Nanozimi koji oponašaju upalu i oponašaju katalazu ublažavaju akutnu ozljedu bubrega poništavanjem lokalnog oksidativnog stresa Ⅳ
Jun 19, 2024
Zaključak
Organsko bilje za bubrežne bolesti
Materijali i metode
Materijali
Sinteza i karakterizacija nanočestica dMn3O4
Sinteza TK povezivača, TK poveznice konjugiranog polietilen glikola (PEG-TK) i (PEG)-stearin (C18) konjugata (PTC) izvedena je prema našoj prethodnoj publikaciji [15]. Kao kontrolu, također smo pripremili ROS-neosjetljivi polimer (PC) konjugiranjem stearinske kiseline na PEG-AM. Ukratko, 200 mg m-PEG amina je reagiralo sa 160 mg stearinske kiseline sa 160 ul TEA, 480 mg EDC i 290 mg NHS u 20 ml DMF-a na 37 stupnjeva preko noći uz miješanje pod pročišćavanjem N2. Uzorak je zatim pročišćen dijalizom (MWCO=12–14 KDa) protiv DW tijekom jednog dana, nakon čega je uslijedilo sušenje zamrzavanjem. Kemijske strukture sintetiziranih PTC i PC potvrđene su uporabom protonske nuklearne magnetske rezonancije (1H NMR) spektroskopije (400 Hz, Bruker: Billerica, MA, SAD) u kloroformu (CHCl3). ROS-osjetljive PTC i ROS-neosjetljive PC prazne micele pripremljene su samosastavljanjem PTC-a i PC-a pod sonikacijom i dijalizom.
Priprema i karakterizacija ROS osjetljivog enzima (PTC‑M)
PTC-M je pripremljen metodom dijalize. Ukratko, 2 mg dMn3O4 i 10 mg PTC otopljeno je u 1 mL bezvodnog dimetil sulfoksida (DMSO). Smjesa je zatim dodana kap po kap u 20 ml DW uz sonikaciju sonde (30% amplituda, 5 s ON/OFF, 5 min). Otopina je zatim dijalizirana (MWCO=12–14 KDa) u odnosu na DW jedan dan, nakon čega je uslijedilo sušenje zamrzavanjem. Slično, dMn3O4 NP-napunjene ROS-neosjetljive nano micele (PC-M) također su pripremljene kao kontrolna skupina. Hidrodinamički promjeri i zeta potencijal pripremljenih praznih nano micela (PTC i PC) i nano micela s dMn3O4 NP (PTC-M i PC-M) procijenjeni su dinamičkim raspršenjem svjetlosti (Zetasizer Nano Z instrument, Malvern, UK). Morfologija pripremljenih PTC i PTC-M vizualizirana je pomoću FE−TEM. Te ROS-osjetljiva destabilizacija putem degradacije TK linkera PTC-M uočena je DLS i FE-TEM analizom nakon tretiranja uzoraka s 1 mM H2O2. Sadržaj punjenja dMn3O4 u konačnom PTC-M analiziran je pomoću termogravimetrijskog analizatora (TGA N-1000, Scinco, Seul, Koreja) i ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, SAD) analize .
Razgradnja H2O2 na vodu i kisik također je potvrđena korištenjem Ru(DDP) kao sonde za stvaranje kisika. Ukratko, uzorcima je dodan 1 mM H2O2, a zatimdodatkom 1 µM Ru(dDDP(DMF). Uzorcisu temeljito izmiješani i intenzitet fluorescencijepri ekscitaciji 440 nm i emisiji 530 – 730 nm bila jesnimljeno. Kasnije je potvrđena i proizvodnja kisikaodređivanjem koncentracije otopljenog kisika pomoćusenzor otopljenog kisika (RDO Optical Dissolved Sensor, Thermo Scientific).
Kultura stanica i reagensi
Studije in vitro provedene su kako je prethodno opisano [37]. Ukratko, ljudske bubrežne proksimalne tubularne epitelne stanice (HK-2 stanice, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) korištene su za i vitro studije. HK-2 stanice su uzgajane i pasirane svaka 3 – 4 dana u posudama od 100- mm koje sadrže kombinaciju Dulbecco modificiranog Eagleovog (DMEM) i Hams F-12 medija (Welgene, Daegu, Koreja) dopunjen 10% fetalnim goveđim serumom (FBS; Welgene), 100 U/ml penicilinai 100 mg/ml streptomicina (Sigma-Aldrich). TeHK-2 stanice su zatim inkubirane u vlažnoj atmosferisferom od 5% CO2i 95% zraka na 37 stupnjeva 24 h, i subkultivirani do 70 – 80% konfluentnosti. HK-2 stanice su bilenanijeti na 60-mm posude u mediju koji sadrži 10%FBS i inkubirana 24 h. Stanice su tada nastale
Viabilnost stanica
Stanični unos
Protočna citometrija
Analiza protočne citometrije provedena je kao što je prethodno opisano [38]. Za mjerenje razine vezanja aneksina V u skladu s uputama proizvođača korišten je pribor za bojenje aneksina V FLUOS (SigmaAldrich). Ukratko, nakon tretmana s 0 ili 1 mM H2O2 tijekom 24 sata sa ili bez 2 ug PTC-M predtretmana, HK-2 stanice su sakupljene i isprane dva puta prethodno ohlađenom fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom i resuspendirane u puferu za vezanje koji sadrži aneksin V. Nakon inkubacije u mraku tijekom 15 minuta, stanice su analizirane protočnom citometrijom (Becton–Dickinson, San Jose, CA, SAD). Korišteno je nekoliko kontrola za optimizaciju postavki instrumenta i određivanje prolaza za platformu temeljenu na Windowsu. Apoptotičke stanice definirane su kao PI-negativne i Annexin V-FITC pozitivne.
Određivanje intracelularne generacije ROS
Za određivanje stvaranja ROS-a upotrijebili smo fluorofor DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, SAD) kao što je prethodno opisano [38]. HK-2 stanice su inkubirane s 0 ili 1 mM H2O2 tijekom 24 sata sa ili bez 2 ug PTC-M predtretmana, i isprane dva puta s Hankovom uravnoteženom otopinom soli, zatim inkubirane s Hankovom uravnoteženom soli otopina (bez fenol crvenog) koja sadrži DCF-DA 30 minuta na 37 stupnjeva u mraku. Slike su dobivene fluorescentnim mikroskopom (Nikon, Tokyo, Japan).
Pokusne životinje i protokoli
Biodistribucija in vivo
Kako bi se provjerio terapeutski učinak PTC-M in vivo, liječenoj skupini dana je jedna doza od 0.5 mg/kg PTC-M putem injekcije u repnu venu nakon operacije. Miševieutanazirani su nakon 48 sati reperfuzije. Uzorci krvisu prikupljeni od srca, alijevi bubregbio jebrzo ukloniti i obraditi za Western blotting ilifiksiran u 4% otopini paraformaldehida za imunohistokemije (IHC). Thedesni bubregbio smrznut na−80 stupnjevaza analizu lančane reakcije polimerazom (PCR) u stvarnom vremenu.
Mjerenje NGAL u plazmi
Semikvantitativno imunoblotiranje
Western blot analiza provedena je kao što je prethodno opisano [37]. Tkiva bubrega homogenizirana su u ledeno hladnoj otopini za izolaciju koja je sadržavala 0.3 M saharozu, 25 mM imidazola, 1 mM etilendiamintetraoctene kiseline (EDTA), 8,5 mM leupeptina i 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida (pH 7,2). Homogenati su centrifugirani na 4000×g 15 minuta na 4 stupnja kako bi se uklonile cijele stanice, jezgre i mitohondrije. Ukupna koncentracija proteina mjerena je kompletom za ispitivanje bicinhoninske kiseline (BCA) (Pierce; Rockford, IL, SAD). Svi uzorci su podešeni da postignu iste konačne koncentracije proteina. Zatim su otopljeni na 65 stupnjeva tijekom 15 minuta u puferu uzorka koji sadrži natrijev dodecil sulfat (SDS) i pohranjeni na -20 stupnjeva. Kako bi se potvrdilo jednako opterećenje proteinima, početni gel je obojen Coomassie plavim. Elektroforeza u SDS-poliakrilamidnom gelu (PAGE) provedena je na 9 ili 12% poliakrilamidnim gelovima. Proteini su elektroforetski preneseni na nitrocelulozne membrane (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, UK) pomoću aparata Bio-Rad Mini Protean II (Bio-Rad; Hercules, CA, SAD). Mrlje su blokirane s 5% mlijeka u PBS-T (80 mM Na2HPO4, 20 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl i 0,1% Tween-20 na pH 7,5) tijekom 1 sata; inkubiran preko noći na 4 stupnja s primarnim antitijelima; i nakon toga inkubirana sa sekundarnim anti-zečjim, anti-mišjim ili anti-kozjim antitijelima konjugiranim s peroksidazom hrena. Imunoblotovi su zatim vizualizirani korištenjem poboljšanog sustava kemiluminiscencije. Razine proteina kvantificirane su denzitometrijom. Relativni intenziteti imunoblot signala izmjereni su denzitometrijom korištenjem softvera Scion Image za Windows (Scion Corporation, 2000.–2001. verzija Alpha 4.0.3.2. MD, SAD) i izraženi kao promjene puta u odnosu na kontrole. Primarna i sekundarna protutijela koja se koriste u imunoblotingu navedena su u tablici S1.
Lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (PCR u stvarnom vremenu)
Analiza lančane reakcije polimerazom provedena je kao što je prethodno opisano [37]. Bubrežni korteks je homogeniziran u Trizol reagensu (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). RNA je ekstrahirana kloroformom, istaložena izopropanolom, isprana 75% etanolom i zatim otopljena u DW. Koncentracija RNA određena je apsorbancijom na 260 nm (Ultraspec 2000; PharMacia Biotech, Cambridge, UK). Ekspresija mRNA upalnih citokina i adhezijskih molekula određena je PCR-om u stvarnom vremenu. cDNA je napravljena obrnutom transkripcijom 5 ug ukupne RNA upotrebom oligo (dT) priminga i superskripta reverzne transkriptaze II (InvitRogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA je kvantificirana pomoću sustava Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, CA, SAD), a za detekciju je korišten SYBR Green. Svaka PCR reakcija izvedena je u 10 pM prednjeg početnica, 10 pM obrnutog početnica, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japan), 0,5 ul cDNA i H2O da bi se konačni volumen doveo do 20 ul. Relativne razine mRNA određene su PCR-om u stvarnom vremenu, korištenjem detektorskog sustava Rotor-GeneTM 3000 (Corbette Research, Mortlake, NSW, Australija). Sekvencije početnica navedene su u Dodatnoj datoteci 1: Tablica S2. PCR je izveden prema sljedećim koracima: 1) 95 stupnjeva tijekom 5 minuta; 2) 95 stupnjeva 20 s; 3) 58 do 60 stupnjeva tijekom 20 s (optimizirano za svaki par primera) i 4) 72 stupnja tijekom 30 s za otkrivanje SYBR Greena. Koraci 2 – 4 ponovljeni su za dodatnih 40 ciklusa, dok je na kraju posljednjeg ciklusa temperatura povećana sa 60 na 95 stupnjeva kako bi se proizvela krivulja taljenja. Podaci iz reakcije su prikupljeni i analizirani pomoću Corbett Research Software. Usporedne kritične vrijednosti praga iz četverostrukih mjerenja korištene su za izračunavanje ekspresije gena, s normalizacijom na GAPDH kao internu kontrolu. Provedena je analiza krivulje taljenja kako bi se povećala specifičnost reakcije pojačanja.
Histologija
Priprema bubrežnog tkiva odvijala se kao što je prethodno opisano [37]. Bubrežna tkiva su fiksirana s 4% paraformaldehidom, uklopljena u parafin i izrezana na 3-µm debele dijelove. Periodična kiselina-Schif bojanje provedeno je prema uputama proizvođača (Abcam, Cambridge, MA, SAD). Za imunohistokemiju, sekcije deparafiniziranog tkiva dobivene su anti-gen zagrijavanjem na 1{{10}}0 stupnja tijekom 15 minuta u citratnom puferu, pH 6.0 (Sigma- Aldrich). Sekcije su inkubirane preko noći na 4 stupnja s primarnim protutijelima razrijeđenim u puferu za blokiranje (1% [w/v] albumin goveđeg seruma otopljen u 0,3% [v/v] Triton X-100 pripremljen u PBS [0,3% PBS- T]). Nakon što su rezovi nakratko isprani tri puta s 0,3% PBS-T, inkubirani su 1 sat na sobnoj temperaturi sa sekundarnim antitijelima razrijeđenim u puferu za blokiranje. Rezultati tubularne ozljede izračunati su prethodno opisanom metodom [39, 40]. Rezultat ozljede tubula mjeren je ispitivanjem većeg od ili jednakog 10 HPF kortikomedularnog spoja (povećanje × 200) u presjecima obojenim PAS-om (n=5–7). Primarna i sekundarna protutijela korištena u imunohistokemijskim analizama navedena su u tablici S3. Apoptoza tubularnih epitelnih stanica otkrivena je TUNEL bojanjem s ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich), prema uputama proizvođača. Dijelovi tkiva svih glavnih organa sakupljeni su u parafinu i obojeni hematoksilinom/eozinom (H&E) kako bi se usporedile histološke promjene.
Statistička analiza
Rezultati su izraženi kao srednja standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM). Višestruke usporedbe između triju skupina provedene su korištenjem jednosmjerne analize varijance (ANOVA) i post hoc Tukeyjevog testa iskreno signifikantne razlike. Razlike s p-vrijednostima manjim od 0.05 smatrane su značajnima.
