipertireoidnih miševa. Annual Research & Review in Biology 2019: 1-11. DOI: 10.9734/arb/2019/v33i630138

22. Sonmez E, Bulur O, Ertugrul DT, Sahin K, Beyan E et al.Hipertireozautječe na funkciju bubrega. Endokrini 2019; 65 (1): 144-148. DOI: 10.1007/s12020-019-01903-2

23. Yan M, Shu S, Guo C, Tang C, Dong Z. Stres endoplazmatskog retikuluma u ishemijskom i nefrotoksičnom akutnombubregozljeda. Annals of Medicine 2018; 50 (5): 381-390. DOI: 10.1080/07853890.2018.1489142

24. Bezprozvanny I, Mattson MP. Pogrešno rukovanje neuronskim kalcijem i patogeneza Alzheimerove bolesti. Trendovi u neuroznanostima 2008; 31 (9): 454-463. DOI: 10.1016/j.tins.2008.06.005

25. Dickhout JG, Carlisle RE, Austin RC. Međuodnos između hipertrofije srca, zatajenja srca i kronične bubrežne bolesti: stres endoplazmatskog retikuluma kao posrednik u patogenezi. Circulation Research 2011; 108 (5): 629-642. DOI: 10.1161/circresaha.110.226803

26. Wu J, Zhang R, Torreggiani M, Ting A, Xiong H i sur. Indukcija dijabetesa kod starih C57B6 miševa rezultira teškom nefropatijom: povezanošću s oksidativnim stresom, stresom endoplazmatskog retikuluma i upalom. The American Journal of Pathology 2010; 176 (5): 2163-2176. DOI: 10.2353/ajpath.2010.090386

27. Cybulsky AV. Stres endoplazmatskog retikuluma kod proteinurične bolesti bubrega.BubregMeđunarodni 2010.; 77 (3): 187-193. DOI: 10.1038/ki.2009.389

28. Lorz C, Justo P, Sanz A, Subirá D, Egido J et al. Ozljeda bubrežnih tubula izazvana paracetamolom: uloga ER stresa. Journal of the American Society of Nephrology 2004; 15 (2): 380-389. DOI: 10.1097/01.asn.0000111289.91206.b0

29. Inagi R, Nangaku M, Onogi H, Ueyama H, Kitao Y et al. Uključenost stresa endoplazmatskog retikuluma (ER) u ozljedu podocita izazvanu prekomjernom akumulacijom proteina.BubregMeđunarodni 2005.; 68 (6): 2639-2650. DOI: 10.1111/j.1523-1755.2005.00736.x

30. Yoshida H. ER stres i bolesti. Časopis FEBS 2007; 274 (3): 630-658. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.05639.x

31. Nesin V, Tsiokas L. TRPC1. U: Nilius B, Flockerzi V (urednici). Kationski kanali prolaznog receptorskog potencijala sisavaca (TRP). 24. izd. Berlin, Heidelberg, Njemačka: Springer; 2014. str. 15-51.

32. He F, Peng F, Xia X, Zhao C, Luo Q et al. MiR-135a potiče fibrozu bubrega kod dijabetičke nefropatije reguliranjem TRPC1. Diabetologia 2014; 57 (8): 1726-1736. DOI: 10.1007/s00125-014-3282-0

33. Selvaraj S, Sun Y, Watt JA, Wang S, Lei S i sur. Neurotoksinom izazvan ER stres u dopaminergičkim neuronima miša uključuje regulaciju TRPC1 i inhibiciju AKT/mTOR signalizacije. The Journal of Clinical Investigation 2012; 122 (4): 1354-1367. DOI: 10.1172/JCI61332

34. Li J, Wu W, Zhao M, Liu X. Učešće TRPC1 u hipertrofiji kardiomiocita izazvanoj Namptom kroz aktivaciju ER stresa. Stanična i molekularna biologija 2017.; 63 (4): 33-37. DOI: 10.14715/CMB/2017.63.4.6