SAŽETAK

Ciljevi:Maclura pomifera (Rafin.) Schneider je široko rasprostranjena vrsta diljem svijeta, koja se također često uzgaja u ukrasne svrhe. Prethodne studije otkrile su da su plodovi M. pomifera bogati preniliranim izoflavonoidima, pokazuju značajne biološke aktivnosti i imaju vjerojatne prednosti, osobito kada se primjenjuju lokalno. Uzimajući u obzir da su fenolni spojevi ključni izvori u razvoju kozmetičkih proizvoda protiv starenja, ova je studija istraživala potencijal protiv starenja 80-postotnog metanolnog ekstrakta M. pomifera (MPM) procjenom inhibicije antioksidansa i enzima koji razgrađuju izvanstanični matriks.

Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnom tkivu eksperimentalno starih miševa uzrokovanu D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i ima sposobnost hvatanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.

Kliknite na dodatak Cistanche Tubulosa

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Materijali i metode:Za ovu studiju procijenjen je inhibicijski potencijal 80 posto MPM protiv različitih enzima povezanih s procesom starenja. S obzirom na nedvojbenu ulogu oksidativnog stresa u starenju, primijenjena su i in vitro ispitivanja antioksidansa. Štoviše, analizom tankoslojne kromatografije visoke učinkovitosti osajin je određen kao glavni bioaktivni izoflavonoid uzorka.

Rezultati:Rezultati mehanički različitih ispitivanja antioksidansa pokazali su značajan antioksidativni potencijal ekstrakta. Potencijal inhibicije MPM-a protiv enzima hijaluronidaze, kolagenaze i elastaze, koji su izravno povezani s ubrzanjem procesa starenja, istražen je i rezultati su otkrili da MPM eksplicitno inhibira gore navedene enzime. MPM je imao jedinstven sadržaj fenola i flavonoida; 113,92 ± 2,26 mg ekvivalenta galne kiseline/g odnosno 66,41 ± 0,74 mg QE/g. Kada se uzmu u obzir testovi ukupnog antioksidativnog kapaciteta, moguće je sugerirati da je MPM obećavajuće sredstvo protiv starenja.

Zaključak:Kao rezultat toga, ova studija otkriva da ekstrakti plodova M. pomifera imaju značajan potencijal protiv starenja i mogu se koristiti u tu svrhu.

Ključne riječi:Maclura pomifera, protiv starenja, antioksidansi, HPTLC, osajin

UVOD

Isto tako, svi organi, uključujući ljudsku kožu, s godinama prolaze kroz različite fiziološke promjene.1 Postoje dvije klase starenja: intrinzično starenje kontrolira genetika, a ekstrinzično je starenje prirodan rezultat fizioloških promjena zbog štetnih učinaka čimbenika iz okoliša poput ultraljubičastog (UV) ) zračenje, kemijski toksini i pušenje.1,2 Degradacija vaskularne i žljezdane strukture, gubitak fibroznog tkiva i smanjena regeneracija stanica temeljni su čimbenici starenja,3 koji dovode do povećanja degeneracije tkiva, bora i smanjenja izvanstaničnog matriksa (ECM ).4

Kao najveći organ, koža ima nekoliko uloga kao što su zaštita, regulacija tjelesne temperature i detekcija osjetila.5 Koža se sastoji od epidermisa, dermisa i potkožnog tkiva i prva je barijera između ljudskog tijela i vanjskog okoliš.6,7 ECM je najveća jedinica dermisa i podupire rast i elastičnost predstavljajući strukturnu skelu.8 Kolagen, elastin i fibronektin, koje tvore dermalni fibroblasti, čine ECM i spojeni su s proteoglikanima.5 Kolagen je osnovni protein koji čini približno 25-35 posto ukupnog sadržaja proteina u tijelu i nalazi se u izvanstaničnom prostoru raznih vrsta životinjskih vezivnih tkiva.3 Jedan od glavnih uzroka starenja kože i stvaranja bora je promjena kolagena struktura.1 Elastin je protein koji koži daje jedinstvenu fiziološku elastičnost i prisutan je u nekoliko vezivnih tkiva.6 Hidratacija kože i održavanje kože glatkom, vlažnom i podmazanom važni su čimbenici koji sprječavaju starenje kože i glavni glikozaminoglikan (GAG), hijaluronska kiselina, igra vitalnu ulogu u tim aktivnostima.8 Ove ključne sastojke razgrađuju enzimi hijaluronidaza, kolagenaza i elastaza, što dovodi do ubrzanja starenja kože. Štoviše, izloženost mikroorganizmima, zagađenju, ionizirajućem zračenju, kemikalijama i toksinima dovodi do stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), a njegove štetne posljedice ubrzavaju starenje kože.9 ROS može pokrenuti složene molekularne putove i kao rezultat kolagenaze, elastaze , a aktivnost hijaluronidaze može se povećati, što dovodi do vidljive razgradnje ECM-a i promjena teksture kože.10 Iz navedenih razloga, novi prirodni agensi, koji smanjuju stvaranje ROS-a i inhibiraju proteaze koje razgrađuju ECM, mogu odgoditi proces starenja kože.11

Maclura pomifera (Rafin.) Schneider pripada Moraceae ili obitelji dudova, a poznata je i kao drvo naranče, uzgaja se gotovo diljem svijeta.12 M. pomifera ima nekoliko bioloških aktivnosti poput antibakterijskih, antifungalnih, antivirusnih, citotoksičnih, antitumorskih, estrogenih, i antimalarik13 zbog svojih preniliranih izoflavona, tj. osajina i pomiferina, koji se smatraju glavnim metabolitima voća.14 U kozmetičkoj proizvodnji protiv starenja, fenolni spojevi značajni su prirodni izvori. Stoga postoji sve veći interes za proučavanje biljaka bogatih fenolnim spojevima kao što je M. pomifera za takve aktivnosti. Prethodne studije su otkrile da izoflavoni Maclure povećavaju razine ekspresije kolagena, elastina i fibrilina usporedive ili veće od ekvivalentnih koncentracija retinola. Stoga se može pretpostaviti da su Maclura izoflavoni snažni stimulansi ECM proteina.15 Uzimajući u obzir ove podatke, ova studija ima za cilj istražiti potencijal protiv starenja 80-postotnog metanolnog ekstrakta M. pomifera (MPM) istražujući njegov potencijal za antioksidacijsku bioaktivnost i inhibiciju Enzimi koji razgrađuju ECM. Dodatno, kvantitativna analiza glavne bioaktivne komponente ekstrakta, osajina, izmjerena je tankoslojnom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPTLC), a provedene su analize ukupnog sadržaja fenola i ukupnog sadržaja flavonoida za točnije razumijevanje fenolnog profila. Rezultati pokazuju da bi M. pomifera mogla biti vrijedan izvor proizvoda protiv starenja.

MATERIJALI I METODE

Kemikalije

Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SAD) osigurala je sve enzime, kemikalije i reference korištene u testovima. Kvaliteta svih kemikalija bila je analitičke razine.

Biljni materijal

Plodovi M. pomifera sakupljeni su iz Uşaka u Turskoj u svibnju 2020. Dr. Hilal Bardakcı provela je postupak botaničke identifikacije biljnih uzoraka. Uzorak vaučera biljke pohranjen je na Sveučilištu Acıbadem, Herbarij Farmaceutskog fakulteta (ACUPH 00002).

Priprema ekstrakata

Plodovi su odvojeni u male komadiće i prošli kroz blender. Plodovi (6,45 kg) macerirani su s 3125 mL 80 postotnog metanola (MeOH) mućkalicom tri dana na sobnoj temperaturi na tamnom mjestu. Macerat je filtriran i postupak je ponovljen dva puta. Dobiveni filtrati su skupljeni zajedno, a zatim je metanol uparen u rotacijskom uparivaču. Sirovi metanolni ekstrakt je liofiliziran (prinos je bio 204,37 g, 3,16 posto) i pohranjen na -20 stupnjeva (MPM).

Postupak kvantifikacije glavnih bioaktivnih spojeva pomoću HPTLC

Sve korištene kemikalije i reagensi bili su analitičke kvalitete. Kloroform (CHCl3) i etil acetat (EtOAc) nabavljeni su od Sigma-Aldrich. Komercijalno dostupan standard osajina kupljen je od Sigma-Aldrich (SMB {{10}}0092). HPTLC analize provedene su na staklenim pločama HPTLC silika gel 60 F254 veličine 20 cm × 10 cm (Merck, Darmstadt, Njemačka). Sadržaj osajina u MPM određen je analitičkim sustavom CAMAG HPTLC. Mobilnu fazu korištenu u ovoj studiji prethodno su opisali Bozkurt i sur.16 tijekom izolacije aktivnih principa M. pomifera. 10 mg/mL ekstrakta MeOH korišteno je kao testna otopina za analizu. Standardna matična otopina (0,5 mg/mL) osajina pripremljena je upotrebom 2 mL acetona. Radna otopina s koncentracijom standardnog spoja od 50 µg/mL pripravljena je razrjeđivanjem acetonom iz osnovne otopine. Svaki uzorak je filtriran kroz filtar štrcaljke od 0,45 µm. 10 μL ekstrakta zajedno s najmanje pet različitih koncentracija standardne otopine (3.3-4.7 μL) naneseno je u obliku traka duljine 8 mm na HPTLC ploče od silika gel stakla 60 F254 s CAMAG Automatic TLC uzorkivač IV. Razvijanja su provedena u CAMAG komori za automatsko razvijanje-2 (ADC- 2), a mobilna faza je bila CHCl3:EtOAc [8:2 (v/v)]. Komora je zasićena 10 minuta, a ploča je predkondicionirana 5 minuta prije razvijanja. Vlažnost je kontrolirana pomoću ADC-2 pomoću MgCl2 (33 posto RH) tijekom 10 minuta. Denzitometrijska procjena provedena je pomoću CAMAG TLC Scannera IV u fluorescentnom načinu rada. Dimenzija proreza održavana je na 5 × 0,2 mm, mikro, a brzina skeniranja postavljena je na 20 mm/s. Standardni sadržaji dobiveni su usporedbom površine ispod krivulja radnih karakteristika prijamnika (AUC) s kalibracijskom krivuljom standarda na 280 nm. Prisutnost standarda u ekstraktu je osigurana usporedbom retencijskih faktora (Rf) i preklapajućim UV spektrima svakog ekstrakta i standarda. Količina osajina određena je usporedbom intenziteta difuzno reflektirane svjetlosti ekstrakta i frakcija sa standardnim spojem.

Sadržaj osajina u sirovom biljnom ekstraktu mjeren je HPTLC-denzitometrijom. Utvrđeno je da Rf vrijednost osajin standarda iznosi 0.556. Pojava osajina u ispitivanim uzorcima potvrđena je usporedbom njihovih Rf vrijednosti i preklapanjem njihovih UV spektara (Slika 1). Kvantifikacija je omogućena usporedbom AUC uzoraka s kalibracijskom krivuljom dobivenom korištenjem standardnog spoja osajina. Funkcija kalibracije bila je y=2.268*10-8x. Koeficijent korelacije (R) i koeficijent varijacije kalibracijske funkcije bili su 0.998 posto odnosno 1.06 posto. HPTLC analiza je pokazala da MPM sadrži 0,22 posto (w/w) osajina. Rezultati HPTLC studije dani su u tablici 1.

Određivanje fenolnog profila

Određivanje ukupnog sadržaja fenola

Test je proveden kako bi se procijenio ukupni sadržaj fenola u uzorcima Folin-Ciocalteuovom metodom, koju su prethodno koristili Kurt-Celep et al.17 20 μL svježe razrijeđene otopine uzorka pomiješano je sa 75 μL Na2 CO3 (20 posto ), i 100 μL FCR (Folin-Ciocalteu reagens) razrijeđeno s H2O (1:9). Nakon inkubacije od 30 minuta na 45 stupnjeva, apsorbancija smjesa je očitana spektrofotometrijski na 765 nm. Rezultati su izraženi kao mg ekvivalenata galne kiseline (GAE) po g ekstrakta.

Određivanje ukupnog sadržaja flavonoida

Mjerenje ukupnog sadržaja flavonoida u frakcijama učinjeno je prema metodi koju su prethodno objavili Bardakci et al.18 Sažeto, svježe pripremljeni 1 M CH3 COONa i 10 posto AlCl3 pomiješani su s uzorcima. Zatim je provedena 30 min inkubacije smjesa na sobnoj temperaturi iu mraku. Nakon procesa inkubacije izračunata je apsorbancija na 415 nm. Rezultati su iskazani kao mg ekvivalenta kvercetina (QE) u 1 g uzorka.

Određivanje in vitro antioksidativne aktivnosti

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) test aktivnosti hvatanja radikala

Da bi se odredila aktivnost hvatanja radikala DPPH, učinjena je kombinacija svježe razrijeđenih otopina uzoraka (različite koncentracije pripremljene iz osnovne otopine od 1 mg/mL) i metanolne otopine DPPH (100 mM). Nakon intervala inkubacije na sobnoj temperaturi od 45 minuta, očitana je apsorbancija na 517 nm. Butilirani hidroksitoluen (BHT) korišten je kao referentni spoj za dobivanje kalibracijske krivulje. IC50 vrijednosti rezultata iskazane su kao µg/mL.19

Test reducirajuće antioksidativne snage željeza (FRAP).

Za dobivanje FRAP reagensa, 25 mL 300 mM acetatnog pufera (pH 3,6), 2,5 mL TPTZ [2,4,6-tris (2-piridil)-s-triazina] i pomiješano je 2,5 mL FeCl3.6H20 (20 mM). Nakon toga, 10 mL uzorka je dodano u 260 mL FRAP reagensa i razrijeđeno do 300 mL s destiliranom vodom u ploči s 96 jažica. Nakon inkubacije od 30 minuta na 37 stupnjeva, mjerenje apsorbancije je provedeno na 593 nm. BHT je korišten kao referentni spoj. Otopina željezovog klorida (0,252 mM) korištena je za dobivanje standardne krivulje, a rezultati su dati kao mM FeSO4 u 1 g suhog ekstrakta.20

Bakreno-reducirajući antioksidativni kapacitet (CUPRAC) test

CUPRAC test je procijenjen u skladu s metodom koju su prije opisali Barak et al.21 Jednaki volumeni 10 mM CuSO4, neokupraina i amonijevog acetatnog pufera (85 mL) pomiješani su u 96-ploči s jažicama. Nakon toga u smjesu je dodano 51 mL destilirane vode, odnosno 43 mL otopine uzorka. Nakon inkubacije od 20 minuta, očitana je apsorbancija na 450 nm. Rezultati su iskazani kao mg ekvivalenta askorbinske kiseline u 1 g suhog ekstrakta.

Određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta (TOAC) test

Test ukupnog antioksidativnog kapaciteta izračunat je u skladu s fosfomolibdenovom metodom koju su ranije objasnili Barak i sur.22 Prvo, da se dobije otopina TOAC; Pomiješano je 28 mM monobaznog natrijevog fosfata, 4 mM amonijevog molibdata i 600 mM H2S04. Zatim je 300 µL otopine TOAC-a pomiješano s 30 µL otopine uzorka u 96 zdravoj ploči. Nakon perioda inkubacije na 95 stupnjeva tijekom 90 minuta, očitana je apsorbancija na 695 nm. Askorbinska kiselina korištena je za dobivanje standardne krivulje, a rezultati su izračunati kao mg Trolox ekvivalenta u 1 g suhog ekstrakta.

Inhibicijsko djelovanje na enzime povezane sa starenjem kože

Djelovanje protiv kolagenaze

Za mjerenje anti-kolagenazne aktivnosti MPM-a, pripremljena je 50 mM otopina tricinskog pufera (pH: 7,5) (400 mM NaCl i 10 mM CaCl2). Kao izvor kolagenaze korišten je Clostridium histolyticum (ChC - EC. 3.4.23.3), koji je otopljen u 50 mM otopini tricinskog pufera da se postigne početna koncentracija od 0,8 U/mL. Kao supstrat korišteno je 2 mM N-[3-(2-furil)akriloil]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) otopljenog u tricin puferu. Ekstrakti su inkubirani s enzimom kolagenazom u otopini pufera 15 minuta prije dodavanja supstrata za početak reakcije. Konačna reakcijska smjesa sadržavala je ukupni volumen od 150 uL; tricinski pufer, 0,8 mM FALGPA, 0,1 jedinica ChC i 25 μL MPM. Za slijepe rezultate korištena je voda. Nakon dodavanja supstrata, odmah je izvršeno mjerenje apsorbancije. Pozitivne kontrole izvedene epigalokatehin galat (EGCG).23

Djelovanje protiv elastaze

Procjena MPM za aktivnost protiv elastaze provedena je korištenjem 0.2 mM Tris-HCl puferske otopine (pH: 8.0). Osnovna otopina elastaze (PE, EC 3.4.21.36) dobivena iz svinjskog pankreasa pripremljena je s destiliranom vodom u koncentraciji od 3,33 mg/mL. N-Sukcinil-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN) koji se koristi kao supstrat otopljen je u puferskoj otopini (1,6 mM). MPM ekstrakt je inkubiran s 1 µg/mL PE 15 minuta na 37 stupnjeva prije dodavanja supstrata. Na kraju predinkubacije od 15 minuta, 0.8 mM AAAPVN supstrat dodan je u smjesu enzima koja je sadržavala 1 mg/mL biljnog ekstrakta, a inkubacija je ponovno izvedena 15 minuta na 37 stupnjeva. Dok se koristi 0.25 mg/mL EGCG kao pozitivna kontrola, ovaj ispitni uzorak sadrži isti volumen EGCG umjesto MPM, a postavka testa je ponovljena. Nakon perioda inkubacije, mjerenja su obavljena u 4 različite vremenske točke od 5 do 30 minuta Thermo Scientific Multiskan SkyHigh Microplate spektrofotometrom pri 365 nm ekscitaciji i 410 nm emisiji.24, 25

Antihijaluronidazno djelovanje

Djelovanje protiv hijaluronidaze izvedeno je modificiranjem metode koju su opisali Kolayli et al.26 i Lee et al.3 Prvo, komercijalno kupljena hijaluronidaza (EC 3.2.1.35, Sigma-Aldrich) otopljena je u 0. 02 M fosfatni pufer (pH: 3,5) koji sadrži NaCl i goveđi serum albumin. Zatim je hijaluronska kiselina, odgovarajući supstrat enzima, pripremljena u acetatnom puferu (0.1 M, pH: 3,5) i spremna za upotrebu. Ispitna smjesa koja se sastoji od 20 µL MPM u koncentraciji od 1 mg/mL, 10 µL hijaluronidaze i 60 µL 0,1 M acetatnog pufera prethodno je inkubirana 20 minuta na 37 stupnjeva. Nakon vremena inkubacije, u smjesu je dodano 10 µL hijaluronske kiseline i ponovno inkubirano na 37 stupnjeva 20 minuta. Na kraju ukupnog vremena inkubacije, mjerenja su napravljena u različitim vremenskim točkama Thermo Scientific Multiskan SkyHigh Microplate Spectrofotometrom na 600 nm. Prazna skupina nije sadržavala enzime u eksperimentalnoj postavci, dok kontrolna skupina nije sadržavala ekstrakt. Postotak aktivnosti protiv hijaluronidaze izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe:

Aktivnosti protiv starenja ( postoci )= [(Aps kontrole - Aps uzorka)/ Aps kontrole] × 100

Statistička analiza

Eksperimenti aktivnosti protiv elastaze, anti-kolagenaze i anti-hijaluronidaze uključeni u ovu studiju ponovljeni su tri puta neovisno. Statistička razlika analizirana je t-testom softvera GraphPad Prism 8 (p Manje od ili jednako 0,05).

REZULTATI I RASPRAVA

Određivanje potencijala protiv starenja

Elastin, kolagen i hijaluronska kiselina poznati su sadržaji ECM-a koji imaju ključnu ulogu u mladom izgledu kože. Elastin je vitalni protein za održavanje elastičnih svojstava kože, posljedično, smanjenje elastina u ECM-u dovodi do ubrzanja procesa starenja.27 Prethodna literatura ukazuje na izravnu vezu između bora i starenja kože sa smanjenim količinama elastina.28 Hijaluronska kiselina je hidrofobna GAG molekula, koja se depolimerizira putem hijaluronidaze. Hijaluronska kiselina ključna je za održavanje glatkoće i stabilnosti vlažnosti kože; stoga je pokazano da pretjerana razgradnja dovodi do isušivanja i boranja kože.29 Kroz proces starenja s vremenom, smanjene razine kolagena uzrokuju stanjivanje dermisa, što se smatra posebnom indikacijom pod mikroskopskim pregledom.3{{23 }} Točno je naznačeno da odgađanje razgradnje kolagena putem inhibitora kolagenaze posljedično usporava boranje i starenje strukture kože.5 S obzirom na ovu informaciju, tvari koje inhibiraju elastazu, kolagenazu i hijaluronidazu imaju značajan potencijal za proizvode protiv starenja. Prethodne studije su pokazale da različiti izoflavonoidi pokazuju značajnu inhibitornu bioaktivnost protiv gore spomenutih enzima. Addotey i sur.31 pokazali su da četiri različita izoflavonoida inhibiraju hijaluronidazu do 61,2 posto. Kim i sur.32 pokazali su da izolirani izoflavonoid iz Glycyrrhiza uralensis Fisch., likoricidin, ima značajno inhibitorno djelovanje na elastazu. IC50 vrijednost sladića izračunata je kao 61,2 ± 4,2 µM dok je oleanolna kiselina izračunata kao 131,4 ± 11,4 kao referentni spoj. Rezultati su pokazali da izoflavonoidi mogu inhibirati enzime elastaze. U skladu s gore spomenutom studijom, Kim i suradnici33 proučavali su devet različitih preniliranih izoflavonoida, izrazito srodnih struktura s osajinom, izoliranih iz korijena Flemingia philippinensis Merr. & Rolfe. Istraživači su izvijestili da je pet preniliranih izoflavona imalo snažnu inhibicijsku aktivnost protiv neutrofilne elastaze, vrijednosti IC50 varirale su između 1.9-12.0 µM, dok je vrijednost IC50 oleanolne kiseline bila 28,4 µM. U drugoj studiji, Ergene Öz i sur. 34 istraživali su in vitro inhibitornu aktivnost pet izoflavonoida izoliranih iz korijena Ononis spinoza L. protiv hijaluronidaze, kolagenaze i elastaze. Zabilježeno je da je inhibicijska aktivnost izoflavona na hijaluronidazu bila između 22.08-45.58 posto, dok je, pri istoj koncentraciji, taninska kiselina pokazala inhibiciju od 88,32 posto. Rezultati inhibicije kolagenaze izračunati su između 20.41- 28.49 posto, a inhibicija elastaze izmjerena je kao 20.47-46.88 posto. EGCG je korišten kao referenca za oba testa, a aktivnosti inhibicije pri istoj koncentraciji izmjerene su na 41,18 posto, odnosno 84,64 posto. Drugo istraživanje istraživalo je lokalno liječenje pomiferinom izravno izoliranim iz M. pomifera. 15 Pomiferin je prenilirani izoflavonoid koji se nalazi u plodovima M. pomifera i svojom molekularnom strukturom izrazito podsjeća na osajin. Istraživači su izvijestili da je pomiferin pokazao snažnu aktivnost stimulacije proteina ECM povećanjem kolagena i elastina koji je superiorniji ili ekvivalentan referentnom spoju, retinolu. Sve navedene studije otkrile su da su izoflavoni umjereni do jaki inhibitori ovih enzima i imaju značajan potencijal kao prirodni materijali protiv starenja.

U ovoj su studiji in vitro inhibicijske aktivnosti MPM-a na hijaluronidazu, kolagenazu i elastazu ispitivane za određivanje potencijala za usporavanje starenja. Proveden je usporedni test za test inhibicije kolagenaze u dvije vremenske točke, npr. 20 i 40 min, i za MPM i za referentni spoj, EGCG. Rezultati su pokazali da se aktivnost inhibicije kolagenaze povećavala s vremenom. MPM od 1 mg/mL pokazao je 84,55 ± 1,99 posto inhibicije, dok je 25{{4{0}} µg/mL EGCG pokazao 84,66 ± 1,83 posto nakon 20 min inkubacije. Inhibicijska bioaktivnost pojačana je tijekom vremena, nakon 40 min MPM i EGCG inhibirali su kolagenazu 94,68 ± 2,42 posto, odnosno 94,98 ± 2,81 posto. U skladu s literaturom, MPM je pokazao značajnu inhibicijsku aktivnost protiv elastaze. Rezultati su izmjereni za četiri vremenske točke (5, 10, 20 i 30 min) i prikazano je povećanje tijekom vremena (Slika 2). EGCG (250 µg/mL) korišten je kao referenca i aktivnost inhibicije se povećavala u svakoj vremenskoj točki (44,07 ± 0.00 posto, 52,19 ± 0.00 posto, 64,69 ± 0.{{41 }} posto , odnosno 86.21 ± 0.00 posto ). U međuvremenu je MPM u koncentraciji od 1 mg/mL pokazao veću aktivnost pojačanja i inhibicije, koja je porasla s 34,70 ± 0,57 posto na 97,40 ± 1,04 posto od 5 minuta do 30 minuta. Slično, 1 mg/mL MPM značajno je inhibirao enzim hijaluronidazu nakon 40 minuta inkubacije. Inhibicija od 83,91 ± 2,36 posto izmjerena je nakon 40 minuta, nakon tih 80 minuta inkubacije, stopa inhibicije pojačana je na 97,19 ± 0,45 posto. Kada su razmotreni cjelokupni testovi inhibicije enzima, rezultati su zamjetno pokazali da MPM može biti vrijedan prirodni agens protiv starenja i da se može koristiti u sadržaju raznih proizvoda protiv starenja; stoga bi M. pomifera mogla dobiti dodatnu ekonomsku važnost.

Određivanje antioksidativnog potencijala

Brojni egzogeni i endogeni čimbenici različitim mehanizmima dovode do starenja kože. Na većinu ovih čimbenika izravno ili neizravno utječe stvaranje ROS-a u ECM-u kože.35 Budući da koža prekriva vanjski dio našeg tijela, ona se u svakodnevnom životu susreće sa značajnim količinama UV zračenja. Dakle, većina kožnih problema kao što su opekline od sunca, hiperpigmentacije i karcinogeneza kože potječu ili su povezani s izravnim učincima UV zračenja. Isto tako, fotostarenje je dodatna posljedica njegovih opasnih svojstava.36 Štoviše, UV svjetlo stvara stvaranje ROS-a i, posljedično, oksidativni stres u kožnom tkivu, što je jedan od najvažnijih mehanizama koji dovode do fotostarenja.37 Pretpostavlja se da budući da prekomjerno Stvaranje ROS-a uzrokuje prerano starenje kože, agensi sa značajnim antioksidativnim kapacitetom mogu biti vrijedan alat protiv opasnih učinaka UV zračenja. Sukladno tome, kliničke studije pokazuju da lokalno korištenje antioksidansa ima zaštitni učinak na kožu.38

Nakon povezanosti između topikalne uporabe antioksidansa i odgode starenja kože, koja je dobro utvrđena u prethodnoj literaturi, ispitivanje in vitro antioksidativnog potencijala MPM-a daje vrijedne informacije jer je njegov potencijal protiv starenja kada se primjenjuje lokalno. Ranija literatura pokazala je da bi ekstrakti s velikim brojem izoflavonoida mogli biti vrijedni antioksidansi. U prethodnoj studiji, ekstrakt ekstrakta F. macrophylla bogat izoflavonoidima smanjio je oštećenje kože izazvano UVB zračenjem uklanjanjem ROS.39 Santos i Silva4{{10}} ukazali su da prenilirani izoflavonoidi imaju važan antioksidativni potencijal zbog svog flavonoidni dio i aditivni učinak prenilnog bočnog lanca. Antioksidativni potencijal ekstrakata i izoflavonoida M. pomifera procijenjen je u prethodnoj studiji. Rezultati su pokazali da su hidroalkoholni ekstrakt i čisti osajin pokazali značajnu aktivnost na testovima DPPH, FRAP i TOAC, iako su frakcije pomiferina i etilnog acetata pokazale veću aktivnost.41 Za ovu studiju, aktivnost uklanjanja radikala DPPH, testovi FRAP, CUPRAC i TOAC bili su provedeno za sveobuhvatno određivanje in vitro antioksidativnog potencijala MPM (Tablica 2). MPM je pokazao značajnu aktivnost uklanjanja radikala DPPH, gdje je vrijednost IC50 izmjerena 1998.86 ± {{20}}.02. FRAP i TOAC testovi također su rezultirali značajnom aktivnošću redukcije metala, 0,191 ± 0,01 mM FeSO4/DE odnosno 114,43 ± 0,02 AAE/g DE. Ovi su nalazi u skladu s prethodnom studijom koju su objavili Orhan i suradnici.41 CUPRAC test proveden je na ekstraktima voća M. pomifera po prvi put koliko znamo. U skladu s tim, MPM je pokazao značajnu aktivnost smanjenja bakra u CUPRAC testu, gdje su rezultati izmjereni kao 73,928 ± 0,01 AAE/g DE. Kada se uzmu u obzir testovi ukupnog antioksidativnog kapaciteta, moguće je sugerirati da je MPM obećavajuće sredstvo protiv starenja.

Fenolni profil i HPTLC analiza

Izoflavonoidi su fenolne tvari, koje su poznate kao biljni sastojci odgovorni za različite biološke aktivnosti vrijedne pažnje, kao što su antioksidansi, antikancerogena i protiv ginekoloških problema.42 Prethodne studije su pokazale da su prenilirani izoflavonoidi glavni fenolni spojevi u plodovima M. pomifera.43 Brojne studije identificirale su osajin i pomiferin kao glavne sastojke plodova M. pomifera, koji su primarno odgovorni za to su biološke aktivnosti.12 Osajin i pomiferin vrlo su slični prenilirani izoflavonoidi koji se razlikuju samo s jednom hidroksilnom skupinom.44 Prethodna izvješća pokazala su proturječne rezultate za sadržaj osajina i pomiferina plodova M. pomifera. Kartal i sur.45 razvili su LC-MS metodu za određivanje osajina i pomiferina u M. pomifera, koji su prikupljeni iz pokrajine Ankara u Turskoj. Rezultati su pokazali da je sadržaj pomiferina bio nešto veći od sadržaja osajina u različitim dijelovima uzoraka voća. U drugoj studiji, uzorci voća M. pomifera prikupljeni su iz različitih regija srednjeg zapada i juga Sjedinjenih Država, a sadržaj osajina i pomiferina mjeren je novom HPLC metodom analize. Rezultati su pokazali da zemljopisne razlike dovode do značajnih promjena u količini izoflavonoida u uzorcima.46 Tsao i sur.47 odredili su sadržaj osajina i pomiferina u voću prikupljenom iz Kanade i otkrili da je sadržaj pomiferina nešto viši od sadržaja osajina. Nasuprot tome, Hwang i sur.48 saželi su nekoliko studija koje su otkrile količine osajina veće od količina pomiferina u različitim ekstraktima. Može se tvrditi da su sadržaji osajina i pomiferina u plodovima M. pomifera iznimno varijabilni s geografskim razlikama i tehnikama ekstrakcije zbog izrazito slične kemijske strukture. Za ovu studiju, količina MPM je izmjerena putem HPTLC analize, po prvi put koliko znamo. Rezultati analize pokazali su da je osajin dominantni sastojak MPM-a koji je prikupljen iz pokrajine Uşak, 0. 22 posto uzorka sastojalo se od osajina (Tablica 1). Nadalje, kako bi se postigla daljnja procjena fenolnog profila MPM-a, provedena su ispitivanja ukupnog sadržaja fenola i ukupnog flavonoida. Rezultati su pokazali da MPM ima značajan sadržaj fenola i flavonoida kako slijedi; 113,92 ± 2,26 mg GAE/g odnosno 66,41 ± 0,74 mg QE/g. Rezultati evaluacije fenolnog profila pokazali su da bi MPM mogao biti istaknuti kandidat kao novi prirodni agens protiv starenja.

ZAKLJUČAK

Iako su studije koje istražuju lokalnu primjenu plodova M. pomifera relativno nove, pozornost na ovaj način raste s ohrabrujućim izvješćima. Stoga je ova studija imala za cilj opisati sveobuhvatnu procjenu mogućeg potencijala ekstrakta ploda M. pomifera protiv starenja. HPTLC analiza korištena je za plodove M. pomifera za određivanje sadržaja izoflavonoida po prvi put koliko znamo, zajedno s in vitro studijama za određivanje ukupnog fenolnog profila. Rezultati su pokazali da je osajin glavni sastojak uzoraka. Dodatno, in vitro antioksidativni potencijal ekstrakta procijenjen je s četiri različita testa i rezultati su pokazali značajan antioksidativni potencijal MPM-a. Dodatno, mjerena je inhibicijska aktivnost protiv enzima, koji su povezani s procesom starenja, te je uočeno da MPM ima značajno inhibicijsko djelovanje enzima. Zaključno, ova studija pruža informacije koje bi mogle dovesti do proizvodnje novih proizvoda za njegu kože.

Etika

Odobrenje Etičkog povjerenstva:Za studiju nije potrebno odobrenje Etičkog povjerenstva.

Informirani pristanak:Nije potrebno.

Stručna recenzija:Eksterno recenzirano.

Autorski prilozi

Koncept: THB, TBŞ., HB, Dizajn: THB, İ.KC, EC, Prikupljanje ili obrada podataka: THB, İ.KC, HB, Analiza ili tumačenje: THB, İ.KC, Pretraživanje literature: THB, TBŞ., Pisanje: THB, EC

Sukob interesa:Autori nisu izjavili da postoji sukob interesa.

Objavljivanje financijskih podataka:Ovu studiju je podržala Komisija za znanstvene projekte Sveučilišta Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar (br: 2020/02/07).

REFERENCE

1. Hwang E, Park SY, Yin CS, Kim HT, Kim YM, Yi TH. Učinci protiv starenja mješavine Panax ginsenga i Crataegus pinnatifida u ljudskim dermalnim fibroblastima i zdravoj ljudskoj koži. J Ginseng Res. 2017;41:69-77.

2. Ganceviciene R, Liakou AI, Theodoridis A, Makrantonaki E, Zouboulis CC. Strategije protiv starenja kože. Dermatoendocrinol. 2012;4:308-319.

3. Lee H, Hong Y, Tran Q, Cho H, Kim M, Kim C, Kwon SH, Park S, Park J, Park J. Nova uloga ginsenozida RG3 u zaustavljanju starenja putem mitohondrijske funkcije u ultraljubičastom zračenju kože ljudi fibroblasti. J Ginseng Res. 2019;43:431-441.

4. Rouvrais C, Bacqueville D, Patrick B, Haure MJ, Duprat L, Coutanceau C, Castex-Rizzi N, Duplan H, Mengeaud V, Bessou-Touya S. Procjena svojstava retinaldehida, delta-tokoferol glukozida i glicilglicina protiv starenja kombinacija oleamida. J Invest Dermatol. 2017;137(Dodatak 2):S303.

5. Bravo K, Alzate F, Osorio E. Plodovi odabranih divljih i kultiviranih andskih biljaka kao izvori potencijalnih spojeva s antioksidativnim djelovanjem i djelovanjem protiv starenja. Ind Crops Prod. 2016;85:341-352.

6. Yepes A, Ochoa-Bautista D, Murillo-Arango W, Quintero-Saumeth J, Bravo K, Osorio E. Ljubičaste sjemenke marakuje (Passiflora edulis f. edulis Sims) kao obećavajući izvor sredstava protiv starenja kože: enzimatski , antioksidans i računalne studije na više razina. Arab J Chem. 2021;14:102905.

7. Rittié L, Fisher GJ. Kaskade signala izazvane UV svjetlom i starenje kože. Aging Res Rev. 2002;1:705-720.

8. Duque L, Bravo K, Osorio E. Holistički pristup protiv starenja primijenjen u odabranim kultiviranim ljekovitim biljkama: pogled na fotozaštitu kože različitim mehanizmima. Ind Crops Prod. 2017;97:431-439.

9. Manjia NJ, Njayou NF, Joshi A, Upadhyay K, Shirsath K, Devkar VR, Moundipa FP. Potencijal ljekovitih biljaka protiv starenja u Kamerunu Harungana madagascariensis Lam. i Psorospermum aurantiacum Engl. spriječiti in vitro ultraljubičasto B svjetlo inducirano oštećenje kože. Eur J Integr Med. 2019;29:100925.

10. Pujimulyani D, Suryani CL, Setyowati A, Handayani RAS, Arumwardana S, Widowati W, Maruf A. Kozmeceutski potencijali Curcuma mangga Val. ekstrakta u ljudskim BJ fibroblastima protiv MMP1, MMP3 i MMP13. Heliyon. 2020;6:e04921.

11. Stavropoulou MI, Stathopoulou K, Cheilari A, Benaki D, Gardikis K, Chinou I, Aligiannis N. NMR metaboličko profiliranje uzoraka grčkog propolisa: usporedna procjena njihovih fitokemijskih sastava i istraživanje njihovih svojstava protiv starenja i antioksidansa. J Pharm Biomed Anal. 2021;194:113814.

12. Filip S, Djarmati Z, Lisichkov K, Csanadi J, Jankov RM. Izolacija i karakterizacija ekstrakata maklure (Maclura pomifera) dobivenih superkritičnom fluidnom ekstrakcijom. Ind Crops Prod. 2015;76:995-1000.

13. Saloua F, Eddine NI, Hedi Z. Kemijski sastav i karakteristike profila osage naranče Maclura pomifera (Rafin.) Schneider sjemena i sjemenskog ulja. Ind Crops Prod. 2009;29:1-8.

14. Veselá D, Kubínová R, Muselík J, Zemlicka M, Suchý V. Antioksidativne i EROD aktivnosti osajina i pomiferina. Fitoterapija. 2004;75:209-211.

15. Gruber JV, Holtz R, Sikkink SK, Tobin DJ. In vitro i ex vivo ispitivanje lokalnog liječenja pomiferinom. Fitoterapija. 2014;94:164-171.

16. Bozkurt İ, Dilek E, Erol HS, Çakir A, Hamzaoğlu E, Koç M, Keleş ON, Halici MB. Istraživanje učinaka pomiferina iz Maclura pomifera na želučani ulkus izazvan indometacinom: eksperimentalna studija na štakorima. Med Chem Res. 2017;26:2048-2056.

17. Kurt-Celep İ, Celep E, Akyüz S, İnan Y, Barak TH, Akaydın G, Telci D, Yesilada E. Hypericum Olympic L. oporavlja oštećenja DNK i sprječava aktivaciju MMP-9 induciranu UVB zračenjem u ljudskoj koži fibroblasti. J Ethnopharmacol. 2020;246:112202.

18. Bardakci H, Cevik D, Barak TH, Gozet T, Kan Y, Kirmizibekmez H. Sekundarni metaboliti, fitokemijska karakterizacija i antioksidativna aktivnost različitih ekstrakata Sideritis congesta PH Davis et Hub.- Mor. Biochem Syst Ecol. 2020;92:104120.

19. Celep E, Seven M, Akyüz S, İnan Y, Yesilada E. Utjecaj metode ekstrakcije na inhibiciju enzima, fenolni profil i antioksidativni kapacitet Sideritis trojan Bornm. Južnoafrikanac J Bot. 2019;121:360-365.

20. Bardakcı H, Barak TH, Özdemir K, Celep E. Učinak pivarskog materijala i raznih aditiva na polifenolni sastav i antioksidacijsku bioaktivnost komercijalne Tilia platyphyllos Scop. infuzije. J Res Pharm. 2020;24:133-141.

21. Barak TH, Celep E, İnan Y, Yesilada E. Utjecaj in vitro ljudske probave na bioraspoloživost sadržaja fenola i antioksidativno djelovanje ekstrakata ploda Viburnum opulus L. (europske brusnice). Ind Crops Prod. 2019;131:62-69.

22. Barak TH, Celep E, İnan Y, Yeşilada E. In vitro simulacija ljudske probave bioraspoloživosti i antioksidativne aktivnosti fenola iz ekstrakata voća Sambucus ebulus L. Food Biosci. 2020;37:100711.

23. Ersoy E, Eroglu Ozkan E, Boga M, Yilmaz MA, Mat A. Potencijal protiv starenja i aktivnost protiv tirozinaze tri vrste Hypericum s fokusom na fitokemijski sastav pomoću LC-MS/MS. Ind Crops Prod. 2019;141:111735.

24. Lee KK, Kim JH, Cho JJ, Choi JD. inhibitorni učinci 150 biljnih ekstrakata na aktivnost elastaze i njihovo protuupalno djelovanje. Int J Cosmet Sci. 1999;21:71-82.

25. Itoh S, Yamaguchi M, Shigeyama K, Sakaguchi I. Potencijal ekstrakata Chaenomeles sinensis protiv starenja. Kozmetika 2019;6:21.

26. Kolayli S, Can Z, Yildiz O, Sahin H, Karaoglu SA. Usporedna studija antihijaluronidaznih, antifriznih, antioksidativnih, antimikrobnih i fizikalno-kemijskih svojstava različitih uniflornih stupnjeva kestenova (Castanea sativa Mill.) meda. J Enzyme Inhib Med Chem. 2016;31(Dodatak 3):96-104.

27. Korkmaz B, Horwitz MS, Jenne DE, Gauthier F. Neutrofilna elastaza, proteinaza 3 i katepsin G kao terapijski ciljevi u ljudskim bolestima. Pharmacol Rev. 2010;62:726-759.

28. Akazaki S, Nakagawa H, Kazama H, Osanai O, Kawai M, Takema Y, Imokawa G. Starosne promjene u borama kože procijenjene novom trodimenzionalnom morfometrijskom analizom. Br J Dermatol. 2002;147:689- 695.

29. Barla F, Higashijima H, Funai S, Sugimoto K, Harada N, Yamaji R, Fujita T, Nakano Y, Inui H. Inhibitivni učinci alkil galata na hijaluronidazu i kolagenazu. Biosci Biotechnol Biochem. 2019;73:2335-2337.

30. Chung JH, Kang S, Varani J, Lin J, Fisher GJ, Voorhees JJ. Smanjene aktivnosti kinaze regulirane izvanstaničnim signalom i povećane aktivnosti MAP kinaze aktivirane stresom u ostarjeloj ljudskoj koži in vivo. J Invest Dermatol. 2000;115:177-182.

31. Addotey JN, Lenger's I, Jose J, Gampe N, Béni S, Petereit F, Hensel A. Izoflavonoidi s inhibirajućim učincima na ljudsku hijaluronidazu-1 i norneolignan klitorienolakton B iz ekstrakta korijena Ononis spinosa L.. Fitoterapija. 2018;130:169-174.

32. Kim KJ, Xuan SH, Park SN. Likoricidin, izoflavonoid izoliran iz Glycyrrhiza uralensis Fisher, sprječava fotostarenje ljudskih dermalnih fibroblasta izazvano UVA zračenjem. Int J Cosmet Sci. 2017;39:133-140.

33. Kim JY, Wang Y, Uddin Z, Song YH, Li ZP, Jenis J, Park KH. Kompetitivni izoflavoni inhibitori neutrofilne elastaze iz korijena Flemingia philippinensis. Bioorg Chem. 2018;78:249-257.

34. Ergene Öz B, Saltan İşcan G, Küpeli Akkol E, Süntar İ, Bahadır Acıkara Ö. Izoflavonoidi kao sredstva za zacjeljivanje rana iz Ononidis radix. J Ethnopharmacol. 2018;211:384-393.

35. Azevedo Martins TE, de Oliveira Pinto CAS, de Oliveira AC, Robles Velasco MV, Gorriti Guitiérrez AR, Cosquillo Rafael MF, Huamani Tarazona JP, Retuerto-Figueroa MG. Doprinos lokalnih antioksidansa održavanju zdrave kože - pregled. Sci Pharm. 2020;88:27.

36. Krutmann J, Schroeder P. Uloga mitohondrija u fotostarenju ljudske kože: neispravni model elektrane. J Istražite Dermatol Symp Proc. 2009;14:44-49.

37. Dong KK, Damaghi N, Picart SD, Markova NG, Obayashi K, Okano Y, Masaki H, Grether-Beck S, Krutmann J, Smiles KA, Yarosh DB. UV-inducirano oštećenje DNK pokreće oslobađanje MMP-1 u ljudskoj koži. Exp Dermatol. 2008;17:1037-1044.

38. Oresajo C, Pillai S, Manco M, Yatskayer M, McDaniel D. Antioksidansi i koža: razumijevanje formulacije i učinkovitosti. Dermatol Ther. 2012;25:252-259.

39. Chiang HM, Chiu HH, Liao ST, Chen YT, Chang HC, Wen KC. Ekstrakt fleming macrophylla bogat izoflavonoidima ublažava oštećenja kože izazvana UVB zračenjem tako što uklanja reaktivne kisikove vrste i inhibira ekspresiju MAP kinaze i MMP. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:696879.

40. Santos CMM, Silva AMS. Antioksidativno djelovanje prenilflavonoida. Molekule. 2020;25:696.

41. Orhan IE, Sezer Senol F, Demirci B, Dvorska M, Smejkal K, Zemlicka M. Antioksidativni potencijal nekih prirodnih i polusintetskih derivata flavonoida i ekstrakta iz Maclura pomifera (Rafin.) Schneider (osage orange) and its essential sastav ulja. Turski J Biochem. 2016;41:403-411.

42. Křížová L, Dadáková K, Kašparovská J, Kašparovský T. Isoflavones. Molekule. 2019;24:1076.

43. Su Z, Wang P, Yuan W, Grant G, Li S. Phenolics from the fruits Maclura pomifera. Nat Prod Commun. 2017;12:1743-1745.

44. Orazbekov Y, Ibrahim MA, Mombekov S, Srivedavyasasri R, Datkhayev U, Makhatov B, Chaurasiya ND, Tekwani BL, Ross SA. Izolacija i biološka procjena preniliranih flavonoida iz Maclura pomifera. Evid Based Complement Alternat Med. 2018;2018:1370368.

45. Kartal M, Abu-Asaker M, Dvorska M, Orhan I, Zemlicka M. LC-DAD-MS metoda za analizu pomiferina i osajina, glavnih izoflavona u Maclura pomifera (Rafin.) Schneider. Chromatographia 2009;69:325-329.

46. ​​Darji K, Miglis C, Wardlow A, Abourashed EA. HPLC određivanje razine izoflavona u osage naranči sa srednjeg zapada i juga Sjedinjenih Država. J Agric Food Chem. 2013;61:6806-6811.

47. Tsao R, Yang R, Young JC. Antioksidansi izoflavoni u osage naranči, Maclura pomifera (Raf.) Schneid. J Agric Food Chem. 2003;51:6445-6451.

48. Hwang HS, Winkler-Moser JK, Tisserat B, Harry‐O'kuru RE, Berhow MA, Liun SX. Antioksidativno djelovanje ekstrakta osage naranče u sojinom ulju i ribljem ulju tijekom skladištenja. J Am Oil Chem Soc. 2021;98:73-87.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】