In vitro evaluacija P-gp-posredovanih interakcija lijek-lijek korištenjem RPTEC/TERT1 modela ljudskih bubrežnih stanica
Mar 01, 2022
Uvod In vitro procjena inhibitornog potencijala P-glikoproteina (P-gp) važno je pitanje tijekom procesa razvoja lijeka, budući da omogućuje predviđanje klinički relevantnih interakcija lijek-lijek (DDI) [1-3]. P-gp pripada superporodici transportera kazete koja veže ATP (ABC) i kodiran je genom za otpornost na više lijekova MDR1 (također poznat kao ABCB1). Poznato je da je ovaj membranski transporter prekomjerno izražen u tumorskim stanicama i da uzrokuje otpornost na mnoge lijekove protiv raka [4]. Nalazi se unutar svih fizioloških barijera, uključujući crijeva, jetru ibubrega, P-gp štiti od ksenobiotika ograničavajući apsorpciju ovih supstrata iz probavnog trakta i olakšavajući njihov izljev u žuč i urin. Stoga P-gp igra značajnu ulogu u farmakokinetici različitih terapijskih klasa [5-7]. Poznato je da su mnoštvo lijekova kao što su lijekovi protiv raka, antifungici i kardiovaskularni lijekovi supstrati i/ili inhibitori P-gp-a, a mnogi od njih uključeni su u klinički relevantne interakcije [8-10]. Stoga Američka agencija za hranu i lijekove (FDA) nalaže da se inhibicijski potencijal P-gp-a mora procijeniti tijekom ranih faza razvoja lijeka. In vitro testovi koji se provode u tu svrhu obično se temelje na studijama transporta lijeka korištenjem staničnih linija koje eksprimiraju P-gp. Preciznije, smjernice FDA preporučuju određivanje in vitro vrijednosti polumaksimalne inhibicijske koncentracije (IC50) za procjenu rizika od kliničkih DDI-a koji proizlaze iz inhibicije P-gp-a. U tu su svrhu provedena mnoga eksperimentalna ispitivanja, a većina njih bila je usredotočena na interakcije lijekova povezane s crijevnom apsorpcijom pomoću modela Caco-2 ili MDCK-MDR1 [11-13]
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI
Odbubrežnieliminacija je također uobičajeni put eliminacije za različite klase lijekova, aktivna tubularna sekrecija putem ABC transportera također može igrati ključnu ulogu u ovim interakcijama [14]. Međutim, in vitro podaci obubrežniDDI posredovani P-gp-om su ograničeni. To je djelomično zbog nedostatka razvoja i karakterizacije in vitro modela za predviđanjebubrežnitransport droge. Među različitim linijama ljudskih stanica, RPTEC/TERT1 model izgleda obećavajuće za procjenububrežniinterakcije lijekova. Ova stanična linija potječe od zdravog ljudskog donora i stvorena je iz besmrtnih stanica proksimalnih tubula. Štoviše, ekspresija i funkcionalnost P-gp-a demonstrirani su pomoću ovog modela, čime se potvrđuje njegova sposobnost predviđanjabubrežniefuzije lijekova [15, 16]. U tom kontekstu, ova je studija osmišljena kako bi istražila inhibicijski potencijal P-gp-a pomoću RPTEC/TERT1 modela. Prvo je provedeno ispitivanje nakupljanja rodamina 123 (R123) kako bi se dobio profil inhibicije za svaki testirani lijek. Na temelju ovog pregleda odabrana su četiri lijeka za procjenu njihovih učinaka ovisnih o koncentraciji na intracelularnu akumulaciju dvaju lijekova supstrata P-gp-a: apiksabana i rivaroksabana
Ključne riječi:bubrežne stanice, bubrežni model, bubrežni lijek, bubrežna eliminacija, bubrezi.
Materijali i metode
ReagensiApiksaban, [2H71 3C ] - api xa ban, ri va r oxa ban, [13C6]-rivaroksaban, nilotinib, krizotinib, erlotinib, aksitinib, idelalisib, varfarin i dabigatran eteksilat kupljeni su od Alsachima (Illkirch, Francuska). Verapamil, ketokonazol, simvastatin, amiodaron, rodamin 123, Hankova uravnotežena otopina soli (HBSS) i HEPES otopina kupljeni su od Sigma–Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Francuska).
Kultura stanica Stanice RPTEC/TERT1 dobivene su iz American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Francuska) i uzgojene u hormonski definiranom mediju bez seruma koji se sastoji od Dulbecco modificiranog Eagleovog medija F12 (ATCC) dopunjenog kompletom faktora rasta (ATCC) i 1 posto mješavina antibiotika/antimikotika (penicilin–streptomicin, amfotericin B) na 37 stupnjeva i 5 posto CO 2. Za sve pokuse, stanice su nasađene u 96-pločice s jažicama pri gustoći od 50,000 stanica po jažici i korištene su za rast nakon 14 dana kulture. Medij je obnavljan svaka 2 dana, a stanice su korištene od prolaza 27 do prolaza 34. Caco-2 stanice su također kupljene od ATCC. Stanice su održavane u mediju kulture koji se sastojao od Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Missouri, SAD) nadopunjenog s 10 posto FBS-a, 1 posto neesencijalnih aminokiselina i 1 posto mješavine antibiotika/antimikotika (penicilin-streptomicin, amfotericin B ) na 37 stupnjeva i 5 posto CO2. Caco-2 stanice su nasađene u 96-pločice s jažicama u gustoći od 5 × 10 3 stanica po jažici i korištene su za rast nakon 14 dana kulture. Ljudske proksimalne tubularne epitelne stanice (HPTEC) dobivene su od BIOPREDIC (Rennes, Francuska) i uzgojene u DMEM/F12 s dodatkom hidrokortizona, EGF-a, inzulina, transferina i natrijeva selenita. Stanice su nasađene u 96-pločice za kulture obložene kolagenom pri gustoći od 6600 stanica po jažici i korištene su za rast nakon 11 dana kulture.
Probirni test nakupljanja rodamina 123 Inhibicijski potencijal P-gp-a određen je mjerenjem intracelularne akumulacije rodamina 123 u stanicama RPTEC/TERT1 u prisutnosti i odsutnosti različitih klasa lijekova. Među 14 testiranih lijekova kao inhibitori P-gp-a korišteni su ciklosporin A (10 µM), ketokonazol (50 µM), verapamil (100 µM) i amiodaron (50 µM). Apiksaban, rivaroksaban i dabigatran eteksilat — tri izravna oralna antikoagulansa (DOAC) — korišteni su kao supstrati P-gp (10 µM). Varfarin (50 µM) korišten je kao neinhibitor, a pet lijekova protiv raka, uključujući nilotinib, krizotinib, erlotinib i idelalisib, korišteno je bez poznavanja njihovih profila inhibicije u koncentraciji od 10 µM. Nekoliko je stanja reproducirano sa stanicama Caco-2, koje je FDA odobrila za studije transporta lijekova. Na taj je način određeno unutarstanično zadržavanje rodamina 123 u stanicama Caco-2 u prisutnosti i odsutnosti verapamila (100 µM), ciklosporina A (10 µM), nilotiniba (10 µM) i DOAC-a (10 µM). ). Ukratko, nakon 14 dana kulture u 96-pločicama s jažicama, stanice su prethodno inkubirane 10 minuta na 37 stupnjeva sa svakim lijekom otopljenim u HBSS s 10 mM HEPES (v/v). Zatim su stanice inkubirane s 10 µM rodamina 123 45 minuta na 37 stupnjeva. Konačno, nakon tri ispiranja u hladnoj otopini HBSS/HEPES, stanice su lizirane na sobnoj temperaturi 45 minuta u otopini natrijevog dodecil sulfata (SDS) koja je sadržavala 1 posto natrijevog borata. Količina intracelularnog rodamina 123 je kvantificirana korištenjem nanospektrofuorometra Infnite M (Life Sciences, TECAN, Švicarska), postavljajući valne duljine na 485/535 nm. Podaci su izraženi kao postoci akumulacije rodamina 123 u kontrolnim stanicama koje nisu bile izložene nikakvim potencijalnim inhibitorima P-gp-a i proizvoljno postavljene na 100 posto akumulacije.
DOAC test intracelularne akumulacije i određivanje IC50 Iz prethodnog testa probira rodamina 123 odabrana su četiri lijeka za istraživanje njihovih učinaka ovisnih o koncentraciji na intracelularnu akumulaciju apiksabana i rivaroksabana (10 µM) u stanicama RPTEC/TERT1. Ketokonazol, krizotinib i nilotinib odabrani su kao inhibitori P-gp-a, a varfarin je odabran kao neinhibitor. Ciklosporin A (10 µM) korišten je kao inhibitor širokog spektra prijenosnika. Studije interakcija između DOAC-a i nilotiniba za određivanje vrijednosti IC50 reproducirane su u stanicama Caco-2 kako bi se usporedila dva stanična modela. Svi spojevi su razrijeđeni sami ili s povezanim inhibitorom u HBSS transportnom puferu dopunjenom s 1 posto HEPES (v/v) i 1 posto DMSO (v/v). Prije inkubacije, sve otopine su prethodno zagrijane na 37 stupnjeva i pH je podešen na 7,4. Za lijekove protiv raka krizotinib i nilotinib, zbog njihove slabe topljivosti i citotoksičnog potencijala, koncentracije su bile u rasponu od 0,1 do 25 µM. Za ketokonazol i varfarin, koncentracije su bile u rasponu od 0,1 do 100 µM. Ukratko, nakon 14 dana kulture, svi lijekovi otopljeni u HBSS s 1 posto HEPES (v/v) prethodno su inkubirani 10 minuta na 37 stupnjeva. Zatim su stanice inkubirane s 10 µM apiksabana ili rivaroksabana 60 minuta na 37 stupnjeva. Konačno, nakon tri ispiranja u hladnoj otopini HBSS/HEPES, stanice su lizirane na sobnoj temperaturi 45 minuta u 0,2 postotnoj otopini Tritona X-100. Količina unutarstaničnog DOAC-a zatim je kvantificirana tekućinskom kromatografijom–spektrometrijom mase (LC-MS). Podaci su izraženi kao postotak povećanja akumulacije DOAC-a, a intracelularna akumulacija DOAC-a proizvoljno je postavljena na 100 posto u kontrolnim stanicama. Vrijednosti IC50 za inhibiciju aktivnosti P-gp-a, koje odgovaraju vrijednostima polovice maksimalne učinkovite koncentracije (EC50) za povećanje akumulacije DOAC, određene su iz neponderiranog nelinearnog regresijskog modela najmanjih kvadrata povećane akumulacije s funkcijom 'nls()' u R softvera, prema sljedećoj jednadžbi (jednadžba 1):
Tekućinska kromatografija–analiza masenom spektrometrijomKvantifikacija apiksabana (m/z 460.19793) i rivaroksabana (m/z 436.07285) provedena je pomoću Ultimate U300{{18 }} sustav tekućinske kromatografije (Dionex, Sunnyvale, CA, SAD) spojen s Q-Exactive Plus masenim spektrometrom (ThermoFisher, Bremen, Njemačka). LC odvajanja postignuta su uporabom analitičke kolone Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, SAD) i brzinom protoka od 0,6 mL/min . Mobilna faza A bila je voda s 0.1 posto mravlje kiseline (FA), a mobilna faza B bio je acetonitril s 0.1 posto FA. Za rivaroksaban, gradijent je bio: 0–0.3 min, 10 posto B; 0,3–1 min, linearno od 10 posto do 70 posto B; 1–1,5 min, 70 posto B; 1,51 min, povratak na početne uvjete do 3 min. Za apiksaban, gradijent je bio: 0-0,3 min, 10 posto B; 0,3–0,7 min, linearno od 10 do 90 posto B; 0,7–1,5, 90 posto B; 1,51 min, povratak na početne uvjete do 3 min. Detekcija je provedena u načinu praćenja paralelne reakcije pozitivnim na elektrosprej (PRM) pri razlučivosti od 35,000 (pri m/z 200). Interni standardi (IS) bili su [13C,2H7]-apiksaban (m/z 468,2452) za apiksaban i [13C6]-rivaroksaban (m/z 442,09297) za rivaroksaban. Za svaki lijek i njegov odgovarajući IS praćeni su ciljni ion (za kvantifikaciju) i potvrđujući ion. Za rivaroksaban i njegov IS ciljni ion bio je m/z 144,95125, a potvrđujući ioni bili su m/z 231,11280 odnosno m/z 237,13298. Za apiksaban i njegov IS ciljni ion bio je m/z 199,08656, a potvrđujući ioni bili su m/z 282,12387 odnosno m/z 241,06062.
Rezultati
Probirni test nakupljanja rodamina 123Probirni test nakupljanja rodamina 123 proveden je u stanicama RPTEC/TERT1 s 14 lijekova s različitim profilima inhibicije (slika 1). Očekivano, unutarstanična akumulacija rodamina 123 u prisutnosti ciklosporina A, inhibitora širokog spektra, bila je među najvišima, s povećanjem akumulacije od 75 posto u usporedbi s kontrolnim stanicama. Prisutnost verapamila, specifičnog inhibitora P-gp-a, dovela je do povećanja akumulacije rodamina 123 od 57 posto, pokazujući uključenost P-gp-a. Na isti način, ketokonazol, opisan kao jak inhibitor P-gp-a, doveo je do većeg povećanja (66 posto) intracelularne akumulacije rodamina 123 u usporedbi s verapamilom, potvrđujući njegov profil inhibicije. Nasuprot tome, dodatak amiodarona, koji je karakteriziran kao umjereni inhibitor P-gp-a, izazvao je povećanje nakupljanja od 59 posto, što je slično onom uzrokovanom verapamilom. Uočeni su različiti profili inhibicije za lijekove protiv raka nilotinib, aksitinib, krizotinib, erlotinib i idelalisib. Dodavanje nilotiniba uzrokovalo je snažno povećanje nakupljanja rodamina 123 (71 posto), što ukazuje na značajan inhibicijski potencijal, nakon čega je uslijedio aksitinib, koji je uzrokovao povećanje retencije od 57 posto. S druge strane, krizotinib i erlotinib pokazali su umjeren do nizak inhibitorni potencijal, s povećanjem akumulacije rodamina 123 od 23 posto, odnosno 16 posto. Idelalisib nije utjecao na nakupljanje rodamina 123; isto je vrijedilo i za varfarin koji je
izabran kao neinhibitor. Među tri DOAC-a, apiksaban i rivaroksaban uzrokovali su blago povećanje retencije rodamina 123: 33 posto odnosno 12 posto. Zanimljivo je da je dabigatran eteksilat, predlijek dabigatrana i poznati supstrat P-gp-a, uzrokovao povećanje retencije rodamina 123 od oko 50 posto, iako nije opisan kao potencijalni inhibitor P-gp-a. Konačno, dodatak simvastatina uzrokovao je samo blagi porast nakupljanja fluorescentnog supstrata (32 posto). Na temelju ovog pregleda odabrana su četiri lijeka za procjenu njihovih učinaka ovisnih o koncentraciji na intracelularnu akumulaciju apiksabana i rivaroksabana unutar RPTEC/TERT1 modela. Ketokonazol je odabran kao uvjet pozitivne kontrole za inhibiciju P-gp-a, a varfarin je odabran kao ne-inhibitor P-gp-a za uvjet negativne kontrole. Nilotinib i krizotinib odabrani su kao jaki odnosno umjereni inhibitori P-gp-a. Nekoliko uvjeta reproducirano je s referentnim modelom, Caco-2. Intracelularna akumulacija R123 u stanicama određena je nakon kombinacije (ili ne) s apiksabanom i rivaroksabanom (10 µM), nilotinibom (10 µM), te s ciklosporinom A (10 µM) i verapamilom (100 µM) za kontrolne uvjete za inhibiciju (Slika 2A). Kao što se očekivalo, verapamil i ciklosporin A uzrokovali su velika povećanja retencije R123 od 297 posto, odnosno 275 posto. Na isti način, nilotinib je izazvao veliki porast intracelularne akumulacije R123 (229 posto), potvrđujući njegov inhibitorni potencijal. Kombinacija R123 s DOAC rezultirala je manjim povećanjem nakupljanja R123 (40-44 posto) u usporedbi s drugim lijekovima. Štoviše, intracelularno nakupljanje rodamina 123 u odsutnosti i prisutnosti ciklosporina A ububrežniprimarne ljudske stanice također su istražene u ovoj studiji kako bi se provjerila pouzdanost rezultata dobivenih sa stanicama RPTEC/TERT1 (slika 2B). Ove analize su pokazale da je prisutnost ciklosporina A povećala retenciju R123 za 71 posto. Ta je vrijednost bila bliska onoj dobivenoj pod istim uvjetima sa stanicama RPTEC/TERT1 (povećanje od 75 posto s ciklosporinom A). Stoga je aktivnost P-glikoproteina bila slična u RPTEC/TERT1 modelu i primarnim ljudskim stanicama.
DOACs test intracelularne akumulacije: određivanje omjera IC50 i I1/IC50 Provedene su studije unutarstanične akumulacije za procjenu transporta apiksabana i rivaroksabana posredovanog P-gp-om pri konstantnoj koncentraciji od 10 µM u stanicama RPTEC/TERT1 in vitro i u prisutnosti rastućih koncentracija nilotiniba, krizotiniba, ketokonazola i varfarin (sl. 2, 3). Procijenjeno je modeliranje povećanog zadržavanja apiksabana i rivaroksabana kako bi se odredile vrijednosti IC50. Kombinacija DOAC-a s nilotinibom dovela je do najnižih vrijednosti IC50: 0,85 µM i 1,37 µM za rivaroksaban, odnosno apiksaban (slike 4, 5). Kombinacija s krizotinibom dala je IC50 vrijednosti od 10,1 µM i 12,2 µM za rivaroksaban, odnosno apiksaban. Iznenađujuće, kombiniranje DOAC-a s ketokonazolom nije proizvelo najniže vrijednosti IC50 (16,5 µM odnosno 16,9 µM za rivaroksaban i apiksaban). Konačno, očekivano, kombinacija s varfarinom, koja je bila
izabran kao neinhibitor, nije utjecao na unutarstanična zadržavanja dvaju DOAC-ova. Intracelularno nakupljanje i apiksabana i rivaroksabana unutar stanica Caco-2 u prisutnosti rastućih koncentracija nilotiniba stoga je istraženo za usporedbu sa staničnim modelima. Zanimljivo, kao što je primijećeno modelom RPTEC/TERT1, vrijednost IC50 za rivaroksaban (4,16 µM) bila je niža od one dobivene za apiksaban (9,35 µM). Također je zanimljivo primijetiti da su vrijednosti IC50 opažene u Caco-2 stanicama bile više od onih dobivenih u RPTEC/TERT1 stanicama za isti inhibitor. Klinička važnost DDI može se predvidjeti iz in vitro podataka. Prema smjernicama FDA, omjeri [I1]/IC50 izračunati su za svaku kombinaciju lijekova. Ovaj omjer omogućuje usporedbu koncentracija in vivo s onima za koje je poznato da proizvode relevantan učinak in vitro. Za apiksaban u stanicama RPTEC/TERT1 omjeri su bili 3,1, 0,06 i 17,4 s nilotinibom, krizotinibom i ketokonazolom (Tablica 1). U stanicama Caco-2 omjer [I1]/IC50 bio je 0,46 za interakciju između apiksabana i nilotiniba (Tablica 1). Za rivaroksaban, omjeri su bili nešto viši od onih dobivenih za apiksaban u stanicama RPTEC/TERT1: 5,1, 0,08 i 17,7, redom, za nilotinib, krizotinib i ketokonazol (Tablica 2). Na isti način, omjer [I1]/IC50 opažen za interakciju između rivaroksabana i nilotiniba u stanicama Caco-2 bio je 1,03, što je bilo više od onog dobivenog za apiksaban (Tablica 2).
Rasprava
Brojna istraživanja provedena posljednjih desetljeća pokazala su značajnu ulogu P-gp-a u farmakokinetici lijekova [17-19]. S obzirom na sve veći regulatorni interes za interakcije lijekova posredovane P-gp-om, in vitro testovi za ispitivanje inhibitornog potencijala lijekova važan su aspekt razvoja lijekova i kliničke prakse. U tu su svrhu provedena mnoga in vitro ispitivanja, a većina povezanih podataka o predviđenoj intestinalnoj apsorpciji dobivena je iz staničnih linija Caco-2 i MDCK-MDR1 [20-22]. Međutim, malo je podataka dostupno o aktivnoj tubularnoj sekreciji lijekova, koja također ima ključnu ulogu u dispoziciji lijeka i ovisi o prisutnosti ABC transportera. Ovo zapažanje jasno je povezano s nedostatkom karakterizacijebubrežnistanične linije za predviđanje lijekovabubrežniistok Ovaj cilj zahtijeva in vitrobubrežnimodel koji blisko oponaša fiziološku barijeru. Čini se da je ljudska stanična linija RPTEC/TERT1, koja eksprimira nekoliko ABC transportera (osobito P-gp), dobra alternativa, kao što je pokazano u prethodnoj studiji [16]. U tom kontekstu, ovaj rad istraživao je primjenu modela RPTEC/TERT1 za procjenu inhibitornog potencijala P-gp-a. Koliko znamo, ovo je prvo djelo koje daje podatke iz studija inhibicije P-gp-a na ljudimabubrežniStanice.
In vitro testovi za određivanje inhibitornog potencijala P-gp-a obično se temelje na upotrebi specifičnog referentnog supstrata P-gp-a, kao što je digoksin ili rodamin 123 [23-25]. Zbog svoje jednostavne upotrebe, fluorescentne sonde su korisne za testove visoke propusnosti. Štoviše, rodamin 123 naširoko je primjenjivan za otkrivanje aktivnosti P-gp-a u širokom rasponu studija [26-28]. Na taj su način u ovoj studiji provedeni testovi nakupljanja rodamina 123 u stanicama RPTEC/TERT1 kako bi se identificirali profili inhibicije 14 lijekova. Među tim lijekovima, ciklosporin A, ketokonazol i verapamil odabrani su kao jaki inhibitori P-gp. Ovi inhibitori su opsežno karakterizirani zbog svog značajnog inhibitornog potencijala za P-gp, što dovodi do modulacije transporta i digoksina i rodamina 123 [27, 29, 30]. Kao što se i očekivalo, ti su lijekovi uzrokovali najveće zadržavanje rodamina 123 u stanicama RPTEC/TERT1. Nasuprot tome, nije primijećeno povećanje retencije R123 s varfarinom, koji je korišten kao negativna kontrola, potvrđujući pouzdanost RPTEC/TERT1 modela. Zanimljivo je da su među svim ispitanim lijekovima DOAC-i—uključujući dabigatran eteksilat, apiksaban i rivaroksaban—prouzročili jasno povećanje retencije R123, iako prethodno nisu bili okarakterizirani kao inhibitori, već samo kao supstrati P-gp [31, 32]. Ovo zapažanje može biti posljedica postojanja takozvane "kompetitivne" inhibicije, gdje lijekovi mogu djelovati s istim veznim mjestima na P-gp. Najdobro karakterizirana mjesta za P-gp su H mjesto (za vezanje Hoechsta 33342) i R mjesto (za vezanje rodamina 123). Međutim, više drugih nepoznatih mjesta vezanja lijeka moglo bi igrati ulogu u tim interakcijama, što bi moglo objasniti različite učinke DOAC-a na nakupljanje R123 [33, 34]. Inhibicija P-gp-a opažena za određeni lijek stoga ovisi o supstratu korištenom tijekom in vitro studija [28, 35]. Korištenje različitih supstrata P-gp-a koji stupaju u interakciju s različitim mjestima vezanja lijeka stoga treba razmotriti kako bi se točno opisala pretpostavljena inhibicijska moć lijekova za P-gp. Također je zanimljivo primijetiti da je nekoliko uvjeta iz probira rodamina 123 također provedeno u Caco-2 stanicama kako bi se usporedile RPTEC/TERT1 stanice s referentnim modelom u studijama transporta lijeka. Kao što se očekivalo, ciklosporin A, verapamil i nilotinib uzrokovali su najveći porast retencije rodamina. Isti profili inhibicije primijećeni su s Caco-2 i RPTEC/TERT1 stanicama. Međutim, povećanja u retenciji rodamina 123 generirana interakcijama u modelu Caco-2 bila su veća od onih uočenih u RPTEC/TERT1 stanicama, što ukazuje na potencijalnu razliku u ekspresiji P-glikoproteina između modela. Stoga, u sadašnjosti U studiji je korištena druga metoda za procjenu i potvrdu potencijalne inhibicije P-gp lijekovima.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREŽNU DIJALIZU
Na temelju testa akumulacije rodamina 123, odabrana su četiri lijeka kako bi se odredili njihovi učinci ovisni o koncentraciji na unutarstanično nakupljanje apiksabana i rivaroksabana. Pokazalo se da P-gp igra glavnu ulogu u istjecanju apiksabana i rivaroksabana [32, 36]. Stoga su procijenjene IC50 vrijednosti nilotiniba, krizotiniba i ketokonazola, pri čemu su DOAC odabrani kao lijekovi "žrtve". Koliko znamo, ovo je prvo istraživanje koje je provelo studije intracelularne akumulacije DOAC-a u ljudibubrežniStanice. Vrijednosti IC50 dobivene za nilotinib i krizotinib bile su u skladu s njihovim profilima inhibicije dobivenim iz analize nakupljanja rodamina 123. Nilotinib, koji je izazvao snažno povećanje zadržavanja R123, pokazao je najnižu vrijednost IC50 za dva DOAC-a, potvrđujući njegov visok inhibicijski potencijal. Ovaj je rezultat također u skladu s prethodnom studijom koja je pokazala porast unutarstanične akumulacije [3H]-paklitaksela u MDR1-transficiranim stanicama ovisan o koncentraciji, što sugerira da ima inhibitorni profil [37]. Za krizotinib, analiza R123 pokazala je umjeren inhibitorni potencijal, s manjim povećanjem retencije R123 od onog uzrokovanog nilotinibom. Ovo zapažanje podupire prethodna studija u kojoj je krizotinib povećao intracelularnu akumulaciju R123 i doksorubicina u MDR1-transficiranim stanicama [38]. Ovaj je rezultat također u skladu s vrijednostima IC50 određenim DOAC-ovima, koje su bile više od odgovarajućih vrijednosti za nilotinib, potvrđujući njegov umjereni profil inhibicije. Međutim, zanimljivo je primijetiti da koncentracija od 10 µM nilotiniba ili krizotiniba nije uzrokovala ista povećanja u retenciji rodamina 123 i DOAC-a. U skriningu rodaminom, nilotinib je povećao zadržavanje supstrata za oko 71 posto, dok je to bilo oko 40 posto za DOACs. Nasuprot tome, krizotinib je izazvao mali porast u retenciji rodamina (23 posto), ali veći porast u retenciji DOAC-a (oko 50 posto) pri istoj koncentraciji. Kao što je prethodno objašnjeno, ovo opažanje se može objasniti razlikama u veznim mjestima na P-gp. Poznato je da mnogi lijekovi stupaju u interakciju i natječu se s H veznim mjestom, a ne s R veznim mjestom (gdje se veže rodamin 123), i obrnuto [39]. Zanimljivo je da je ketokonazol, koji je poznat kao jak inhibitor P-gp-a, izazvao nešto manji porast retencije rodamina 123 od nilotiniba (66 posto u odnosu na 71 posto). Unatoč tome, slična je vrijednost primijećena kod Caco-2 stanica, gdje je prisutnost ketokonazola uzrokovala povećanje od 60 posto u akumulaciji R123 [40]. Intracelularna akumulacija DOAC-a za određivanje vrijednosti IC50 također je pokazala više vrijednosti u usporedbi s nilotinibom i krizotinibom. Zanimljivo je da je većina IC50 vrijednosti pronađenih u modelima LLC-PK1 ili Caco-2 koji koriste digoksin kao supstrat P-gp bila između 3 i 4 µM za ketokonazol [41, 42]. Ove se vrijednosti prilično razlikuju od onih pronađenih u ovoj studiji (16,5 µM i 16,9 µM s apiksabanom, odnosno rivaroksabanom). Ovo zapažanje potvrđuje da su odabiri supstrata i korištenog modela ključni utjecaji pri određivanju inhibitornog potencijala P-gp-a. Dodatno, nedavna studija je objavila da razine ekspresije ABC transportera u in vitro staničnim modelima imaju utjecaj na testove prijenosa lijeka i stoga na procjenu DDI-ja koji se odnose na P-gp [43]. Doista, određivanje IC50 vrijednosti za verapamil korištenjem rivaroksabana kao P-gp supstrata otkrilo je heterogenost između modela stanica MDCKMDR1 i Caco-2, s IC50 vrijednostima od 6,94 µM odnosno 21,2 µM [43]. Nadalje, učinak nilotiniba ovisan o koncentraciji na intracelularnu akumulaciju apiksabana i rivaroksabana također je istražen u stanicama Caco-2 u ovoj studiji. Zanimljivo je da su vrijednosti IC50 za nilotinib bile značajno više u stanicama Caco-2 nego u stanicama RPTEC/TERT1. Ovo opažanje može se objasniti razlikom u ekspresiji P-gp između ovih modela. Osim toga, poznato je da distribucija P-gp ovisi o razmatranom tkivu. Fallon i sur. pokazalo je da je razina P-gp viša ububregnego u tkivu jetre kod ljudi [45]. S druge strane, čini se da je razina ekspresije P-gp viša u crijevima nego ububregtkiva [46]. Korištenje ljudskih stanica kao što je RPTEC/TERT1 model, koje ne eksprimiraju pretjerano prijenosnike, stoga bi moglo pružiti dodatne podatke. Ti se podaci mogu koristiti i imputirati u fiziološki utemeljenom farmakokinetičkom modeliranju (PBPK) integriranjem nekoliko parametara, kao što je količina P-gp u modelu tkiva ili in vitro ili IC50 vrijednosti.
Iako su vrijednosti IC50 pronađene za ketokonazol u RPTEC/TERT1 modelu bile više od onih zabilježenih u literaturi, omjer [I1]/IC50—potvrđen kao prediktor potencijalnih klinički relevantnih DDI-ja za oralno davane lijekove—pokazao je visoke vrijednosti koje su bile iznad praga od 0,1 koji je definirala FDA. Ovaj je rezultat u skladu s kliničkom studijom koja je pokazala dvostruko povećanje izloženosti apiksabanu uz istodobnu primjenu ketokonazola [44]. Uzeti zajedno, svi ovi rezultati pokazuju da je model RPTEC/TERT1 obećavajući alat za procjenu inhibitornog potencijala P-gp-a.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLOVE BUBREGA/BUBREGA
Zaključak
Naša je studija pokazala da je primjena RPTEC/TERT1 modela prikladna za procjenu P-gp inhibicijskih potencijala različitih klasa lijekova. Testovi nakupljanja rodamina 123 omogućili su izvođenje početnog probira lijeka. Međutim, inhibicijski potencijal P-gp-a lijekova koji ne stupaju u interakciju s R mjestom P-gp-a također se mora istražiti korištenjem dodatnih supstrata kako bi se potvrdila predviđanja. Vrijednosti IC50 određene iz intracelularne akumulacije apiksabana i rivaroksabana u skladu su s profilima inhibicije opaženim s rodaminom 123. Štoviše, uporaba ketokonazola i varfarina kao snažnog inhibitora i neinhibitora P-gp-a potvrdila je pouzdanost RPTEC/TER1 modela kada se koristi za dobivanje in vitro podataka o inhibicijskim potencijalima lijekova prema P-gp. Konačno, usporedba rezultata dobivenih uporabom RPTEC/TERT1 modela s onima dobivenim korištenjem Caco-2 stanica istaknula je važnost provođenja in vitro studija na različitim staničnim modelima kako bi se potvrdio inhibitorni profil za određeni lijek.
