Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao, Hsin-Wen Huang, Hui-Chi Huang, Hsin-Fan Chao, Shuen-Wen Yu, Muh-Hwan Su, Chao-Jih Wang i Hang-Ching Lin

Sažetak

Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt(CTE) već se koristi kao botanički lijek na recept za liječenje demencije u Kini. Naše prethodne studije objavile su da su feniletanoidni glikozidi CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt) imaju aktivnost protiv Alzheimerove bolesti (AD) inhibicijom agregacije i taloženja amiloidnog peptida (A). Međutim, nedavne studije smatraju da feniletanoidne glikozide mogu metabolizirati crijevne bakterije jer su svi rezultati analiza pokazali da je bioraspoloživost feniletanoidnih glikozida izrazito niska. U ovoj studiji pokazujemo kako kelacija željeza igra ključnu ulogu u mehanizmu inhibicije agregacije i taloženja Afeniletanoidni glikozidiod CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt). Osim toga, dodatno smo dokazali da feniletanoidni glikozidi (1-3) mogu dospjeti u mozak. Aktivni CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)potvrda komponente i mehanizma djelovanja bit će velika pomoć za kontrolu kvalitete proizvoda i studije bioraspoloživosti u budućnosti. U isto vrijeme, nudimo novu metodu analize korisnu u određivanju feniletanoidnih glikozida (1-3) u biljkama, hrani, krvi i tkivima za kemijski otisak prsta i farmakokinetička istraživanja.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa; feniletanoidni glikozidi; Alzheimerova bolest; kelacija željeza

Cistanche tubulosa

1. Uvod

Demencija je jedna od najčešćih kroničnih bolesti starenja. Svjetsko izvješće o Alzheimeru iz 2015. godine procjenjuje da oko 46,8 milijuna ljudi pati od demencije, a očekuje se da će taj broj biti 74,7 milijuna 2030. godine i 131,5 milijuna 2050. godine [1]. Globalna populacija demencije povećavat će se iz godine u godinu i u budućnosti će izmaći kontroli. Globalni zdravstveni izdaci za liječenje demencije bili su gotovo 604 milijarde američkih dolara u 2010. godini, a očekuje se da će taj iznos biti 1000 milijardi u 2030. [2]. Pacijenti s demencijom imaju veći rizik od slučajne smrti [3] i stoga zahtijevaju više medicinske skrbi. Ovo je težak teret za obiteljske njegovatelje oboljelih od demencije. Utjecaj demencije na njegovatelje, obitelj i društvo može proizvesti veliki fizički, psihički, životni i ekonomski stres. Postoje dva glavna oblika demencije, Alzheimerova bolest (AD) i vaskularna demencija [4,5]. AD je najčešća demencija i ireverzibilan je i progresivan neurodegenerativni poremećaj [4-6]. AD je bio šesti vodeći uzrok smrti u Sjedinjenim Državama u 2015. [6].

Nedavne studije podupiru da je toksičnost neurona izazvana agregacijom amiloidnog peptida (A) (plakovi) i proteina tau (zapetljanja) usko povezana s patogenezom AD. Nakupljanje A i proteina tau u mozgu može dovesti do oštećenja neurona i gubitka pamćenja [7]. Netopljivi A oligomeri nakupljaju se u izvanstaničnim plakovima i navodno dovode do sinaptičke disfunkcije, toksičnosti neurona i stanične smrti [8]. Nažalost, do sada nije dostupan učinkovit tretman za uklanjanje A i proteina tau, ili inhibiciju stvaranja ili oligomerizacije A, te suspendiranje ili liječenje ireverzibilnog oštećenja neurona. Sadašnji terapeutski agensi, kao što su galantamin i donepezil, koji su inhibitori acetilkolinesteraze, mogu samo privremeno ublažiti gubitak pamćenja podizanjem razine neurotransmitera. U 2012. nijedan kandidat za lijekove nije uspio smanjiti učinak A u velikim kliničkim studijama bolesnika s AD [9]. Stoga je hitno potrebno istraživanje za novi tretman za suzbijanje prevalencije Alzheimerove bolesti. Metalni ioni nedavno su smatrani ključnim čimbenikom koji je usko povezan s agregacijom A [10]. Kelatori metala koji se smatraju potencijalnim spojevima olova pružaju potpuno novu strategiju za pristup protiv AD-a [9,11-15].

Osušena stabljika Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, naširoko se bere u pustinji Xinjiang u Kini. To je važna tradicionalna kineska medicina koja pripada toničkoj kineskoj medicini indeksiranoj u Kineskoj farmakopeji i koristi se tisućama godina za liječenje fizičke slabosti, nedostatka bubrega, neplodnosti, zaboravnosti, impotencije i staračkog zatvora [16,17].Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt(CTE) kapsule odobrene su kao botanički lijek za vaskularnu demenciju u Kini. Prema kliničkom ispitivanju na 18 pacijenata s dijagnozom blagog do umjerenog AD, CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)kapsule dale su pacijentima stabilnije stanje pamćenja u usporedbi s inhibitorima acetilkolinesteraze [18]. U našoj prethodnoj studiji, CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)smanjeno taloženje amiloidnog peptida (A) i poboljšan gubitak pamćenja kod štakora sličnih Alzheimerovoj bolesti [19]. Feniletanoidni glikozidi, ehinakozid (1), akteozid (2) i izoakteozid (3) smatraju se glavnim komponentama CTE-a(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)[20]. Spoj 1 ima neuroprotektivno djelovanje protiv toksičnosti 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) [21], 1-metil -4-fenil piridinijev ion (MPP plus ) [22] i 6-hidroksidopamin (6-OHDA) [23]. Naše prethodno izvješće pokazalo je da je 1 potisnuo A oligomerizaciju i toksičnost u in vitro studiji, te inhibirao taloženje A, poboljšavajući oslabljenu memoriju i kognitivnu disfunkciju u štakora izazvanih A [24]. Spojevi 2 i 3 povećali su razgradnju A i smanjili oligomerizaciju A in vitro [25]. Spoj 3 smanjio je taloženje A u štakora izazvanih A [25]. Na temelju ovih studija, C. tubulosa je već dokazala da ima potencijal za liječenje AD. CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)usko je povezan s anti-A agregacijom i taloženjem [24,25]. Da bismo bolje razumjeli CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)mehanizma, moramo imati prikladnu i učinkovitu metodu za identifikaciju aktivne komponente, kao i sadržaja u uzorcima moždanog tkiva. Većina studija je dizajnirana za kvantitativno određivanje ehinakozida, akteozida i izo-akteozida u bilju ili hrani tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) [26-28], ali samo su dvije studije bile za određivanje u serumu ili tkivima [29, 30]. Međutim, ne postoji izvješće o istovremenoj analizi 1-3 u tkivima mozga nakon CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)oralna primjena. Osim toga, iz nedavnih studija još uvijek nije jasno je li CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)aktivne komponente ili njihovi metaboliti uspješno su prošli krvno-moždanu barijeru i djelovali na moždane neurone. Stoga ovo istraživanje pruža naprednu i osjetljivu metodu s uvjerljivim dokazima koji jasno ilustriraju temeljni mehanizam CTE-a(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)protiv A agregacije i taloženja.

Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt

2. Rezultati

2.1. Izolacija i identifikacija tri glavna spoja (1-3)

Osušene stabljike C. tubulosa ekstrahirane su sa 75 posto EtOH na sobnoj temperaturi. Kondenzirani 75-postotni EtOH ekstrakt podvrgnut je smoli i kromatografiji na stupcu C18 da bi se dobila tri glavna spoja, ehinakozid (1), akteozid (2) i izo-akteozid (3). Njihove su strukture razjašnjene analizom NMR (Nuklearna magnetska rezonancija) spektroskopije i ESI-MS (Electrospray ionization mass) te usporedbom s literaturnim podacima [31-33] (Slika 1, Dodatni materijali Slike S3-S11).

2.2. Analiza sadržaja feniletanoidnih glikozida (1-3) iz CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)

Metoda ispitivanja validirana je za analizu feniletanoidnih glikozida. Spojevi 1-3 (50 mg) točno su izvagani i pomiješani s 50 posto metanola (40 mL). Smjese su sonikirane 5 minuta. Tri standardne otopine feniletanoidnih glikozida (1-3) pomiješane su kao standardna osnovna otopina (100 µg/mL). Standardna osnovna otopina korištena je za pripremu pet različitih koncentracija (5, 10, 25, 50 i 100 µg/mL) navedenih otopina, redom, razrjeđivanjem sa serijskim volumenima od 50 posto metanola. Krivulje feniletanoidnih glikozida (1-3) utvrđene su tekućinskom kromatografijom ultraučinkovitosti (UPLC) od 5-100 µg/mL i bile su linearne (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). Unutardnevna i međudnevna preciznost [postotak RSD (relativna standardna devijacija) bila je od 0,1 do 1,8 posto], a točnost (95,6-104,2 posto) bila je prihvatljiva za UPLC za 1-3. UPLC je kvantificirao 1, 2 i 3 CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)sadržaji biti 254, 38, odnosno 41 mg/g (Slika S2)

2.3. UPLC/MS/MS provjera valjanosti

Feniletanoidni glikozidi (1-3) pomiješani su i pomiješani s homogenatom moždanog tkiva štakora i analizirani uporabom ultraperformansne tekućinske kromatografije-tandem masenog spektrometra (UPLC/MS/MS) s ekstrakcijom čvrste faze. Donja granica detekcije (LLOQ) od 1-3 bila je 0,2 ng/mL. Oporavak feniletanoidnih glikozida obogaćen homogenatom moždanog tkiva (10 ng/mL) na 91,39 posto za 1, 89,54 posto za 2, odnosno 96,81 posto za 3 (Slika 2).

2.4. Analiza moždanih tkiva štakora nalik AD-u

Nakon 14 dana CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)oralne primjene (200 mg/kg/dan), tkiva mozga štakora slična AD-u sakupljena su i podijeljena u dva dijela, hipokampus i striatum, i oba su homogenizirana [19]. Budući da su homogenati hipokampusa i striatuma iz svakog štakora bili premali da bi se unijeli u ekstrakciju čvrste faze i da bi se izbjegle pretjerane eksperimentalne pogreške, homogenati hipokampusa i striatuma iz četiri pojedinačna štakora pomiješani su u analizirani uzorak za UPLC/MS/MS pomoću metoda ekstrakcije čvrste faze (Slika 3A, B). Feniletanoidni glikozidi (1-3) uočeni su u hipokampusu (Slika 3A) i striatumu (Slika 3B). Nije bilo značajnog vrha u praznim moždanim tkivima (Slika 3C). U hipokampusu je sadržaj ehinakozida iznosio 11,97 ± {{20}},34 ng/mL, sadržaj akteozida bio je 1,25 ± 0,16 ng/mL, a sadržaj izoakteozida bio je 1,38 ± 0,08 ng/ml. mL. U striatumu je sadržaj ehinakozida iznosio 22,60 ± 1,69 ng/mL, sadržaj akteozida 2,03 ± 0,61 ng/mL, a sadržaj izoakteozida 4,90 ± 0,64 ng/mL. Kao što je prikazano na slici 4, CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)prolazi kroz krvno-moždanu barijeru prema značajnim detektabilnim količinama 1-3 u hipokampusu i striatumu. Sadržaj 1 je puno veći od 2 i 3 u CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)UPLC analizom (Slika S2). Stoga je razumno uočiti da je 1 najveći u tkivu mozga nakon oralnog CTE-a(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)uprave. Molecules 2019, 24, x ZA RECENZIJU 4 od 12 2.4. Analiza moždanih tkiva štakora nalik AD-u nakon 14 dana CTE-a(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)oralne primjene (200 mg/kg/dan), tkiva mozga štakora slična AD-u sakupljena su i podijeljena u dva dijela, hipokampus i striatum, i oba su homogenizirana [19]. Budući da su homogenati hipokampusa i striatuma iz svakog štakora bili premali da bi se unijeli u ekstrakciju čvrste faze i da bi se izbjegle pretjerane eksperimentalne pogreške, homogenati hipokampusa i striatuma iz četiri pojedinačna štakora pomiješani su u analizirani uzorak za UPLC/MS/MS pomoću metoda ekstrakcije čvrste faze (Slika 3A, B). Feniletanoidni glikozidi (1-3) uočeni su u hipokampusu (Slika 3A) i striatumu (Slika 3B). Nije bilo značajnog vrha u praznim moždanim tkivima (Slika 3C). U hipokampusu je sadržaj ehinakozida iznosio 11,97 ± {{20}},34 ng/mL, sadržaj akteozida bio je 1,25 ± 0,16 ng/mL, a sadržaj izoakteozida bio je 1,38 ± 0,08 ng/ml. mL. U striatumu je sadržaj ehinakozida iznosio 22,60 ± 1,69 ng/mL, sadržaj akteozida 2,03 ± 0,61 ng/mL, a sadržaj izoakteozida 4,90 ± 0,64 ng/mL. Kao što je prikazano na slici 4, CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)prolazi kroz krvno-moždanu barijeru prema značajnim detektabilnim količinama 1-3 u hipokampusu i striatumu. Sadržaj 1 je puno veći od 2 i 3 u CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)UPLC analizom. Stoga je razumno uočiti da je 1 najveći u tkivu mozga nakon oralnog CTE-a(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)administrator.

2.5. Feniletanoidni glikozidi (1-3) Aktivnost keliranja metala

U literaturi je određivanje slobodnih spojeva i njihovih metalnih kompleksa provedeno pomoću HPLC [34,35]. Mjera kelacijske aktivnosti analizirana je pomoću UPLC u ovoj studiji. Otopine od 50 µg/mL svakog feniletanoidnog glikozida (1-3) dodane su u otopinu od 10 µg/mL bakra (Cu), kalcija (Ca), magnezija (Mg), cinka (Zn), željeza (Fe) ili štakorski serum odnosno. Svaki spoj sa svakom metalnom otopinom ili serumom analiziran je UPLC-om. Feniletanoidni glikozidi (1-3) pokazali su aktivnost keliranja metala sa željezom i serumom (Slika 5, Dodatni materijali Slika S1). Molecules 2019, 24, x ZA RECENZIJU 5 od 12 uzoraka AD-sličnih štakora nakon CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)oralna primjena (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4.19 min), 2 (tR= 5.13 min) i 3 (tR= 5.68 min)] . (c) Prazno tkivo mozga. Slika 4. Feniletanoidni glikozidi (1-3) mogli su se otkriti u moždanom tkivu štakora [19] pomoću UPLC/MS/MS. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD, n=3 za svaku skupinu. 2.5. Feniletanoidni glikozidi (1-3) kelirajuća aktivnost metala. U literaturi je određivanje slobodnih spojeva i njihovih metalnih kompleksa provedeno pomoću HPLC [34,35]. Mjera kelacijske aktivnosti analizirana je pomoću UPLC u ovoj studiji. Otopine od 50 ug/mL svakog feniletanoidnog glikozida (1-3) dodane su u otopinu od 10 ug/mL bakra (Cu), kalcija (Ca), magnezija (Mg), cinka (Zn), željeza (Fe) ili štakorski serum odnosno. Svaki spoj sa svakom metalnom otopinom ili serumom analiziran je UPLC-om. Feniletanoidni glikozidi (1-3)

2.6. Analiza ehinakozida (1) u serumu štakora in vivo

Kako bi se razumjela distribucija ehinakozida u serumu štakora, serum je prikupljen od početnog vremena do 720 minuta nakon oralne primjene ehinakozida (1) (100 mg/kg), a serum je prikupljen od početnog vremena do 720 minuta nakon ehinakozida (1) oralno davanje (100 mg/kg) i analizirano pomoću UPLC. Slika 6 prikazuje profile koncentracije u odnosu na vrijeme ehinakozida u serumu štakora.

3. Rasprava

Demencija, posebice AD, je nepovratna kronična bolest starenja koja dovodi do Gordijskog čvora pitanja. Ova nepremostiva bolest dovodi do ozbiljnih ekonomskih problema s ogromnim i sve većim financijskim teretom. Diljem svijeta, istraživači AD-a ulažu mnogo truda u istraživanje novih lijekova protiv AD-a, ali nisu uspjeli u nekoliko velikih kliničkih ispitivanja usmjerenih na A 2012. [9]. Osim izravnog ciljanja A, homeostaza metalnih iona u mozgu smatra se ključnim razlogom povezanim s agregacijom i taloženjem A što dovodi do stvaranja AD [9,10]. Stoga metalni ioni igraju ključnu ulogu u patogenezi AD, a hipoteza o keliranju metala postala je važan smjer istraživanja [9,13–15].

Prema našim prethodnim studijama [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)pokazalo potencijalno djelovanje protiv demencije. Čak iu kliničkim studijama na ljudima, nakon 1 godine liječenja CTE-om(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)kapsule za pacijente s umjerenim AD-om, rezultat skale procjene Alzheimerove bolesti-kognitivna podskala (ADAS-cog) ne bi pokazao značajno pogoršanje u usporedbi s onim prije liječenja [18]. CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)održao ADAS-cog skor bolesnika s AD-om stabilnim, ali drugi lijekovi na recept nisu. Jedini izbor lijekova na recept odobrenih za liječenje AD-a su inhibitori acetilkolinesteraze (AChEI) kao što su donepezil i galantamin koji kratkoročno poboljšavaju simptome AD-a, ali pogoršanje nastupa nakon 1 godine liječenja [36]. Na temelju kliničkih studija, CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)ima priliku biti potencijalni tretman za razvoj anti-AD agensa. Na temelju naših prethodnih izvješća [24,25], ehinakozid (1), akteozid (2) i izo-akteozid (3) bi zaštitili neurone od oštećenja A, smanjili A oligomerizaciju in vitro i značajno poboljšali kognitivnu disfunkciju izazvanu A. in vivo. Studija in vitro pokazala je da su aktivne doze 1-3 bile do 50 ug/mL [24,25]. Ali prethodne studije su smatrale da je oralna bioraspoloživost 1 i 2 bila vrlo niska (0.83 posto za 1 i 0,12 posto za 2) u štakora [29,30]. Spoj 1 nije se čak mogao identificirati u ljudskom serumu nakon oralne primjene tablete ehinaceje [37]. Trenutne studije pokazuju da 1-3 ima slabu propusnost membrane i apsorpciju u crijevnim stanicama [38], a većina 1 bi se metabolizirala u gastrointestinalnim kanalima [39]. Sadržaj spoja 2 u serumu štakora bio je samo oko 4,5 ug/mL nakon 15 minuta intravenske injekcije s dozom od 10 mg/kg akteozida [30]. Međutim, ova studija pokazuje da bi se 1-3 otkrilo u hipokampusu i striatumu moždanog tkiva štakora nakon CTE-a(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)oralne primjene (slike 3 i 4). Uz to, Slika 6 pokazuje da se sadržaj spoja 1 u serumu štakora povećao oko 5 puta od 15 minuta do 720 minuta nakon oralne primjene spoja 1 (100 mg/kg). Razmotrili smo feniletanoidne glikozide CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)bi prolazio kroz krvno-moždanu barijeru i došlo bi do kelacijskog djelovanja između CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)i metal. Kelacija je reverzibilna kemijska reakcija. Željezo je esencijalni element u serumu i mozgu [10,40]. Slika 5 pokazuje da bi tri feniletanoidna glikozida imala aktivnost keliranja metala sa željezom i serumom. Željezo i serum očito mijenjaju područje vršnog vremena zadržavanja tri feniletanoidna glikozida. Kelacija željeza može biti ključni razlog koji dovodi do pogrešne identifikacije vrlo niske bioraspoloživosti feniletanoidnih glikozida. Stoga, aktivnost keliranja metala treba uzeti u obzir u analizi krvnog seruma i mozga tri CTE(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt)feniletanoidne glikozide za vraćanje stvarne bioraspoloživosti i farmakokinetike. Osim toga, rezultati su pokazali da bi tri feniletanoidna glikozida (1-3) prošla kroz krvno-moždanu barijeru i stigla do moždanih tkiva kroz tjelesnu cirkulaciju. Ova je studija razvila najbržu i najosjetljiviju metodu za analizu 1-3 korištenjem UPLC/MS/MS i pružila snažne dokaze koji dokazuju da su feniletanoidni glikozidi (1-3) glavni bioaktivni sastojci CTE-a(Cistanche tubulosa vodeni ekstrakt).

Ekstrakt Cistanche tubulosa

4. Materijali i metode

4.1. Biljni materijal

Stabljike C. tubulosa sakupljene su u svibnju 2016. iz Hangzhoua u Kini. Biljku je identificirao dr. Lin HC. Uzorci vaučera (br. 20016CT) pohranjeni su u Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kina.

4.2. Izolacija i pročišćavanje

Osušena stabljika C. tubulosa samljevena je u prah, a zatim ekstrahirana pet puta sa 75 posto EtOH. Nakon isparavanja otapala pod sniženim tlakom, sirovi ekstrakt je podvrgnut kromatografiji na stupcu s makroporoznom smolom AB-8 s gradijentnim sustavima otapala H2O/EtOH od 20 posto EtOH do 100 posto EtOH. Prema tankoslojnoj kromatografiji, četiri frakcije (Fr.1~Fr.4) su sakupljene za daljnje odvajanje. Fr. 2 podvrgnut je preparativnoj tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti (HPLC) na stupcu COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm × 20 mm id, 5 µm) koristeći 18 postotni acetonitril kao sustav mobilne faze. Snažna brzina bila je 15 ml/min. Selektivno su prikupljena tri glavna vrha interesa. Frakcije koje sadrže ciljane spojeve su dalje kondenzirane do suhog i proizvedene su 1, 2, odnosno 3.

4.3. Eksperimentalna analiza

1H i 13C NMR spektri dobiveni su uporabom spektrometra Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, SAD) s tetrametilsilanom (TMS) kao internim standardom. Preparativna HPLC provedena je pomoću stupca reverzne faze (Cosmosil C18-AR-II stupac, 250 mm × 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japan) na seriji Shimadzu LC-6AD aparat s Prominence HPLC UV-Visdetectors (Kyoto, Japan).

Ehinakozid (1):bijeli prah; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 'H NMR (CD3OD, 500 MHz): 8 107 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H{{10} }), 2,79 (2H, t, J=5.2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha{{20}}), 3,79 (1H, m, H-30), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J=7.9 Hz, H-10 ), 5.00 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40), 5,17 (1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8.1, 2.0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H{ {86}}), 6,94 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H{ {100}}), 5 7,59 (IH, d, J=15.9 Hz, H{106}}); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 8 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 124}} ), 70,5 (C-40 ), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50 ), 75,1 (Glc-C -2),76.1 (C-20 ), 77.8 (Glc-C-5), 77.9 (Glc-C-3), 81.7 (C-30 ) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10 ), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200 ), 115,3 (C{{ 188}} ), 116,3 (C-500 ), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 203}} ), 127,6 (C-100 ), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 218}} ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C-300 ), 168,5 (C-900 ) (Slika S3-S5)

Akteozid (2):bijeli prah; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 'H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 5 0.94 (3H, d, J =5.9 Hz, H{{1{{ 156}}}}), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{20}}), 4,70 (1H, t, J=9.0 Hz, H-400), 5,01 (1H, s, H-1000), 6,18 (1H, d, J=15 0,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, d, J=7 .1Hz, H-5), 6.73 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.75 (1H, d, J=7.9 Hz , H-50), 6,97 (1H, d, J=8.1 Hz, H-60), 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H , d, J=15.8 Hz, H-70 ); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): 8 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{94} } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C{{109} } ), 71,7 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 79,2 (C-300 ), 101,3 (C-1000 ), 102,3 (C{{124} } ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C{{139} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,6 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{154} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30 ), 145,6(C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,7 (C{{169} } ) (Slike S6–S8).

Izoakteozid (3):bijeli prah; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 'H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 8 .07 (3H, d, J=6.1 Hz, H{{10} }), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H{{ 24}}), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{{ 38}}), 6,58 (1H, d, J=8.8 Hz, H-5), 6.73 (1H, d, J=1.6 Hz, H{{50} }), 6,74 (1H, d, J=8.1 Hz, H-50), 6.94 (1H, d, J=8.2 Hz, H-60) 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 (1H, d, J=15, 8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 8 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400 ), 70,6 (C-3000 ), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000 ), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9(C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20 ), 114,9 (C-80 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2 ), 119,6(C-6), 121,5 (C-60 ), 125,5 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,6 (C-90 ) (Slike S9–S11).

4.4. Priprema vodenog ekstrakta Cistanche Tubulosa (CTE)

Prašak stabljike Cistanche tubulosa dvaput je ekstrahiran refluksom s vodom 1,5 h, a otopina ekstrakta je filtrirana. FiltriranoCistanche tubulosavodeni ekstrakt(CTE) je prije upotrebe pohranjen na 4 ◦C.

5. Zaključci

Ova studija je pokazala da je 1-3 aktivna komponenta CTE za anti-AD aktivnost. Kelacija željeza postala je novi koncept za dizajniranje nove generacije lijekova za liječenje AD [41]. CTE je potencijalni botanički kineski lijek protiv AD-a koji cilja na agregaciju i taloženje A izazvanu kelacijom željeza. Osim toga, dodatno smo dokazali da će 1-3 doći do mozga kroz krvno-moždanu barijeru (BBB). Aktivne komponente i temeljni mehanizam potvrde CTE-a uvelike će pomoći kontroli kvalitete i bioraspoloživosti studija proizvoda u budućnosti. U isto vrijeme, predstavljena napredna i učinkovita metoda analize bit će korisna u određivanju 1-3 u biljkama, hrani, krvi i moždanom tkivu za kemijski otisak prsta i farmakokinetička istraživanja.

Reference

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; Ikram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; et al. Promjenjiva prevalencija i incidencija demencije tijekom vremena – trenutni dokazi. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Demencija: Pravovremena dijagnoza i rana intervencija. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Close, J. Preživljavanje i karakteristike starijih osoba sa i bez demencije koji su hospitalizirani nakon namjernog samoozljeđivanja. Int. J. Geriatr. psih. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Klaus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Prevalencija Alzheimerove bolesti i vaskularne demencije: povezanost s obrazovanjem. Rotterdamska studija. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galaško, D.; Hall, K.; Luchsinger, JA; Ogunniyi, A.; Perry, EK; Potočnik, F.; et al. Alzheimerova bolest i vaskularna demencija u zemljama u razvoju: Prevalencija, liječenje i čimbenici rizika. Lanceta. Neurol. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. Činjenice i brojke o Alzheimerovoj bolesti za 2018. Alzheimerov dement. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Amiloidna hipoteza Alzheimerove bolesti: napredak i problemi na putu do terapije. Znanost 2002, 297, 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM Alzheimerova bolest. N. engl. J. Med. 2010, 362, 329–344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, AI Metalostaza u Alzheimerovoj bolesti. Slobodan Radić. Biol. Med. 2013, 62, 76–89. [CrossRef]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Učinci metalnih iona na agregaciju A i Tau. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Regulacija homeostaze bakra i željeza kelatorima metala: moguća kemoterapija za Alzheimerovu bolest. A. Chem. Res. 2015, 48, 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Kelatori bakra(I) za Alzheimerovu bolest. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Nedavni napredak u multifunkcionalnim kelatorima metala kao potencijalnim lijekovima za Alzheimerovu bolest. Coord. Chem. Rev. 2016, 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. D'Acunto, CW; Kaplanek, R.; Gbelcova, H.; Kajik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlik, M.; Ruml, T.; Kral, V. Metalomika za liječenje Alzheimerove bolesti: Upotreba nove generacije kelatora koji kombiniraju svojstva vezanja i transporta metalnih kationa. Eur. J. Med. Chem. 2018, 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Teranostika uključena u metal: Nova strategija za borbu protiv Alzheimerove bolesti. Coord. Chem. Rev. 2018, 362, 72–84. [CrossRef]

16. Shao, ML; Ma, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, XN Kineska farmakopeja; Kemijski i industrijski izdavač: Peking, Kina, 2005.; str. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Jedan od najboljih farmaceutskih darova tradicionalne kineske medicine. Ispred. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. Otvorena, ne-placebom kontrolirana studija o kapsulama glikozida Cistanche tubulosa (memo regain (R)) za liječenje umjerene Alzheimerove bolesti. Am. J. Alzheimer Dis. Drugi Demeni. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Preokret vodenim ekstraktima Cistanche tubulosa iz deficita ponašanja u modelu štakora nalik na Alzheimerovu bolest: važnost za taloženje amiloida i funkciju središnjeg neurotransmitera. BMC komplement. Alternativa. Med. 2014, 14, 202. [Unakrsna Ref.]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Analiza feniletanoidnih glikozida u ekstraktu herba Cistanchis pomoću LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Šinić. 2000, 35, 839–842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Neuroprotektivni učinci ehinakozida u mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolesti. Eur. J. Pharmacol. 2007., 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Da, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinacoside štiti od neuronske apoptoze izazvane MPP(plus) putem regulacije puta ROS/ATF3/CHOP. Neurosci. Bik. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Dakle, GH Echinacoside štiti od 6-mitohondrijske disfunkcije izazvane hidroksidopaminom i upalnih odgovora u PC12 stanicama smanjenjem proizvodnje ROS-a. Evid. Na temelju komplementa. Alternat. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinacoside ublažava oštećenje pamćenja i kolinergički deficit izazvan amiloid-beta peptidima putem inhibicije taloženja amiloida i toksikologije. Funkcija hrane. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Akteozid i izoakteozid štite citotoksičnost izazvanu amiloid-beta peptidom, kognitivni deficit i neurokemijske poremećaje in Vitro i in Vivo. Int. J. Mol. Sci. 2017., 18. [CrossRef]