Imunostimulirajuća aktivnost polisaharida koji se mogu ekstrahirati vodom iz Cistanche Deserticola kao biljnog adjuvansa in vitro

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Xinjiang Key Lab of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang, Kina,

2 Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, Kina,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xian, Shanxi, Kina

Sažetak

Siguran i učinkovit adjuvans cjepiva važan je u modernim cjepivima. Razni kineskibiljni polisaharidimože aktivirati imunološki sustav.Cistanche deserticola(CD) je tradicionalna kineska biljka i kandidat za pomoćno sredstvo. Evo, to smo i potvrdilipolisaharidi koji se ekstrahiraju vodomCD-a (WPCD) mogao bi modulirati imunološke odgovore in vitro i in vivo. Na način ovisan o dozi, WPCD je značajno pospješio sazrijevanje i funkciju dendritičnih stanica izvedenih iz mišje srži (BM-DC) povećanjem razine ekspresije MHC-a -II, CD86, CD80 i CD40, alogena proliferacija T stanica i prinosi IL-12i TNF- putem toll-like receptora4 (TLR4), kao što je naznačeno in vitro eksperimentima. Osim toga, njegovo imunomodulatorno djelovanje također je primijećeno kod miševa. WPCD je učinkovito poboljšao titre IgG, IgG1 i IgG2a i značajno povećao proliferaciju T i B stanica, proizvodnju IFN-a i IL-4 u CD4 plus T stanicama i razinu ekspresije IFN-a u CD8 plus T stanice bolje od Stipse. Nadalje, WPCD bi mogao znatno pojačati razine ekspresije CD40 i CD80 na DC u slezeni i smanjiti Treg frekvenciju. Studija sugerira da su polisaharidi Cistanche deserticola siguran i učinkovit adjuvans cjepiva za izazivanje i humoralne imunosti i stanične imunosti aktiviranjem DC-a putem signalnog puta TLR4.

Kliknite za Cistanche stem proizvode

Uvod

Cjepiva su važna za kontrolu ili prevenciju bolesti. Novonastala cjepiva i cjepiva koja se trenutno razvijaju visoko su pročišćena rekombinantnaantigenis većom sigurnošću, ali pročišćeni antigeni ne mogu stimulirati zadovoljavajućeimunološki odgovoru usporedbi s atenuiranim ili inaktiviranim pripravcima patogena. Uz pomoć adjuvansa, cjepiva mogu izazvati perzistentniimunološki odgovori[1,2]. Novi moćni adjuvansi naširoko su zabrinuti i za razvoj cjepiva i za ljudsko zdravlje. Do danas su identificirani i opsežno proučavani različiti adjuvansi. Ti adjuvansi daju cjepivima nekoliko prednosti, uključujući smanjenje potrebne količine antigena, smanjivanje broja imunizacija potrebnih za normalan imunološki odgovor i induciranje bržeg, šireg i jačegimunološki odgovori[3–5]. Iako su razvijeni mnogi jaki adjuvansi, kao što su lipopolisaharid (LPS) i Freundov potpuni adjuvans (FCA), oni nisu naširoko primijenjeni zbog svoje toksičnosti. Stoga je samo nekoliko pomoćnih sredstava, poput stipse, odobreno za kliničku uporabu [6]. Općenito, potrebno je razviti učinkovitije i sigurnije pomoćne tvari za promicanje boljih profilaktičkih i terapijskih cjepiva protiv zaraznih i nezaraznih bolesti.

Sigurnost je važan faktor razmatranja u razvoju pomoćnih sredstava. Sastojci kineskog bilja uključuju hranjive tvari i važne aktivne spojeve, poput fenolnih spojeva i polisaharida, koji mogu djelovati kao snažni imunostimulansi [7-9]. Među njima, polisaharidi iz tradicionalnog kineskog bilja naširoko su istraženi zbog svog imunostimulirajućeg djelovanja i niske toksičnosti. Na primjer, inulin je imunološki adjuvans bez toksičnosti drugih adjuvansa kao što je FCA. Adjuvans delta inulin AdvaxTM također je uspješno poboljšao imunogenost cjepiva [10,11]. Astragalus, također poznat kao Huangqi na kineskom i Radix Astragali na latinskom, široko je rasprostranjen po cijelom svijetu. Polisaharid je jedan od njegovih glavnih aktivnih sastojaka odgovornih za imunomodulatorno djelovanje. Eksperimentalne studije su pokazale da polisaharid Astragalus ima snažne imunomodulatorne učinke i in vitro i in vivo [12, 13]. Polisaharidi Lycium barbarum kao adjuvans cjepiva također su pokazali dobra poboljšanja i stimulativne učinke [14, 15]. Ove studije sugerirale su da su kineski biljni polisaharidi idealni kandidati za adjuvantni razvoj.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, "Rou Cong Rong" na kineskom) je vrijedna tradicionalna kineska biljka i obično se smatra "pustinjskim ginsengom" zbog svojih vrhunskih toničkih učinaka. Rasprostranjen je u sušnim ili polusušnim regijama u Xinjiangu. U Kini se njegova osušena mesnata stabljika stotinama godina koristila kao tonik [16, 17]. Dugo se godina kuhani CD koristio kao tonik za liječenje oštećenja izazvanih prenaprezanjem, što ukazuje na to da je siguran za oralnu primjenu. Ova biljka je široko poznata zbog svojih širokih ljekovitih funkcija. Nedavna fitokemijska i farmakološka istraživanja pokazala su da su polisaharidi glavne biološki aktivne komponente i da imaju različite biološke učinke, uključujući imunomodulatorno djelovanje, antioksidativno djelovanje i protuupalno djelovanje [18-21]. Ipak, rijetko se izvještavalo o aktivnosti jačanja imuniteta polisaharida koji se mogu ekstrahirati iz C. deserticola u Xinjiangu.

Dobro je poznato da su DC važne stanice koje predstavljaju antigen (APC) koje daju signale potrebne za pokretanje imunoloških odgovora i modulaciju urođenih i adaptivnih stanica. Neki adjuvansi koji poboljšavaju unos antigena pomoću DC mogu povećati kostimulatorne ili MHC molekule i poboljšati imunitet. Kada počne sazrijevanje DC-a, proizvodi se više kostimulacijskih molekula i citokina, a DC-i pokazuju različite fenotipove [22, 23].

U ovoj smo studiji prvo ispitali može li WPCD promovirati aktivaciju DC-a putem signalnog puta TLR4 in vivo. Budući da su DC bili poveznica između urođenog i adaptivnog imunološkog odgovora, pretpostavili smo da bi aktivacija DC stimulirana WPCD-om utjecala na ishod adaptivnog imuniteta. Ispitali smo specifični imunološki odgovor na ovalbumin (OVA) kod miševa tretiranih WPCD-om, uključujući titre IgG, IgG1 i IgG2a potklase, T- i B- proliferaciju i proizvodnju citokina. Istraživali smo hoće li tretman WPCD povećati aktivnost DC i Treg stanica u slezeni ovih miševa. Naša otkrića dokazala su potencijalno imunomodulatorno djelovanje prirodnih polisaharida iz C. deserticola i proširila opseg njihove primjene

Materijali i metode

Životinje

Ženke miševa C57BL/6, BALB/c ili ICR stare osam do deset tjedana kupljene su od FirstHospital Medicinskog sveučilišta Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Kina). Miševi su bili smješteni u uvjetima bez patogena u skladu sa smjernicama Odbora za brigu i korištenje životinja (ACUC) Sveučilišta Xinjiang za zdravlje i dobrobit životinja. Postupke pokusa na životinjama odobrio je AUCC Sveučilišta Xinjiang.

Ekstrakcija vodenih ekstrakata

C. deserticola je biljka u provinciji Xinjiang u Kini. Sirovi polisaharid je dobiven ekstrakcijom vodom i taloženjem etanolom. Ukratko, 100 g osušene C. deserticola samljeveno je u prah i zatim filtrirano. Prašak je nekoliko puta refluksiran s petroleterom na sobnoj temperaturi, a zatim je refluksiran s bezvodnim etanolom 1 sat da se uklone obojeni sastojci i lipidi. Ostaci su ekstrahirani kipućom vodom tri puta, a ekstrakti su skupljeni, centrifugirani na 4000 okretaja u minuti 10 minuta i refluksirani na 60°C 4 sata. Četverostruki volumeni 95 postotnog etanola dodani su u otopinu kako bi se istaložili sirovi polisaharidi. Sirovi polisaharidi ponovno su otopljeni u destiliranoj vodi i obrađeni Savageovim reagensom kako bi se uklonili proteini. Ekstrakti su otopljeni u PBS-u i sterilizirani kroz filter od 0.22-µm. Konačno, ukupni sadržaj šećera u WPCD-u bio je 59,58 posto, kao što pokazuje analiza fenol-sumporna kiselina [24].

Generiranje DC-ova

BM-DC su generirani prema prethodno opisanoj metodi uz male modifikacije [25]. DC koštane srži miševa C57BL/6 isprani su s RPMI-1640 potpunim medijem (Gibco) s dodatkom 10 posto fetalnog telećeg seruma (Hyclone). Sakupljene stanice su resuspendirane u RPMI-1640 mediju s 50 μM -merkaptoetanola (Sigma, St Louis, MO) i 20 ng/mL mišjeg GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) i inkubirane na 37˚ C u atmosferi s 5 posto CO2. Polovica medija kulture zamijenjena je svježim medijem koji je sadržavao GM-CSF svakih 1-2 dana. Stanice su sakupljene 6. dana, tretirane različitim dozama WPCD, LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) tijekom 24 sata, a zatim procijenjene protočnom citometrijom.

Detekcija sazrijevanja DC i aktivacija T stanica in vitro

Učinak in vitro sazrijevanja WPCD-a na BM-DC procijenjen je na temelju rezultata fenotipske analize FAC-ova. Dana 7, BM–DC iz C57BL/6 inducirani su u prisutnosti GM-CSF i zatim tretirani različitim koncentracijama WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0.05, 0,1 i 0,2 mg/mL) tijekom 12 h u triplikatu. LPS (100 ng/mL) korišten je kao pozitivna kontrola. Nakon što su BM-DC isprani u PBS-u i upotrijebljen Fc Block (BD Biosciences, CA) za sprječavanje nespecifičnog vezivanja protutijela, stanice su obojene u PBS-u korištenjem odgovarajućih FITC-, PE- ili APC-konjugiranih CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 i MHC-II protutijela (BD) 20 minuta na 37˚C. Obojene stanice detektirane su pomoću FAC Calibur (BD). Analiza podataka provedena je softverom FlowJo (Tree Star).

U eksperimentu sazrijevanja DCS in vitro, supernatanti stanične kulture također su prikupljeni za analizu IL-12 i TNF- pomoću kompleta za analizu citokina (Boster, Wuhan, Kina) prema uputama proizvođača. Apsorbancija na 450 nm izmjerena je čitačem ELISA ploča (Bio-Rad, SAD). Količine citokina u uzorcima izračunate su standardnim krivuljama rekombinantnih citokina prema regresijskoj linearnoj metodi.

Kako bi se ispitala njihova alogena stimulacijska aktivnost, izveden je pokus reakcije miješanih limfocita (MLR) prema prethodnoj metodi [26] pomoću MTT (Sigma, St Louis, MO) analize. Ukratko, BM-DCs iz C57BL/6 miševa korištenih kao stimulatorskih stanica oporavljeni su 7. dana u mediju RPMI-1640 plus GM-CSF i tretirani različitim koncentracijama WPCD-a 12 h na 37˚C. Stanice su isprane i ponovno suspendirane u RPMI-1640 mediju prije stavljanja u 24-ploču s jažicama. Suspenzija pojedinačnih plenocita kao stanica odgovora izolirana je iz BALB/c miševa. BM-DC su pomiješani sa splenocitima u omjerima 1:5 i 1:10. Stanice su uzgajane na 37˚C u atmosferi od 5 posto CO2 tri dana u triplikatu. Liječenje LPS-om korišteno je kao pozitivna kontrola. Kulturama je naknadno dodano 20 µL MTT za konačnu 4-h kultivaciju. Apsorbancije na mjernoj valnoj duljini (490 nm) i referentnoj valnoj duljini (650 nm) izmjerene su za analizu proliferacije T stanica. Svi su uzorci izmjereni u odnosu na pozadinsku kontrolu.

Liječenje inhibitorom TLR4 in vitro

BM-DC su prethodno tretirani s 5 μM TAK-242 (inhibitor TLR4, Medchemexpress Inc.USA) tijekom 1 sata, a zatim su kultivirani s različitim koncentracijama WPCD (100 i 200 ug/mL) tijekom 12 sati u prisutnosti ili odsutnosti Golgi Stopa u tri primjerka. U pozitivnoj kontroli dodan je LPS. Stanice i supernatanti detektirani su pomoću FAC-a za analizu površinskih markera CD86i CD40 i pomoću ELISA-e za analizu citokina TNF-a i IL-12.

Protokol cijepljenja

Test akutne toksičnosti. U oralnom testu akutne toksičnosti u ovoj studiji korištena su 40 zdrava odrasla ICR miša. ICR miševi su izgladnjeli (hrana, ali ne i voda preko noći) prije doziranja. WPCD je davan oralno u dozama od 0, 50, 500 ili 5000 mg/kg tjelesne težine svakoj životinji tijekom 7 dana. Miševi tretirani fiziološkom otopinom i stipsom bili su uključeni u kontrolnu skupinu. Životinje su promatrane svakodnevno tijekom 14 uzastopnih dana. Miševi su pojedinačno promatrani kako bi se zabilježila smrtnost i klinički znakovi. Osim toga, tijekom eksperimenta mjerena je tjelesna težina i njihova potrošnja hrane i vode. Dana 14. indeks slezene ili timusa izračunat je kao (težina slezene ili timusa/tjelesna težina) × 10.

Detekcija WPCD imunomodulatorne aktivnosti in vivo. Kako bi se istražilo ima li WPCD imunomodulatornu aktivnost, ovalbumin (OVA) (Sigma) korišten je kao model antigena i ženke ICR miševa su nasumično odvojene u 7 skupina (negativna kontrolna skupina (0.9 posto NaCl i WPCD 400 ug) i pozitivna kontrola (stipsa 200 ug s OVA)). Miševima je supkutano primijenjeno dva puta s 10 ug OVA samog ili WPCD s OVA u skladu s dozom od 20, 100 ili 400 ug s intervalom od 2- tjedana. Uzorci krvi i slezene uzeti su nakon docjepljivanja kako bi se otkrili titri IgG, podklase IgG, proliferacija splenocita i citokini, površinski markeri DC-a i frekvencija Treg

Detekcija OVA-specifičnih protutijela

OVA-specifični IgG titri i podklase ispitani su ELISA-om prema prethodnoj metodi [27]. ELISA ploče (Nunc, Thermo Fisher Scientific) obložene su preko noći i zatim blokirane. Uzorci seruma razrijeđeni su serijski za analizu titra IgG ili detekciju IgG1 i IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Ploče su zatim inkubirane s PBST-om koji je sadržavao HRP-konjugirani anti-mišji IgG, IgG1 i IgG2a tijekom 1 sata na 37˚C. Kolorimetrijska reakcija je razvijena s tetrametilbenzidinom (TMB), a zatim su izmjerene apsorbancije na 450 nm/655 nm i izražene kao jedinice optičke gustoće (OD).

Detekcija proliferacije splenocita i citokina

Proliferacija splenocita određena je MTT testom. 21. dana nakon prvog cijepljenja, dobivena je jedna suspenzija splenocita. Stanice su uzgajane u RPMI-1640 mediju u96-pločama s jažicom u skladu s koncentracijom od 1×106 stanica/jažici u triplikatu. Kulture su stimulirane s OVA (konačna koncentracija 10 ug/mL), ConA (konačna koncentracija 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) i LPS (konačna koncentracija 100 ng/mL) tijekom 48 sati na 37˚C . Stanice su uzgajane 48 sati i 20 μL (5 mg/mL) MTT (Sigma, St Louis, MO) je dodano u svaku jažicu i inkubirano još 4 sata. Nakon dodavanja 50 µL DMSO-a u svaku jažicu da se zaustavi razvoj boje (Sigma), ploče su očitane pri 570 nm čitačem mikrotitarskih ploča (Bio-Rad, CA, SAD). Proliferacija splenocita izražena je kao indeks stimulacije (SI), koji je bio omjer OD570 nm stimulirane jažice prema nestimuliranoj jažici.

Prinosi IL-4 i IFN- u T stanicama mjereni su unutarstaničnim bojanjem citokina prema objavljenom protokolu s manjim modifikacijama [27, 28]. Suspenzija pojedinačnih splenocita pripremljena je 21. dana nakon prvog cijepljenja. Nakon lize crvenih krvnih stanica, splenociti (2×106 stanica/mL) su inkubirani s OVA (10 ug/mL) za 4-h stimulaciju i Golgi stop (BD) je dodan za 12 h inkubacije, PMA kao pozitivna kontrola. Stanice su sakupljene, isprane s PBS-om, obojene s CD4-FITC/CD8-FITC te fiksirane i permeabilizirane s Cyto fix/Cytoperm kitom (BD) u skladu s uputama proizvođača. Intracelularno bojenje citokina provedeno je odgovarajućom koncentracijom IL-4-PE ili IFN- -APC protutijela na 4˚C tijekom 20 minuta. Obojene stanice detektirane su pomoću FAC-a. Analiza podataka provedena je u FlowJo.

Procjena sazrijevanja DC i Treg stanica u slezeni

Za analizu sazrijevanja DC-a iz splenocita u miševa, izvršeno je bojenje stanične površine s antitijelima CD11c-PE, CD40-FITC i CD80-APC. Trećeg dana nakon prvog cijepljenja dobivena je suspenzija pojedinačnih splenocita (1×106 stanica/mL) i stanice su podvrgnute dvostrukom bojenju. Fluorescentni intenziteti izmjereni su FACs Caliburom, a izmjereni podaci analizirani su FlowJo-om.

Kako bi se promatralo može li WPCD smanjiti frekvenciju CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg stanica. Suspenzija pojedinačnih splenocita pripremljena je 7. dana nakon drugog cijepljenja. Splenocit (2×106 stanica/mL) podvrgnut je bojenju stanične površine s CD4-APC protutijelom, nakon čega je uslijedilo bojenje nuklearnih citokina s odgovarajućim CD25-FITC i Foxp3-PE protutijelima s komplet za bojenje T-stanica miša (eBios ciences) prema uputama proizvođača. Učestalost CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg stanica testirana je na FAC-ovima. Analiza podataka provedena je u FlowJo.

Statistička analiza

Testovi jednosmjerne analize varijance (ANOVA) (Tukeyjev test višestruke usporedbe) provedeni su kako bi se analizirale razlike između više eksperimentalnih skupina. Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ±SD. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Rezultati

WPCD je promovirao sazrijevanje i funkciju BM-DC in vitro

Adaptivni imunitet određen je aktivacijom DC, uključujući vrste kostimulacijskih molekula i citokina [29, 30]. U početku smo istraživali može li WPCD potaknuti ekspresiju kostimulacijskih molekula. U skladu s različitim dozama WPCD-a, primijenjeni su BM-DC iz C57BL/6. Analizirane su razine ekspresije CD11c, CD86, CD80, CD40 i MHC-II u stanicama (Slika 1). Stanice obrađene SSC i FSC pokazale su da tretman različitim dozama WPCD nije promijenio morfologiju BM-DC (podaci nisu prikazani). Razine ekspresije CD86, CD80 i CD40 bile su značajno povišene na način ovisan o dozi u usporedbi s neliječenom skupinom i dosegnule su plato pod dozom od 20 ug/mL WPCD-a, ali razlika je bila nije značajan u usporedbi s LPS grupom (Slika 1A–1C). Razina ekspresije MHC-II značajno je povećana do maksimalne vrijednosti pod dozom od 50 ug/mL (Slika 1D). Rezultati analize staničnih površinskih biljega pokazali su da su DC tretirani LPS-om ili WPCD-om pokazali značajno povećane razine ekspresije CD86, CD80, CD40 i MHC-II i pospješili fenotipsko sazrijevanje.

Neki adjuvansi mogu povećati kostimulatorne molekule na DC ili izravno inducirati izlučivanje citokina. IL-12 i TNF- su glavni citokini za aktivaciju Th1 imunološkog odgovora. Analizirali smo prinose citokina u BM-DC nakon tretmana WPCD. Nakon što su BM– DC tretirani s različitim sadržajem WPCD-a tijekom 12 sati, supernatant je sakupljen kako bi se otkrio sadržaj IL-12 i TNF- s ELISA kitom. WPCD bi ovisno o dozi mogao povećati proizvodnju IL-12 (Slika 2A) i TNF- (Slika 2B). Rezultati su pokazali da WPCD može inducirati funkcionalno sazrijevanje DC-a

U imunološkom odgovoru potrebno je funkcionalno aktivirati DC. Zatim, viša razina alogene proliferacije T stanica inducirana je potpuno zrelim DC-ima. Stoga je MLR istraživao funkcionalni odgovor DC-a na WPCD. Alostimulacijska sposobnost WPCD-induciranih DC-a, slično LPS-u, dramatično je poboljšana na način ovisan o dozi u navedenom omjeru (Slika 2C i 2D). Rezultati su pokazali da je WPCD poboljšao prezentaciju antigena i optimizirao odgovor T-stanica pomoću MLR in vitro.

WPCD je promovirao sazrijevanje DC putem TLR4 puta

Iz gornjih rezultata moglo bi se zaključiti da su BM-DC-ovi aktivirani pomoću WPCD-a pokazali slične ekspresije površinskih molekula DC-a kao LPS (ligand TLR4). Stoga smo pretpostavili da BM-DC aktivira WPCD putem TLR4 puta. Nakon što su BM-DC prethodno tretirani s TAK-242 (inhibitor TLR4) i kokultivirani s WPCD i LPS tijekom 12 sati, ekspresija CD40, CD86, TNF-a ili IL{{12 }} otkriveni su pomoću FAC-a ili ELISA-e. Kao što je prikazano na slikama 3A i 3B, liječenje TAK-242 rezultiralo je značajno smanjenom ekspresijom CD40 i CD86 izazvanom LPS-om ili WPCD-om, te proizvodnjom citokina IL-12 ili TNF-a također je značajno smanjen (Slika 3C i 3D). Rezultati su pokazali da bi WPCD mogao aktivirati DC sazrijevanje putem TLR4 puta.

WPCD je poboljšao humoralni i stanični imunitet

U svrhu usporedbe, procijenili smo učinke WPCD-a na izazivanje humoralnog imunološkog odgovora u miševa imuniziranih OVA-om. Prije cijepljenja i 14., 21., 35. i 49. dana nakon prvog cijepljenja, prikupljena je krv za otkrivanje titra IgG i seruma podrazreda IgG pomoću ELISA. Odgovor IgG protutijela na OVA porastao je s povećanjem doze primjene WPCD (100 i 400 ug) na način ovisan o dozi (Slika 4). Optimalna koncentracija bila je 100 ug/mL WPCD-a i povećala je IgG odgovore dva puta u usporedbi sa samim OVA-om 21., 35. i 49. dana (Slika 4A). Dobivena su značajna povećanja u razinama OVA-specifičnih IgG1 i IgG2a protutijela ispod 20 i 100 ug WPCD primjene u usporedbi s OVA grupom u serumu 35. dana (Slika 4B). U međuvremenu, Alum je pospješio samo razine ekspresije OVA-specifičnih IgG i IgG1 protutijela u imuniziranih miševa. Sam WPCD nije pokrenuo antitijela specifična za OVA. Gornji rezultati očito pokazuju da je WPCD generirao više titre antitijela i uravnoteženije Th1/Th2 odgovore od Stipse.

Proliferacija splenocita još je jedan pokazatelj stanične imunosti. ConA stimulira T-stanice, a LPS stimulira proliferaciju B-stanica. Dana 21. nakon prvog cijepljenja, dobivena je suspenzija pojedinačnih splenocita i stimulirana s OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptidom, ConA (5 ug/mL) i LPS (5 ug/mL) tijekom 48 h. Zatim je MTT metodom mjerena proliferacija T stanica. WPCD je mogao značajno potaknuti OVA-antigen, Con A-mitogen i LPS mitogen-stimuliranu proliferaciju splenocita u miševa imuniziranih s OVA i WPCD (Slika 5), ​​a optimalna koncentracija WPCD bila je 100 ug/mL. Ovi podaci pokazuju da bi WPCD kao adjuvans cjepiva kod miševa imuniziranih s OVA mogao učinkovitije inducirati aktivaciju T-stanica i B stanica nego stipsa.

Svi testirani WCPD adjuvansi formulirani s OVA cjepivima generirali su jednako snažan humoralni i stanični imunitet (Slike 4 i 5). Na temelju ovih podataka, kako bismo dodatno procijenili utjecaje WPCD-a na OVA-specifičan odgovor T pomoćnih (Th) stanica, dodatno smo analizirali ekspresiju citokina u CD8 plus i CD4 plus T stanicama protočnom citometrijom (Slika 6). Dana 21. nakon prvog cijepljenja, izoliran je jedan splenocit miševa i potom ko-kultiviran s OVA (10 ug/mL). Prinos IL-4 u CD4 plus T stanicama u skupini kojoj je primijenjeno 100 ug OVA/WPCD bio je značajno veći od onog u skupini OVA/Alum i OVA skupini i sličan onom u PMA (Slika 6A). Štoviše, prinos IFN-a u CD8 plus i CD4 plus T stanicama također je značajno povećan u miševa kojima je primijenjen OVA/WPCD (20, 100 i 400 ug) (Slika 6B i 6C). U usporedbi s Alum adjuvansom, WPCD je pokazao bolju sposobnost indukcije IL-4 i IFN-sekrecije iz T stanica.

WPCD stimulira sazrijevanje DC-a i smanjuje frekvenciju Treg in vivo

DCS je prepoznat kao najsnažniji APC uključen u pokretanje primarnih imunoloških odgovora. Stoga smo 3. dana nakon prvog cijepljenja također istraživali učinke WPCD-a na CD40 i CD80 na DC u slezeni kod miševa (Slika 7A i 7B). Miševi u skupini 100-ug OVA/WPCD proizveli su znatno više razine CD40 i CD80 na DC nego oni u skupini OVA/Alum. Ovi podaci su pokazali da WPCD može aktivirati DC i inducirati sazrijevanje DC u miševa. Treg stanice mogu uravnotežiti toleranciju i imunološke odgovore. Da bi se dalje istražilo kako je WPCD modulirao imunološki odgovor, Treg stanice u slezeni kod miševa su obojene priborom za bojenje mišjih regulatornih T stanica. 21. dana nakon prvog cijepljenja opažena je smanjena učestalost CD25 plus Foxp3 plus Treg stanica u ukupnim CD4 plus T stanicama (Slika 7C). U usporedbi sa skupinama OVA i OVA/Alum, skupina WPCD pokazala je značajno smanjenu Treg učestalost.

Procjena sigurnosti WPCD-a u miševa

Kako bismo procijenili oralnu akutnu toksičnost, proveli smo test akutne toksičnosti. Miševi kojima je oralno davano 5000 mg/kg tjelesne težine nisu pokazali abnormalno ponašanje ili nuspojave i nije pronađena smrtnost u testu procjene toksičnosti. Nije zabilježena značajna razlika u prirastu tjelesne težine, indeksu timusa i indeksu slezene među različitim skupinama miševa kojima su davane različite doze WPCD-a i nije bilo značajne razlike (Tablica 1). Nije primijećena smrtnost nakon 14 dana. Stoga je vrijednost LD50 za WPCD bila veća od 5000 mg po kg tjelesne težine.

Kako bi se ispitalo ima li WPCD negativne učinke na rast miševa, prije i nakon supkutanog cijepljenja, određena je tjelesna težina za svakog miša (tablica 2). U naknadnom promatranju miševa, nuspojave ili abnormalno ponašanje nisu uočene. Osim toga, tjelesna težina miševa kojima je davan WPCD i miševa kojima je davana fiziološka otopina ili OVA/Alum nije pokazala značajnu razliku. Ovi rezultati promatranja pokazali su da je primjena WPCD-a bila sigurna.

Rasprava

Adjuvansi su ključne komponente u cjepivima [31]. Zbog napretka u genomici i proteomici, identificira se sve više rekombinantnih i sintetskih molekula cjepiva. Stoga je potrebno više pomoćnih sredstava i formulacija. Neki jaki adjuvansi općenito su povezani s povećanom toksičnošću, na primjer, FCA. Stoga je potrebno pronaći sigurnu formulaciju koja sadrži različite sinergističke komponente koje na kraju pokreću željeni imunološki odgovor. Polisaharidi iz kineskog bilja nisu toksični i ne pokazuju značajne nuspojave [32,28]. Za određeno cjepivo potreban je siguran adjuvans.

Cistanche deserticola važna je tonična biljka i široko rasprostranjena u sušnim zemljama i toplim pustinjama na sjeverozapadu Kine. Cistanche deserticola široko je zabrinuta zbog svoje bioaktivnosti uključujući imunomodulatorne, antioksidativne, antibakterijske i antitumorske učinke [20,21]. Postignut je određeni napredak u strukturnoj karakterizaciji i imunološkoj aktivnosti Cistanche deserticola, koja je dobar kandidat za razvoj pomoćnih sredstava. Eksperimentalno smo procijenili adjuvantne učinke i mehanizam WPCD in vitro i in vivo. Subkutana primjena WPCD-a značajno je pospješila humoralni i stanični imunološki odgovor povećanjem serumskih antitijela i proliferacije limfocita, pojačavanjem ekspresije citokina, regulacijom DC sazrijevanja i regulacijom naniže učestalosti CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg stanica.

DCS su ključni APC-ovi za pripremu naivnih T stanica. Aktivacija DC je važna za adjuvanse. DCS, posebno DC dobiveni iz mišje srži, često se koriste za procjenu adjuvansa i cjepiva. Protočna citometrija može razlikovati stanice koje su se aktivirale nakon hvatanja antigena od okolnih stanica. U FCM analizi stupanj agregacije stimuliranih stanica neizravan je pokazatelj procjene sigurnosti imunomodulatora [3]. Prema tome, podaci o aktivnosti adjuvanta WPCD u DC in vitro mogu pružiti vrijedne informacije za životinjske modele. Na temelju BM-DC modela, razine ekspresije MHC-II, CD86, CD80 i CD40, proizvodnja citokina i alogena proliferacija T stanica otkrivene su u optimalnom rasponu koncentracija WPCD. Razine ekspresije MHC-II, CD86, CD80 i CD40 bile su pojačano regulirane u BM-DC, a prinosi TNF-a i IL-12 povećani su ovisno o dozi. Uočena je alogena proliferacija T stanica. Morfologija BM-DC nije promijenjena. Poticanjem aktivacije BM-DC i izlučivanja upalnih citokina in vitro, WPCD adjuvans može značajno povećati količinu antigena i količinu APC-a te stimulirati T-stanice da izlučuju IFN-, što pridonosi poboljšanju imunomodulatorne aktivnosti.

Različiti kineski zeljasti polisaharidi sposobni su aktivirati imunološki sustav i posjeduju izvrsne adjuvantne sposobnosti stimulirajući sazrijevanje DC putem TLR4 [33,28]. Stoga pretpostavljamo da TLR4 sudjeluje u signalnom putu sazrijevanja DC-a induciranog WPCD-om. Kao što se očekivalo, liječenje inhibitorom TLR4 rezultiralo je značajnim smanjenjem TNF-a i IL-12. Nadalje, inhibicija puta TLR4 također je spriječila ekspresiju CD 40 i CD80 na DC-ima, što ukazuje da sazrijevanje DC-a ovisi o TLR4. Stoga je očito da TLR4 sudjeluje u sazrijevanju DC-a izazvanih WPCD-om.

Optimalna doza adjuvansa i formulacije cjepiva empirijski se određuje u mnogim eksperimentima. Kako bismo istražili odnos doza-odgovor WPCD adjuvansa i OVA antigena kod miševa, odabrali smo različite WPCD doze na temelju prethodno prijavljenih podataka iz BM-DCs in vitro za supkutanu primjenu ICR miševa dva puta. Otkrili smo da je WPCD značajno povećao prinos OVA-specifičnih protutijela i inducirao uravnotežen Th1/Th2 imunološki odgovor s povećanjem razina IgG1 i IgG2a. Konkretno, razina IgG2a bila je viša od one tretirane Alumom u optimalnoj dozi. Stoga je WPCD rezultirao višim razinama specifičnih protutijela i većom učinkovitošću s nižim injekcijama.

Nova cjepiva zahtijevaju indukciju snažnih staničnih odgovora, koji uključuju protutijela, T pomoćne (Th) stanice i citotoksične T limfocite (CTL). Terapeutsko cjepivo ima za cilj potaknuti jače odgovore T-stanica. Idealan adjuvans povećava snagu cjepiva i potiče stanično posredovanu imunost bez izazivanja toksičnih učinaka [34]. Među opažanjima na modelima imuniziranih miševa, WPCD je doveo do povećanja OVA-specifične i nespecifične proliferacije splenocita u usporedbi s alumom. Neki adjuvansi pojačavaju citokine i imunološki sustav. Na primjer, saponini mogu stimulirati stanično posredovane imunološke odgovore na antigen koji inače inducira samo antitijela. Odabrali smo IL-4 i IFN- kao indikatore za neizravnu procjenu razine imuniteta kod miševa. WPCD bi mogao inducirati više izlučivanja IL-4 i IFN-a od stipse. Stoga su primijećeni snažni odgovori T-stanica pomoćnika i izlučivanje citokina kao rezultat WPCD cijepljenja, što sugerira da bi WPCD mogao učinkovitije stimulirati limfocite da izlučuju citokine tipa Th1- i citokine tipa Th2- Stipsa.

Adjuvansi koji utječu na prezentaciju antigena mogu utjecati na složene imunološke procese. Treg stanice mogu modulirati Th1 i Th2 odgovore [35]. Odgovarajuća doza WPCD-a može potaknuti sazrijevanje DC-a u miševa povećanjem razine ekspresije CD80 i CD40 i pojačavanjem sposobnosti prezentacije OVA antigena u ranom imunološkom odgovoru. Eksperimentalni rezultati DCS aktivacije i Treg frekvencije pokazali su da WPCD inducira sazrijevanje DC i smanjuje Treg frekvenciju u slezeni kod miševa. Ovi rezultati su dokazali da je WPCD povećao učinkovitost OVA cjepiva povećanjem ciljanja stanica koje prezentiraju antigen i promicanjem specifične aktivacije T-stanica.

U razvoju pomoćnih sredstava, teško je selektivno izazvati odgovarajući imunološki odgovor protiv odgovarajuće infekcije. Odgovarajuće pomoćno sredstvo mora imati niske nuspojave i toksičnost za ljude ili životinje. Stoga treba razmotriti sigurnost WPCD-a, uključujući neposredne i dugoročne nuspojave. U ovoj studiji istraživali smo akutnu toksičnost WPCD-a i negativan učinak WPCD-a na učinak rasta miševa tijekom 110 dana. Rezultati akutne toksičnosti WPCD-a pokazali su da tjelesna težina, indeks timusa ili indeks slezene nisu imali značajne razlike. Vrijednost LD50 za WPCD bila je veća od 5000 mg po kg tjelesne težine. Tijekom eksperimentalnog naknadnog promatranja miševa nije pronađena nikakva nuspojava ili abnormalno ponašanje kod miševa. Ovi rezultati pokazuju da je WPCD siguran.

Zaključno, u ovoj studiji, WPCD, sirovi polisaharid ekstrahiran iz C. deserticola iz Xinjianga, pokazao je neka svojstva adjuvansa. Na primjer, WPCD je pojačao Th1 i Th2 odgovore aktiviranjem DC-a, povećanjem odgovora antitijela, poboljšanjem proizvodnje citokina. Štoviše, istražili smo mehanizam učinkovitosti WPCD-a analizom sazrijevanja i funkcioniranja DC-a putem puta TLR4 in vitro. Kod miševa liječenih samo WPCD-om nije primijećena očita nuspojava. Stoga je WPCD imao veću imunostimulirajuću aktivnost u staničnom i humoralnom imunološkom odgovoru. Adjuvansi su mješavina nekoliko spojeva. Mješavina nekoliko sirovih ekstrakata može imati veće blagotvorne učinke od jednog biljnog ekstrakta. Potrebno je sustavno istraživati ​​WPCD ekstrakte, testirati njihovu učinkovitost i sigurnost te rasvijetliti mehanizme njihova djelovanja.

Popratne informacije

S1 datoteka. DOLAZAK Kontrolni popis. (DOCX)

Priznanja

S posebnom zahvalnošću Bingu Wangu i Daocheng Wuu na pružanju dobrih ideja u eksperimentima.

Autorski doprinosi

Konceptualizacija: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Kuriranje podataka: Xiumei Yang, Yu Yang. Formalna analiza: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Stjecanje sredstava: Ailian Zhang. Administracija projekta: Ailian Zhang.

Resursi: Ailian Zhang, Gan Zhao. Pisanje – izvorni nacrt: Ailian Zhang.

Pisanje – recenzija i uređivanje: Ailian Zhang, Daocheng Wu.