Identifikacija uobičajenih jetrenih metabolita prirodnog bioaktivnog spoja ehinakozida, pročišćenog iz Cistanche

3.1. Kvantifikacija ehinakozida A u S9 analizi jetre štakora i čovjeka

ehinakozidA je ispitan uporabom frakcija S9 jetre štakora i čovjeka i kvantificiran pomoćuHPLC-QQQ/MS u različitim vremenskim točkama. Preostali stihovi vremenski profil ehinakozidaA, u tretmanu S9 frakcijom jetre štakora i čovjeka, prikazani su na slici1. Koristeći 'dobro promiješanumodel' i izračun formule [27], predviđena vrijednost prikazana je u tablici1. Štakorjetra S9 metabolizira ~75,4 posto ehinakozida A unutar 60 minuta. Ljudska jetra S9 metabolizirana~49,8 posto ehinakozida A unutar 120 min. U prisutnosti NADPH, ehinakozid A je biometabolizira se sporije, s at1/2 = 114.92 min kod ljudi. EH je frakcija lijekafiltrira se u jetri u jednom prolazu, u kojem se lijek nepovratno uklanja (ekstrahira).Otkrili smo da je EH štakora bila je veća od one kod ljudi. Ovaj rezultat je razuman,sudeći premat1/2 vrijednosti, jer je zabilježeno da se jetra štakora metabolizira brže odljudska jetra [28]. U usporedbi s drugim izvješćima o spojevima koji koriste jetru štakora S9, GKB202 odtheAntrodia cinnamomeamicelij (t1/2 = 3.68 min) metaboliziran je brže od ehinakozid A [29]. 

Slika 1.EhinakozidProfil preostalog vremena u jetri štakora i čovjeka S9. Podaci su prikazani usrednje vrijednosti trostrukih mjerenja.

Prethodno izvješće pokazalo je da nije bilo uočenih štetnih učinaka od 3 g/kgtjelesna težina/dan HE obogaćen ehinakozidom A u 28--dnevnom oralnom hranjenju u štakora Sprague–Dawley.Trenutačna studija unosa doze za metabolizam jetrenih stanica daje razumnu korelaciju,s prethodnimin vivostudija farmakokinetike spoja ehinakozida A (PK) [30,31]. U jednom nedavnomin vivoizvješće, Tsai et al. skupina je otkrila ehinakozid A u plazmi štakora nakonoralna primjena HE micelija (50 mg/kg) na 60 min [32]. Ovo može biti u korelaciji sTrenutnoin vitronalazima, u kojima smo teoretski pokazali da još uvijek postoji ~24,6 postoostatak spoja nakon S9 metabolizma u jetri štakora. Osim toga, otprilike polnemetaboliziranog ehinakozida A pronađeni su u preostaloj ljudskoj jetri S9, pokazujućida kompletne složene strukture mogu ući u krvotok, što pridonosi njegovomučinkovitost u neuroprotekciji. Bez obzira na to pružaju li uobičajeni metaboliti,biološka funkcija je još pod istragom i bit će objavljena u zasebnoj studiji

Kliknite ovdje da saznate funkciju Cistanche Echinacoside

3.2. In vitro identifikacija metabolita kod štakora i čovjeka

Tekućinska kromatografija ultraučinkovitosti/kvadrupolna time-of-flight masena spektrometrija (UPLC-QTOF/MS) korištena je za identifikaciju metabolita u pozitivnom i negativnom načinu rada. Usporedba metabolita ehinakozida A, u ovoj studiji, s metabolitima S9 jetre štakora i čovjeka prikazana je u tablici2. Dvadeset i četiri metabolita pronađena su nakon inkubacije ehinakozida A i dodijeljeni su kao M1-M24 (Tablica S1). Pet uobičajenih metabolita otkriveno je nakon inkubacije s jetrom štakora i čovjeka S9. Masovne pogreške bile su sveManje od ili jednako5 ppm. Tri najzastupljenija metabolita, na temelju površine vrha, bila su glutationska konjugacija plus demetilacija (M6), demetilacija (M2) i demetilacija plus hidrogenacija (M3). Dehidracija alkohola (M1), demetilacija (M2), demetilacija plus hidrogenacija (M3), 2× Hidroksilacija (M4), demetilacija i dva hidroksilacija (M5) metabolita identificirani su u štakorskoj i ljudskoj jetri S9. Predloženi metabolički put i mogući metaboliti ehinakozida A prikazani su na slici2. 

Tablica 2.Uobičajeni jetreni metaboliti ehinakozida A otkriveni su u štakorskoj i ljudskoj jetri S9, sUPLC-QTOF/MS.

Osnovni spoj formule ehinakozida A bio je C25H36O6. MS spektarehinakozidA je pronađen na [M plus H]plus= 433.2573 i [M plus Na]plus= 455.2405 (Slika3A). TheMS/MS spektar energijom sudara od 10 V prikazan je na slici3B koji odgovaracijepanje CO eterske veze ([C20H29O2] plus= 301.2162 i [C20H27O]plus= 283.2052) (Lik3C) [15,32]. Formula metabolita dehidracije alkohola (M1) bila je C25H34O5, s ehinakozidom A koji gubi H2O [33,34]. MS spektar M1 nađen je na [M plus H]plus= 415.2472 i [M plus Na]plus= 437.2255. Pri energiji sudara od 10 V, glavni produkt ionabilim/z 283.2036, 215.1701, 181.1249, 135.0817, 119.0856, 105.0709 i 69.0327 (Slika4A). Dva proizvodaioni su bili analogni onima iona ehinakozida A (m/z 283.2036 im/z 119.0856), i proizvodnjam/z 301.2162 nestao. Dehidriran M1 bi mogao bitikoristi se za označavanje gubitka vode u fragmentima pentoze [35]. Metaboliti demetilacije (M2)formula je bila C24H34O6, s ehinakozidom A koji gubi metilen (-CH2) [36]. Pri sudaruenergije od 40 V, MS spektar M2 nađen je na [M plus H]plus= 419.2407. Glavni proizvodioni su bilim/z 312.0488, 269.9469, 231.0432, 123.0552 i 179.0486 (Slika4B). Proizvodnjanam/z 269.9469, 179.0486 odgovara cijepanju metilena (-CH3) i plusHplus. Formula metabolita demetilacije i hidrogenacije (M3) bila je C24H36O6 sM2 redukcija u alkenu ( plus H2) [37–39]. MS spektar M3 nađen je na [M plus H]plus= 421.2569 i [M plus Na]plus= 443.2355. Pri energiji sudara od 40 V, glavni proizvodioni su bilim/z 353.2141, 277.2183, 147.1172 i 77.0054 (Slika4C). Proizvodnja um/z 353.2141, 277.2183 odgovaraju hidrogenaciji. 2× Hidroksilacijaformula metabolita (M4) bila je C25H36O8 s ehinakozidom A Hidroksilacija izopropilbočni lanac i ciklopenten [40–42]. MS spektar M4 nađen je na [M plus H]plus= 465.2461 i [M plus Na]plus= 487.2315. Pri energiji sudara od 20 V, glavni produkt iona bio jem/z 297.1842, 255.1389, 177.1115, 133.0860 i 89.0597 (Slika4D). Proizvodnja um/z 297.1842 i 89.0598 odgovaraju hidroksilaciji. Demetilacija iformula dva metabolita hidroksilacije (M5) bila je C24H34O8 pri čemu M11 gubi metilen(-CH2). MS spektar M5 nađen je na [M plus H]plus= 451.2413 i [M plus Na]plus= 473.2158. Pri energiji sudara od 40 V glavni produkt iona bio jem/z 321.1516, 178.1225, 101.0705 i 59.0601 (Slika4E). Proizvodnja um/z 321.1516 odgovaralo je M4cijepanje metilena (-CH3) i plus Hplus.

Bilo je 70 različitih sekundarnih metabolita izoliranih iz sporofora HEodnosno micelija. Ovi metaboliti su identificirani kaopolisaharidi, poliketidi,fenoli, terpenoidi, ibioaktivne molekule [43–45]. Nagađali smo da ovi uobičajeni metaboliti,koje smo analizirali, također mogu biti prekursori ili intermedijarni proizvodi micelijaprije spomenuti sekundarni metaboliti. Ipak, objavljeno je da su M1, M2,M3, M4 i M5 mogu predstavljati ključne intermedijere između ehinakozida A i sekundarnogmetaboliti za studije na štakorima i ljudima. Zbog sve veće upotrebe HE micelija kao afunkcionalni dodatak, identificiranje ovih metabolita također će otkriti korisne biomarkere.Uzimajući kolesterol kao primjer, prethodnici ili međuprodukti raznihtvari, proizvedene procesom jetrenih enzima, metabolizirane su u oksisterol, koji jesada se shvaća kao snažan metabolit u metabolizmu sterola iregulacija sinteze [46]. 

Slika 3.(A) MS spektar ehinakozida A s tandemom tekućinske kromatografije ultravisoke učinkovitostiquadrupole time-of-flight masena spektrometrija. (B) MS/MS spektar ehinakozida A s antekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti - tandemska kvadrupolna time-of-flight masena spektrometrija.(C) Predložene strukture proizvodnih iona, koje proizvodi ehinakozid A, pri energiji sudara od 10 V.(a) [C20H29O2]plus= 301.2162, (b) [C20H27O]plus= 283.2052.  : Matični ion.

Slika 4.MS i MSMS spektar (A) Dehidracija alkohola (M1), (B) Metaboliti demetilacije(M2), (C) Metaboliti demetilacije i hidrogenacije (M3), (D) 2 × Metaboliti hidroksilacije (M4),(E) Demetilacija i dva metabolita hidroksilacije (M5) pomoću tekućine ultra visokih performansichromatography-tandem quadrupole time-of-flight masena spektrometrija. : Matični ion.

M2 i M3 otkriveni su nakon 60 minuta za jetru štakora S9, dok za ljudskujetra S9, M2 i M3 detektirani su nakon 10, 30, 60 i 120 min. Pretpostavljali smo da bi se M3 mogao proizvestiputem dva različita metabolička puta; jedan od ehinakozida A do M3, a drugi je izvedenod M1. Nasuprot tome, M4 i M5 su otkriveni nakon 10, 30 i 60 minuta štakorajetra S9. U ljudskimjetre S9, M4 je otkriven nakon 10, 30, 60 i 120 min. M5 je otkriven na120 min. Vrijemeizgleda može objasniti da metabolički put M5 može biti izveden iz M4.

Ova studija pruža dodatne informacije za kliničke studije HE micelijainformacije koje nedostaju, a to je metaboličko djelovanje bioaktivnog spoja. Unedavna randomizirana, dvostruko slijepa placebom kontrolirana studija, tri 350 mg/g HE micelija(sadrže 5 mg/g ehinakozida A) kapsule intervencije, tijekom 49 tjedana, pokazale većeInstrument za provjeru kognitivnih sposobnosti, Mini-mentalno stanje pregled, iinstrumentalAktivnosti Daily Living rezultatai postigla bolju kontrastnu osjetljivost, kod bolesnika sdob > 50 godina i dijagnozavjerojatna Alzheimerova bolest, u usporedbi splacebo grupa [19]. Razumijevanjem profila metabolita ehinakozida A možemo protumačitidaechinacoside A obogaćen HE micelijem poboljšao je neurokognitivni poremećaj, što bi moglo bitipridonio uglavnom iz nemetaboliziranog spoja. Što se tiče ehinakozida A,metaboliti sudobro podnosi i mogao bi biti važan u postizanju neuronutritivnih koristi, što ćeistražiti u budućim studijama. 

Ovo je prva studija koja je uspostavila analizu metaboličke stabilnosti spektrometrijom masei identificirati petnaest uobičajenih metabolita ehinakozida A pronađenih u štakorskoj i ljudskoj jetri S9razlomci. Rezultati ove studije pomoći će u razumijevanju karakteristika, sigurnosti iučinkovitost ovog jedinstvenog bioaktivnog spoja. Naši rezultati to pokazujuehinakozid Aje kliničkikoristi mogu proizaći iz spoja i njegovih metabolita. U budućnosti ćemo analiziratimetabolita iz krvi, organa i tkiva kako bi se uspostavila potpuna baza podataka o metabolizmu.Očekuje se da će takav rad pomoći u funkcionalnom istraživanju hrane, prehrambenih dodataka iprecizna medicina.

Dopunski materijali:Sljedeće je dostupno online na1, Tablica S1: Identitet metabolita ehinakozida A u štakorskoj i ljudskoj jetri S9s UPLC-QTOF/MS.

Doprinosi autora:Tumačenje podataka, Y.-HK, T.-WL, J.-YL, Y.-WC i T.-JL; metodologija;Y.-HK, T.-WL i T.-JL; istraga koju su proveli T.-JL i C.-CC; sirovine osigurava:Y.-HK, T.-WL, J.-YL, Y.-WC, T.-JL i C.-CC; vizualizacija: Y.-HK; originalna priprema nacrtaučinili su Y.-HK, T.-WL, T.-JL i C.-CC; pisanje—recenzija i redakcija, Y.-HK, T.-JL iC.-CC Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje:Ovo istraživanje nije dobilo vanjska sredstva.

Izjava o dostupnosti podataka:Sirovine i spojevi predstavljeni u ovoj studiji su dostupniod odgovarajućeg autora na zahtjev.

Sukob interesa:Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Dostupnost uzorka:Uzorci spojeva dostupni su od autora.

Reference

1. Mitra, V.; Metcalf, J. Funkcionalna anatomija i prokrvljenost jetre.Anaesth. Intenzivna njega Med.2009, 10, 332–333. [CrossRef] 

2. Alamri, ZZ Uloga jetre u metabolizmu: ažurirani pregled s fiziološkim naglaskom.Int. J. Basic Clin. Pharmacol.2018, 7, 2271. [CrossRef] 

3. Russell-Jones, G. Potencijalna upotreba endocitoze posredovane receptorima za oralnu dostavu lijekova.Adv. Lijek Deliv. vlč.1996, 20, 83–97. [CrossRef] 

4. Shugarts, S.; Benet, LZ Uloga prijenosnika u farmakokinetici oralno primijenjenih lijekova.Pharm. Res.2009, 26, 2039–2054. [CrossRef]

5. Richardson, SJ; travanj, B.; Kulkarni, AA; Moghaddam, MF Učinkovitost u otkrivanju lijekova: Analiza frakcije jetre S9 kao ekranza metaboličku stabilnost.Lijek Metab. Lett.2016, 10, 83–90. [CrossRef] 

6. Corsini, A.; Bortolini, M. Ozljeda jetre izazvana lijekovima: uloga metabolizma i transporta lijekova.J. Clin. Pharmacol.2013, 53, 463–474. [CrossRef] [PubMed] 

7. Lam, WW; Chen, J.; Xu, RF; Silva, J.; Lim, H.-K. Identifikacija metabolita u otkrivanju lijekova. UOptimizacija u otkrivanju lijekova.Metode u farmakologiji i toksikologiji; Caldwell, G., Yan, Z., ur.; Humana Press: Totowa, NJ, SAD, 2014.; str. 445–459.

8. Prasad, B.; Garg, A.; Takwani, H.; Singh, S. Identifikacija metabolita tekućinskom kromatografijom-masenom spektrometrijom.TrAC trendovianalno Chem.2011, 30, 360–387. [CrossRef] 

9. Zhang, D.; Luo, G.; Ding, X.; Lu, C. Predklinički eksperimentalni modeli metabolizma i dispozicije lijekova u otkrivanju lijekova irazvoj.Acta Pharm. Grijeh. B2012, 2, 549–561. [CrossRef] 

10. Wang, M.; Gao, Y.; Xu, D.; Konishi, T.; Gao, Q.Hericium erinaceus(Yamabushitake): Jedinstveni izvor za razvoj funkcionalnihhrane i lijekova.Funkcija hrane.2014, 5, 3055–3064. [CrossRef]

11. Hu, T.; Hui, G.; Li, H.; Guo, Y. Biofortifikacija selenom uHericium erinaceus(gljiva lavlje grive) i njezinain vitrobioaccessisposobnost.Food Chem.2020, 331, 127287. [CrossRef] 12. Kim, KH; Ne, HJ; Choi, SU; Lee, KR Izohericenon, novi citotoksični izoindolinski alkaloid iz Hericium erinaceum.J. Antibiot.2012, 65, 575–577. [CrossRef] 

13. Khan, MA; Tania, M.; Liu, R.; Rahman, MMHericium erinaceus: Jestiva gljiva s ljekovitim svojstvima.J. KomplementarnoIntegrirati Med.2013, 10, 253–258. [CrossRef]

14. On, X.; Wang, X.; Fang, J.; Chang, Y.; Ning, N.; Guo, H.; Huang, L.; Huang, X.; Zhao, Z. Strukture, biološke aktivnosti iindustrijske primjene polisaharida izHericium erinaceus(Lavlja griva) gljiva: prikaz.Int. J. Biol. Macromol.2017, 97, 228–237. [CrossRef] 

15. Kawagishi, H.; Shimada, A.; Shirai, R.; Okamoto, K.; Ojima, F.; Sakamoto, H.; Ishiguro, Y.; Furukawa, S. ehinakozidi A, B i Cjaki stimulatori sinteze faktora rasta živaca (NGF) iz micelija Hericium erinaceum.Tetrahedron Lett.1994, 35, 1569–1572. [CrossRef] 

16. Lee, KF; Chen, JH; Teng, CC; Shen, CH; Hsieh, MC; Lu, CC; Lee, KC; Lee, LY; Chen, WP; Chen, CC; et al. ZaštitniUčinci odCistanchei njegov izolirani ehinakozid A protiv smrti živčanih stanica izazvane ishemijom ozljedom putemInhibicija iNOS/p38 MAPK i nitrotirozina.Int. J. Mol. Sci.2014, 15, 15073–15089. [CrossRef] 

17. Tzeng, TT; Chen, CC; Chen, CC; Tsay, HJ; Lee, LY; Chen, WP; Shen, CC; Shiao, YJ Cijantinski diterpenoid iSastojci sesterterpenaCistancheUblažite patologije povezane s Alzheimerovom bolešću u APP/PS1Transgeni miševi.Int. J. Mol. Sci.2018, 19, 598. [CrossRef]

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950