Imunomodulatorni čimbenici u Cistanche Salsi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Shinjiro MARUYAMA," Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Cistanche salsa(CAMever) G.Beck, Orobanchaceae je parazitska biljka koja se u Japanu koristi kao istočnjački medicinski tonik. U našoj prethodnoj studiji otkrili smo da ekstrakt C, salsa pojačava proizvodnju i IgM i IgG u ljudskim limfocitima limfnih čvorova. Nadalje, C, salsa dijalizat (CSD) pripremljen korištenjem membrane za dijalizu s a3.500-Da granična molekularna težina pojačava proizvodnju IgM u ljudskoj B-staničnoj liniji BALL-1; osim toga, inducirao je laganu proliferaciju stanica. Međutim, nasuprot tome, CSD je inducirao inhibiciju rasta praćenu apoptozom u staničnoj liniji humanog Burkittovog limfoma Namalwa. Ovi rezultati ukazuju na moguću prisutnost aktivnih sastojaka u CSD-u koji su specifični za limfocite. Do sada, kemijska svojstva ovih sastojaka nisu razjašnjena. U ovoj studiji istraživali smo kemijska svojstva aktivnih sastojaka u CSD-u. Obje gore navedene aktivnosti u B-staničnim linijama nisu inaktivirane tretmanom CSD-a u autoklavu. Korištenjem kromatografije na stupcu gel filtracije, otkrili smo da su vršci aktivnih frakcija koncentrirani u različitim frakcijama. Naši rezultati sugeriraju da postoje najmanje 2 vrste aktivnih sastojaka u CSD-u, a oni mogu biti polisaharidi budući da su topljivi u vodi sastojci visoke molekularne težine i termostabilni.

Ključne riječi: Cistanche salsa, visoka molekularna težina, IgM, inhibicija rasta.

Uvod

Cistanche salsa(CA Meyer) G.Beck, Orobanchaceae je parazitska biljka koja se u Japanu koristi kao istočnjački medicinski tonik. U Kini je ova biljka važan tradicionalni lijek koji se koristi za liječenje nedostatka bubrega i neurastenije. Kroz in vitro studije, već smo izvijestili o učincima C. salse na imunološki sustav. Prvi. pokazali smo da ekstrakt C. salsa pojačava proizvodnju IgM i IgG u ljudskim limfocitima limfnih čvorova. Drugo, pokazali smo da C. salsa dijalizat (CSD) pripremljen upotrebom dijalizne membrane s graničnom molekularnom težinom od 3,500-Da pojačava proizvodnju IgM u ljudskoj B-staničnoj liniji BALL-1; osim toga, u maloj je mjeri inducirao staničnu proliferaciju.2 Nadalje, CSD ima suprotan učinak pri čemu inducira inhibiciju rasta praćenu apoptozom stanične linije ljudskog Burkittovog limfoma, Namalwa.3) Ovi nalazi sugeriraju da je ovaj učinak CSD-a povezan s aktivacija B stanica, dok je apoptoza rezultat nedostatka drugih signala koji su potrebni za diferencijaciju B stanica, kao što su citokini i kontakt stanica-stanica; međutim, kemijska svojstva CSD-a nisu razjašnjena ni u jednoj od prethodnih studija. Stoga smo u ovoj studiji istražili kemijska svojstva aktivnih sastojaka u CSD-u.

Materijali i metode

CSD je pripremljen istom metodom u našem prethodnom istraživanju. CSD je otopljen u fosfatno puferiranoj slanoj otopini (PBS) u koncentraciji od 20 mg/ml. Pripremljena otopina (0.8 ml) je propuštena kroz filter (0.22 um) prije nanošenja, a zatim je eluirana istom otopinom kroz kolone koje sadrže TOYOPEARL HW-40F (10×96,5 cm; Tosoh Corp., Japan),TOYOPEARL HW-55F(10 × 98.0 cm; Tosoh Corp., Japan) i Sephacryl S-400HR(1.0×98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd.,.Engleska); i zatim su sakupljene frakcije od 1 ml (30 kapi). Za određivanje praznog volumena gelova i približne molekularne težine (MW) frakcioniranih sastojaka, plavi dekstran (BD) (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan); i dekstrane poznate MW dobivene iz Leuconostoc spp. (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan), tj. MW2, 000kDa(D1), 500kDa(D2),70 kDa (D3) i 6 kDa (D4); i cijanokobalamin (VB12, MW:1355.4) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan). Ukupni sadržaj šećera i proteina u svakoj frakciji određen je metodom fenol-sumporna kiselina i Lowry metodom s kompletom za analizu proteina PIERCETM bicinhoninskih kiselina (BCA) (Thermo Fisher Scientific Inc., SAD). Kao odgovarajući standardi korišteni su glukoza i goveđi serum albumin. Nadalje, izmjerena je apsorbancija na 320 nm (A:2o) svake frakcije. Vrhovi eluacije plavog dekstrana i cijanokobalamina određeni su njihovom vrijednošću apsorbancije na 260 nm, a vrhovi dekstrana poznate MW određeni su korištenjem metode fenol-sumporne kiseline. CSD je autoklaviran na 120 stupnjeva 20 minuta kako bi se procijenila njegova termostabilnost. U biološkim testovima, kultura stanica i mjerenje IgM provedeni su istom metodom u našoj prethodnoj studiji.

Ekstrakt salse Cistanche

Rezultati i rasprava

Slika 1 prikazuje kolonske kromatograme gel filtracije CSD-a na HW-40F. Sa slike la, procijenjena je молекулярнa masa aktivnih sastojaka na više od 6 kDa na temelju dekstranskog markera D4. Nadalje, obje aktivnosti CSD-a, tj. povećanje proizvodnje IgM i induciranje inhibicije rasta, nisu deaktivirane tretmanom u autoklavu (Slika 2), iako su se neki sastojci agregirali i izgubili nakon što je CSD prošao kroz 0.{{6} }um filter. Obrasci eluiranja CSD-a i autoklaviranog CSD-a bili su gotovo identični, međutim, relativna aktivnost povećanja proizvodnje IgM u autoklaviranom CSD-u bila je niža od netretiranog CSD-a. Čini se da su neki od razloga to što su agregati sadržavali aktivne sastojke ili su neki od aktivnih sastojaka bili inaktivirani. Rezultati kromatografije na HW-55F pokazali su moguću prisutnost 2 tipa imunomodulacijskih čimbenika: prvi, koncentriran u fr. br.32. bio je aktivni sastojak visoke molekularne težine (HCS) koji je mogao povećati proizvodnju IgM, dok je drugi, koncentriran u fr. br. 50, bio je aktivni sastojak srednje molekularne težine (MCS) koji je mogao inhibirati staničnu proliferaciju (Slika 3). Međutim, vršne vrijednosti dobivene i za HCS i za MCS (fr.br.32 i 50 redom) nisu bile tako oštre kao one za dekstrane poznate MW (podaci nisu prikazani). Ova zapažanja ukazuju na mogućnost postojanja nusproizvoda umjetno stvorenih tijekom pripreme CSD-a, polimera aktivnih sastojaka koji se lako uništavaju i sastoje se od više jedinica ili raznih aktivnih sastojaka koji imaju različite izvorne MW. Obrasci ispiranja na kromatogramima pokazuju da nije lako dobiti čiste sastojke iz HCS i MCS budući da se čini da postoje različiti sastojci koji imaju malo različite MW kao što je gore spomenuto. Iako su obje mješavine aktivnih sastojaka, čini se da HCS sadrži sastojke čija je molekulska masa veća od 70 kDa, dok MCS sadrži one s molekulskom masom većom od 6 kDa. HCS je eluiran na HW-55F u frakciji koja je bila izvan raspona razdvajanja. Na Sephacryl-S400.a dio HCS(fr.no.36) je eluiran u istoj frakciji kao D1 marker, koji ima MW 2,000 kDa (Slika 4). Općenito, polisaharidi i proteini se uzimaju u obzir kao u vodi topivi sastojci visoke MM u biljnim ekstraktima. Budući da se gotovo svi funkcionalni proteini inaktiviraju toplinskom obradom, čini se da su polisaharidi. Međutim, Park et. al. objavili su termostabilni citotoksični mali protein nazvan viskotoksin, koji se priprema iz ekstrakta imele (Viscum album L., Viscaceae).4 Nadalje, pokazalo se da viskotoksini pojačavaju imunomodulatornu aktivnost ljudskih prirodnih stanica ubojica.5 Na slici 3, MCS, koji ima nižu MW, pokazuje veći sadržaj proteina. Uzimajući u obzir ove činjenice, MCS može biti polisaharid vezan za protein8 ili može biti termostabilan protein poput viskotoksina. Ovi rezultati pokazuju da 2 aktivna sastojka mogu biti polisaharidi. U suprotnom, MCS bi mogli biti termostabilni proteini.

Reference

1) Deng, M., Zhao, JY, Ju, XD, Tu, PF, Jiang, Y., Li, ZB: Zaštitni učinak tubulozida B na TNF alfa-induciranu apoptozu u neuronskim stanicama. Acta Pharmacol. Sin.,25, 1276-1284,2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Ekstrakt salse Cistanchepojačana proizvodnja IgM u humanoj B staničnoj liniji, BALL-1.J. Trad. Med.,24,209-211,2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H:Cistanche salsaapoptoza izazvana ekstraktom u staničnoj liniji humanog Burkittovog limfoma Namalwa. J.Trad. Med.,25,24-27,2008.

4) Park. JH, Hyun, CK, Shin HK: Citotoksični učinci komponenti toplinski obrađene imele (Viscum album). Cancer Let, 139, 207-213,1999.

5) Tabasco, J., Pont, F, Fournic, JJ, Vercellone, A.: Viskotoksini imele povećavaju citotoksičnost posredovanu stanicama prirodnih ubojica. Eur.J. Biochem., 269, 2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, LX: Antikancerogeni učinci i mehanizmi polisaharida-K (PSK): implikacije imunoterapije raka. Anticancer Res.,22,1737-1754,2002.

dodaci cistanche