Identifikacija i funkcionalna analiza bifavona kao novog inhibitora prolaznih receptorskih potencijalnih aterogenih procesa ovisnih o vaniloidu 4

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comznati više

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei & Shaik O. Rahaman

Ateroskleroza, progresivna upalna bolest velikih arterija, predstavlja najveći doprinos rastućem teretu smrtnosti i morbiditeta povezanih s kardiovaskularnim bolestima na globalnoj razini1. Ključni inicijacijski događaj koji dovodi do ateroskleroze uključuje zadržavanje modificiranih čestica lipoproteina niske gustoće (oxLDL) u subendotelnom intimnom prostoru aorte prvenstveno u točkama arterijskih grana2. Tijekom rane aterogeneze, nakon endotelne disfunkcije, cirkulirajući krvni monociti transmigriraju u područja intime i diferenciraju se u tkivne makrofage3. U intimnim prostorima aorte, vezanje i preuzimanje oxLDL-a od strane makrofaga potpomognutih receptorima čistača kao što su SRA i CD36 stvara naprednu ateroupalnu petlju koja rezultira razvojem lipidima opterećenih pjenastih stanica, kritičnog procesa u aterosklerozi2-8. Kaskade upalnih događaja izazvanih pjenastim stanicama dovode do stvaranja rane masne pruge i na kraju do pojave uznapredovalih ateroskleroznih lezija karakteriziranih prisutnošću fibrozne kapice, kalcificiranog tkiva, imunoloških stanica, proteina matriksa i lipida2-10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) iz podfamilije TRPV, neselektivni, polimodalni kationski kanal propustan za Ca2 plus, sveprisutno je izražen u različitim tipovima stanica uključujući makrofage11-24. Prethodno poznat kao osmosenzor, sada je poznato da TRPV4 reagira na različite biokemijske i biomehaničke podražaje uključujući toplinu, krutost matriksa, osmolarnost, faktore rasta, pH i 4 forbol estera11-24. Prijavljeno je da TRPV4 posreduje u nekoliko fizioloških funkcija poput osjeta boli kod upala i neuropatija18,22,23, diferencijacije i migracije miofibroblasta 17,25,26 i diferencijacije osteoklasta u kosti27. TRPV4 mutacije povezane su s nekoliko kanalopatija28-31. Nedavne studije naše grupe i drugih su ukazale na moguću ulogu ovog kanala u bezbrojnim patološkim stanjima kao što su ozljede pluća22,32, stvaranje pjenastih stanica14,16, fbroza tkiva17,33, odgovor na strano tijelo13 i rak34,35. Prethodno je prikazana ateroprotektivna uloga TRPV4, pri čemu se pokazalo da je funkcija TRPV4 inducirana kemijskim agonistom u endotelnim stanicama povezana s aktivacijom eNOS-a i inhibicijom adhezije monocita na endotelne stanice36. Nasuprot tome, nedostaci u funkcijama TRPV4 povezani su s brojnim ateroinflamatornim odgovorima uključujući endotelnu disfunkciju, smanjeno stvaranje pjenastih stanica makrofaga i vaskularne bolesti14,16,37-39. Naš je laboratorij nedavno identificirao proaterogenu ulogu TRPV4 pri čemu regulira stvaranje pjenastih stanica makrofaga izazvano oxLDL-om. Mehanički, pokazali smo da TRPV4 utječe na unos, ali ne i na vezanje oxLDL u makrofagima na način neovisan o CD36-14. U drugoj studiji izvijestili smo o TRPV4-eksacerbaciji formiranja pjenastih stanica izazvanih oxLDL-om u prisutnosti lipopolisaharida i povećane krutosti matriksa, čime smo uspostavili vezu između mehanosenziranja i rizika od ateroskleroze16. Uzimajući u obzir sve zajedno, ovi nalazi ukazuju na to da je TRPV4 atraktivna meta kod ateroskleroze i drugih bolesti, čime se potiče otkriće malih molekula inhibitora TRPV4 koji se mogu prevesti u klinički učinkovitu terapiju. Upotreba prirodnih spojeva u terapiji postala je sve važnija, prvenstveno potaknuta potrebom za isplativim i biokompatibilnim spojevima u usporedbi s trenutno postojećim sintetskim lijekovima. Prirodni spojevi kao što suflavonoidi, alkaloidi,polifenolii kurkuminoidi utječu na kardiovaskularne bolesti putem različitih mehanizama kao što je inhibicijaproupalnisignale, senzibilizaciju inzulina i poboljšanje profila lipida u krvi ciljanjem na puteve AMPK, COX1/2, eNOS i Nrf240-45. Nedavna istraživanja više skupina identificirala su dva flavonoida, berberin i apigenin, kao potencijalne modulatore aktivnosti TRPV446,47. Razvili smo i upotrijebili polu-produktivnu metodu skrininga za identifikaciju potencijalnih antagonista TRPV4 iz biblioteke prirodnih spojeva korištenjem Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) baziranog na Ca2 plus influx testu. Ovdje izvješćujemo o identifikaciji i funkcionalnoj analizi Linkedina, flavona, kao novog inhibitora aterogenih procesa ovisnih o TRPV4-u makrofagima, postavljajući tako temelje za daljnja istraživanja ovog prirodnog spoja kao prirodnog anti-aterosklerotskog malog molekulski spoj. Prijavljeno je da Linkedin djeluje neuroprotektivno,antikancerogeno, iprotuupalnouloge48,49. Izvještavamo o mehanizmu djelovanja Linkedina protiv TRPV4 u okruženju stvaranja pjenastih stanica makrofaga koristeći brojne biokemijske i stanične testove.

Kliknite ovdje da saznate više

Materijali i metode Kultura životinja i stanica

Kupili smo kongenične miševe C57BL/6 divljeg tipa (WT) od Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, SAD). Za sve pokuse na životinjama slijedile su se smjernice Odbora za brigu i korištenje životinja Sveučilišta Maryland, a autori su se pridržavali smjernica ARRIVE. Za izolaciju rezidentnih mišjih makrofaga (MRM) induciranih tioglikolatom, peritonealna lavaža je sakupljena nakon 4 dana intraperitonealne injekcije tioglikolata, a stanice su održavane u 10 postotnom fetalnom goveđem serumu (FBS) koji sadrži DMEM7,14,16. Stanična linija mišjih makrofaga (RAW264.7) i ljudski dermalni fibroblasti (HDF) kupljeni su od ATCC (Manassas, VA) i uzgajani su s DMEM ili MEM (Gibco, Waltham, MA). Makrofagi dobiveni iz mišje koštane srži (BMDM) sakupljeni su od miševa starih 6- do 7- tjedana, kao što je prethodno opisano14,50,51. Ukratko, sakupljene su bedrene kosti miševa WT i TRPV4 KO, a koštana srž bedrenih kosti je isprana s potpunim DMEM medijem s 10 posto FBS-a. Suspendirane stanice koštane srži filtrirane su kroz cjedilo od 70 µm (BD bioscience), centrifugirane i održavane u DMEM mediju s dodatkom M-CSF (25 ng/mL) 7-8 dana na 37 stupnjeva kako bi se omogućila diferencijacija u makrofage.

Reagensi

Linkedin i GSK1016790A (GSK101) kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), a komplet za ispitivanje FLIPR Calcium 6 nabavljen je od Molecular Device (Sunnyvale, CA). Ljudski nativni LDL (VLDL) kupljen je od Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). Inkubirali smo LDL s 5 µM CuSO4 12 sati na 37 stupnjeva kako bismo pripremili LDL oksidiran bakrom (oxLDL)7,14,16. Označen fluorescentnom bojom, DiI-oxLDL, kupljen je od Invitrogena (Carlsbad, CA), a MCSF od R&D (Minneapolis, MN). Antitijela za FACS analizu bila su: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 i TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugirana sekundarna antitijela bila su iz R&D (Minneapolis, MN), a PE-konjugirane kontrole izotipa bile su iz BD (Franklin Lake, NJ). Za kvantitativnu lančanu reakciju polimerazom (qRT-PCR) upotrijebili smo komplet RNeasy tvrtke QIAGEN (Redwood City, CA). Svi primeri su kupljeni od Bio-Rad (Hercules, CA). Medij stanične kulture, proizvodi povezani sa staničnom kulturom i western blot reagensi dobiveni su od Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche protiv umora

Probir polu-visoke propusnosti

Poduzeli smo polu-visoko propusni probir za antagoniste Trpv4 iz biblioteke od 2000 prirodnih spojeva (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) koristeći fluorometrijski slikovni čitač ploča (FLIPR) temeljen na testu influksa kalcija14,17. Identificirali smo ginkgetin (GGT), kao novi antagonist TRPV4. Primarni i sekundarni probir proveden je s RAW264.7, HDF i BMDM kako bi se procijenila sposobnost Linkedina i drugih kandidata da inhibiraju TRPV4-izazvan Ca2 plus infux14,17. Kao kontrole koristili smo A23187, kalcijev ionofor, TRPV4 nulte BMDM i GSK219, selektivni TRPV4 antagonist17. Nakon sekundarnog pregleda, identificirali smo šest spojeva koji pokazuju više od trostruku inhibiciju TRPV4-posredovanog Ca2 plus priljeva u usporedbi s kontrolom nosača. Linkedin je identificiran kao najjači inhibitor aktivnosti TRPV4. BMDM (5 × 104 stanica/jažici) nasađeni su u kolagenom obložene (10 µg/ml) 96-crne ploče s prozirnim dnom i inkubirane na 37 stupnjeva, 5 posto CO2. Na dan eksperimenta, stanice su napunjene bojom kalcijem 6 u HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecidom i inkubirane 45 minuta na 37 stupnjeva. Nakon inkubacije, knjižnica spojeva je dodana u svaku jažicu do konačne koncentracije od 2 uM. Ploče su inkubirane još 45 minuta na 37 stupnjeva. Ca2 plus influks induciran je dodatkom 10 nM TRPV4 agonista GSK1016790A u stanicama prethodno tretiranim nosačem ili spojem i zabilježen mjerenjem ΔF/F (Max-Min), kao što je prethodno opisano17. Podaci su prikazani kao jedinice relativne fluorescencije (RFU).

Imunoblotovi

Peritonealni makrofagi izazvani tioglikolatom zasađeni su u 10 posto FBS koji sadrži DMEM i inkubirani preko noći. Neprilijepljene stanice su isprane, a na ploču je dodan 1-postotni goveđi serumski albumin (BSA) koji je sadržavao DMEM i inkubirana 3 sata prije tretmana Linkedinom. Da bi se odredila ekspresija CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 i GAPDH proteina, lizati cijelih stanica pripremljeni su iz stanica tretiranih preko noći s Linkedinom (1 i 5 µM) ili nosačem u prisutnosti ili odsutnosti oxLDL (25 µg/ml ). Kako bi se odredile razine ekspresije p-JNK i JNK izazvanih LPS-om, stanice su prethodno tretirane s Linkedinom (5 i 10 µM) tijekom 3 sata, a zatim stimulirane s E. coli LPS tijekom 30 minuta. Lizati cijelih stanica pripremljeni su iz dva puta ispranih stanica (ledeno-hladni PBS) korištenjem RIPA pufera s dodanim koktelom inhibitora proteaze (Thermo Scientific, MA). Mrlje su testirane sa zečjim anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Izrael), anti-mišjim CD36 (R&D, Minneapolis, MN), zečjim anti-TLR4, zečjim anti-TLR6, zečjim anti-JNK i zečjim anti-p- JNK primarna antitijela (Cell Signaling, Danvers, MA) praćena anti-zečjim i anti-mišjim HRP-konjugiranim sekundarnim antitijelima (R&D, Minneapolis, MN). Mrlje su skinute i ponovno ispitane s anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) za kontrolu punjenja.

Stvaranje pjenastih stanica.MRM izazvan tioglikolatom zasijan je na staklenim pokrovnim stakalcima u ploči s 12 jažica s DMEM, 10 posto FBS i inkubiran na 37 stupnjeva, 5 posto CO2 tijekom 2 sata. Stanicama je dodan GGT (1 ili 10 µM), a nakon 3 sata inkubacije, dodan je oxLDL (50 µg/ml), a kulture su inkubirane preko noći na 37 stupnjeva. Nativni LDL (50 ug/ml) dodan je u jažice kontrolne skupine i inkubiran preko noći. Stanice su fiksirane u 4 posto paraformaldehidu nakon čega je uslijedilo bojanje Oil Red O da se kvantificira stvaranje pjenastih stanica.

Transdukcija vektora adenovirusa.Prikupili smo adenovirusne konstrukte za ekspresiju Ad(RGD)-mišjeg TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), i adenovirusni prazni vektor, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), iz Vector Biolabs, Malvern, PA. Koristili smo 1 × 108 pfu/ml za sve eksperimente. Za studije stvaranja pjenastih stanica, mišji peritonealni makrofagi inkubirani su s Ade-TRPV4 ili Ade-Vec u DMEM mediju 72 h prije dodatka oxLDL da se generiraju pjenaste stanice makrofaga.

Vezanje i preuzimanje ox-LDL.Kako bi se procijenilo vezanje, peritonealni makrofagi su tretirani s dvije doze (1 ili 10 µM) Linkedina ili nosača tijekom 3 sata i inkubirani s DiI-oxLDL na 4 stupnja tijekom jednog sata. Nakon prethodnog tretmana s Linkedinom ili nosačem, stanice su inkubirane s DiI-oxLDL na 37 stupnjeva tijekom 30 minuta kako bi se procijenio unos. Slike su snimljene fluorescentnom mikroskopijom (63x), a slika J korištena je za kvantificiranje rezultata.

Analiza protočnom citometrijom.Peritonealni makrofagi izazvani tioglikolatom uzgajani su u DMEM, 10 posto FBS tijekom 24 sata. Neprilijepljene stanice su isprane, dodan je medij bez seruma i stanice su inkubirane 2 h nakon čega je uslijedio dodatak 5 µM GGT ili nosača, a inkubacija je nastavljena 3 h. Obrađene stanice su sastrugane s ploče i resuspendirane u PBS, 2 posto BSA. Stanice su inkubirane s primarnim protutijelima 45 minuta nakon čega je uslijedila 30 minuta inkubacije s PE-konjugiranim sekundarnim protutijelima. FACSCantoII protočni citometar (BD Bioscience, Ontario, Kanada) korišten je za prikupljanje podataka. Svi podaci obrađeni su softverom FlowJo.

qRT‑PCR.Makrofagi inducirani tioglikolatom tretirani su s 5 µM Linkedin-a ili nosačem 3 h; 25 µg/ml oxLDL dodano je nosaču ili stanicama tretiranim Linkedinom, a inkubacija je nastavljena preko noći. RNeasy Micro Kit (#74,004) od QIAGEN-a korišten je za izdvajanje ukupne RNA, a Universal SYBR Green One-Step Kit od Bio-Rada korišten je za obrnutu transkripciju RNA. C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) korišten je za prikupljanje podataka. Ekspresija gena određena je kao količina mRNA specifične za gen u odnosu na mRNA GAPDH pomoću komparativne CT metode opisane u biltenu za korisnike Bio-Rad qRT-PCR sustava.

Statistička analiza.Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM bioloških triplikata. Korišten je softver GraphPad Prism 7.0, a izračuni su provedeni koristeći Studentov t-test za dvije skupine ili jednosmjernu ANOVA za više skupina.

Etičko odobrenje.Svi pokusi na miševima provedeni su u skladu sa smjernicama Institucionalnog odbora za skrb i korištenje životinja (IACUC) i odobreni su od strane Preglednog odbora Sveučilišta Maryland-College Park.

Rezultati in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>trostruko; str<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Slika 1. Identifikacija Linkedina na temelju skrininga visoke propusnosti kao novog inhibitora TRPV4 iz biblioteke prirodnih spojeva. (A) Dijagram toka koji prikazuje tijek rada koji je rezultirao identifikacijom ginkgetina kao potencijalnog inhibitora TRPV4 iz biblioteke od 2000 prirodnih spojeva. (B) Reprezentativna snimka FlexStation 3 koja pokazuje inhibicijski učinak 6 prirodnih spojeva na TRPV4 agonistom (GSK1016790A) induciran Ca2 plus priljev u BMDM s kalcijem 6 bojom tijekom sekundarnog pregleda. Predtretman sa svih 6 spojeva pokazao je inhibitorne učinke na TRPV4-ovisan Ca2 plus priljev u usporedbi sa stanicama prethodno tretiranim nosačem (negativna kontrola; nosač plus GSK1016790A (10 nM)) ili kalcijevim ionoforom (A23187, 2 μM). Koristili smo selektivni antagonist TRPV4, GSK2193874 (10 nM), kao negativnu kontrolu. Svi eksperimenti ponovljeni su tri puta u četiri primjerka. RFU: jedinica relativne fluorescencije.

Inhibicija TRPV4 putem GGT-a ukida stvaranje pjenastih stanica makrofaga izazvano oxLDL-om.Naše prethodne studije pokazale su da je TRPV4-izazvan Ca2 plus influks uključen u stvaranje pjenastih stanica posredovano oxLDL-om 14,16. Stoga smo procijenili mogućnost da je stvaranje pjenastih stanica inhibirano GGT-posredovanom antagonizacijom aktivnosti TRPV4. Peritonealni makrofagi mišjeg divljeg tipa inkubirani su s oxLDL kako bi se induciralo stvaranje pjenastih stanica u prisutnosti ili odsutnosti GGT-a i analizirani bojenjem Oil Red O. Kao što je i očekivano, otkrili smo da se stvaranje pjenastih stanica peterostruko povećalo u makrofagima tretiranim oxLDL-om u usporedbi s prirodnim LDL-om (Slika 2A, B). Međutim, tretman makrofaga s GGT (1 ili 10 µM) prije stimulacije s oxLDL značajno je smanjio postotak pjenastih stanica (Slika 2A, B). Zajedno, ovi nalazi upućuju na inhibicijski učinak GGT-a na stvaranje pjenastih stanica makrofaga koje su moguće usmjerene na TRPV4-izazvan Ca2 plus priljev. Nadalje, prekomjerno smo eksprimirali TRPV4 u nultim makrofagima TRPV4 korištenjem adenovirusnog konstrukta, a zatim inducirali stvaranje pjenastih stanica korištenjem oxLDL u prisutnosti GGT. Otkrili smo da je prekomjerna ekspresija TRPV4 povećala stvaranje pjenastih stanica koje su bile blokirane kada smo stanicu prethodno tretirali GGT-om, što sugerira da inhibicija stvaranja proaterogenih pjenastih stanica pomoću GGT-a ovisi o TRPV4 (Slika 2C, D).

GGT ne blokira bazalnu razinu ekspresije TRPV4 i upalnih receptora.Receptor čistač CD36 igra glavnu ulogu u unosu i vezanju oxLDL i formiranju pjenastih stanica, kritičnim procesima u aterosklerozi4-7,54,55. U posljednje vrijeme sve više dokaza ukazuje na uključenost toll-like receptora u aterosklerozu2,4,56. Kako bismo istražili je li GGT blokirao stvaranje pjenastih stanica utječući na ekspresiju CD36, TLR4, TLR6 i TRPV4, proveli smo imunoblot analizu pri dvije koncentracije GGT (1 ili 5 µM). Pronašli smo slične razine ekspresije CD36, TRPV4, TLR6 i TLR4 u usporedbi s netretiranom kontrolom (Slika 3A-D). Protočna citometrijska analiza također nije otkrila značajnu razliku u ekspresiji proteina na staničnoj površini sa ili bez tretmana GGT (Slika 3E-H, I-L). Uzimajući u obzir sve zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GGT blokira stvaranje pjenastih stanica makrofaga bez inhibicije bazalnih razina površinske ekspresije TRPV4, CD36, TLR4 i TLR6.

Slika 2. Inhibicija TRPV4 od strane Linkedina ukida stvaranje pjenastih stanica makrofaga izazvano oxLDL-om. (A) Tioglikolatom inducirani mišji peritonealni makrofagi tretirani su preko noći s 50 µg/ml oxLDL, nakon čega je uslijedila 3 h predinkubacije s nosačem ili 1 ili 10 µM Linkedin. Stanice su tretirane s 50 µg/mL prirodnog LDL (VLDL) kao kontrole. Izvorno povećanje: 40x. (B) Kvantifikacija rezultata prikazana je u (A). n=500 ćelija/stanje. Studentov t-test; ***str<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Unos oxLDL, ali ga ne vežu makrofagi, potiskuje ga GGT. Budući da se prethodno pokazalo da TRPV4 ima ulogu u unosu oxLDL i stvaranju pjenastih stanica14,16, procijenili smo je li liječenje GGT-om uzrokovalo oštećenje vezanja oxLDL na površini makrofaga. WT peritonealni makrofagi tretirani su s GGT prije inkubacije s DiI-oxLDL na 4 stupnja, te je procijenjeno vezanje. Rezultati pokazuju da vezanje oxLDL na površini makrofaga nije značajno ometano tretmanom GGT (1 ili 10 µM) u usporedbi s kontrolom nosača (Slika 5A-C). Nakon što smo utvrdili da GGT ne inhibira vezanje oxLDL-a, sljedeći cilj nam je bio utvrditi je li unos oxLDL-a u makrofagama oslabljen liječenjem GGT-om. Zanimljivo je da su naši rezultati pokazali da postoji značajna inhibicija u preuzimanju oxLDL u makrofagima u GGT prethodno tretiranim stanicama u usporedbi sa grupom tretiranom nosačem (Slika 6A, B). Uzimajući u obzir sve zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GGT blokira unos oxLDL, ali ne i vezanje, u makrofagima.

GGT blokira oxLDL-induciranu ekspresiju TRPV4 u makrofazima.

Kako su naše prethodno objavljene studije pokazale da Ca2 plus izazvan TRPV4-ima ulogu u formiranju pjenastih stanica makrofaga14,16 posredovanim oxLDL-om, pokušali smo utvrditi blokira li GGT stvaranje pjenastih stanica putem supresije ekspresije CD36 izazvane oxLDL-om, TLR2, TLR4, TLR6 ili TRPV4. Otkrili smo da je noćna stimulacija makrofaga s oxLDL-om rezultirala značajnim povećanjem ekspresije TRPV4 proteina u usporedbi s LDL-om, dok je ekspresija drugih receptora (CD36, TLR2, TLR4 i TLR6) ostala nepromijenjena (Slike 4A-F). Prethodni tretman stanica GGT-om prije stimulacije s oxLDL selektivno je smanjio razinu ekspresije proteina TRPV4 u usporedbi s tretmanom nosačem (Slika 4A-F). Zajedno, ovi nalazi upućuju na inhibicijski učinak GGT-a na ekspresiju proteina TRPV4, koji bi mogao biti dijelom uključen u suzbijanje stvaranja pjenastih stanica putem GGT-a.

Slika 3. Liječenje Linkedinom ne mijenja ukupni protein ili površinsku ekspresiju TRPV4, CD36 i TLR-ova u makrofagima. (A–D) Imunoblotovi lizata cijelih stanica makrofaga nakon tretmana preko noći s 1 ili 5 µM Linkedin-a ili nosačem. Reprezentativni imunoblotovi pokazuju ukupnu ekspresiju proteina CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) i TLR4 (D) u stanicama tretiranim i netretiranim Linkedinom. Provedena su tri neovisna biološka ponavljanja i 3 eksperimentalna ponavljanja za svaki niz eksperimenata. (E–H) Protočna citometrijska analiza makrofaga tretiranih preko noći s 5 µM Linkedinom ili netretiranih pokazujući površinsku ekspresiju TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) i TLR6 (G) u netretiranim stanicama i stanicama tretiranim Linkedinom. Analizirana su tri neovisna biološka ponavljanja i 30000 stanica po stanju. (I–L) Kvantitativna analiza rezultata iz (E–H). Analizirano dvostranim t-testom s 99 postotnim intervalom pouzdanosti. Stanice izbrojane po eksperimentu, 30,000; dva eksperimentalna ponavljanja.

GGT blokira proaterogenu JNK2 aktivaciju i upalu u makrofagima. Objavljena izvješća iz našeg laboratorija i drugih pokazala su da aktivacija JNK2 igra ključnu ulogu u stvaranju pjenastih stanica i aterosklerozi7,57. Kako bi se utvrdilo može li GGT inhibirati aktivaciju JNK1/2, makrofagi su tretirani s GGT-om nakon čega je uslijedila stimulacija s LPS-om ili oxLDL-om. Rezultati imunoblot analize pokazali su da je liječenje GGT-om značajno potisnulo fosforilaciju JNK1/2 izazvanu oxLDL-om ili LPS-om u usporedbi s netretiranom ili nativnom LDL-tretiranom kontrolom (Slika 7A-D). Pokazalo se da aktivacija JNK u makrofagima inducira transkripciju proupalnih medijatora povezanih s aterosklerozom58-60. Kako bi se utvrdilo može li GGT potencijalno blokirati ekspresiju ovih proupalnih regulatora u makrofazima, stanice prethodno tretirane GGT-om stimulirane su s oxLDL, a razine ekspresije mRNA TNF, IL 6, IL12, IL1 i MCP1 kvantificirane su qRT-PCR analizom. Otkrili smo značajnu nižu regulaciju u razinama ekspresije mRNA TNF, IL12, IL1 i MCP1 izazvanih oxLDL-om u stanicama tretiranim GGT-om u usporedbi s kontrolama tretiranim nosačem (Slika 7E–I). Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GGT blokira proaterogenu aktivaciju JNK2 i ekspresiju gena upale kao odgovor na stimulaciju oxLDL u makrofagima. Rasprava Poznato je da prirodni spojevi kao što su flavonoidi i polifenoli moduliraju kardiovaskularne odgovore putem različitih mehanizama, kao što su inhibicija proupalnih signala, inzulinska senzibilizacija, oksidativni status i poboljšanje profila lipida u krvi40-45. Ovdje izvješćujemo o identifikaciji i funkcionalnoj karakterizaciji Linkedina, flavona, baziranog na probiru visoke propusnosti, kao novog inhibitora TRPV4-ovisnih proterogenih/upalnih procesa u makrofagima. Posebno smo pokazali da i) ginkgetin blokira TRPV4-posredovan Ca2 plus priljev u makrofage, ii) ginkgetin blokada funkcije TRPV4 značajno smanjuje stvaranje pjenastih stanica izazvano oxLDL-om potiskivanjem unosa oxLDL-a u makrofage, i iii) ginkgetin blokira LPS- i oxLDL-inducirana fosforilacija JNK1/2, ekspresija TRPV4 proteina i ekspresija gena upale. Sve u svemu, rezultati naše studije pokazali su da ginkgetin inhibira proaterogenu/upalnu funkciju makrofaga na način ovisan o TRPV4-. Ateroskleroza, bolest aorte, u početku je potaknuta upalom i nagomilavanjem makrofaga s oxLDL, potičući stvaranje pjenastih stanica makrofaga, koje kasnije napreduju u obliku ateroma2-10. Budući da je stvaranje pjenastih stanica kritičan proces u aterogenezi, razumijevanje i manipuliranje stvaranjem pjenastih stanica može imati terapeutski potencijal. Poznato je da makrofagi izražavaju niz ionskih kanala i pumpi koji prodiru kroz membranu, uključujući TRPV4, mehanosenzitivni polimodalni Ca2 plus propusni ionski kanal, koji se aktivira fizičkim i biokemijskim podražajima11-24. Objavljene studije našeg laboratorija i drugih utvrdile su ulogu TRPV4 u upali makrofaga i stvaranju pjenastih stanica izazvanom oxLDL-om14-16,26. TRPV4 stoga može poslužiti kao održiva meta za slabljenje proaterogenih procesa.

Slika 5. Linkedin ne potiskuje vezanje DiI-oxLDL na makrofage. Makrofagi su prethodno tretirani nosačem ili Linkedinom (1 ili 10 µM) tijekom 3 sata nakon čega je uslijedila inkubacija s DiI-obilježenim oxLDL (2,5 µg/mL) tijekom 1 sata na 4 stupnja. (A) Reprezentativne fluorescentne mikroskopske slike (izvorno povećanje, 63×) DiI-oxLDL vezanja na površini membrane makrofaga (n=20 stanica/stanje). (B) Rezultati eksperimenta A prikazani kao profil dijagrama pomoću NIH ImageJ softvera. (C) Kvantitativna analiza rezultata iz A. n=20 stanica/stanje. u poboljšanju ateroskleroze smanjenjem MMP-2 i MMP-9 i povećanjem razina NO i NOS u torakalnoj aorti štakora52. U ovoj studiji pokazali smo da ginkgetin blokira TRPV4-izazvan Ca2 plus priljev u makrofage. Mehanički, pokazali smo da ginkgetin blokira unos oxLDL, ali ne i vezanje, u makrofagima. Studije provedene in vivo i in vitro ukazale su na kritičnu ulogu CD36 kao glavnog receptora čistača u unosu oxLDL i formiranju pjenastih stanica makrofaga2-7. Pokazalo se da su CD36 nulti miševi koji nemaju ApoE ili LDLR manje skloni razvoju aterosklerotskih lezija5,6. Prethodne studije naše skupine identificirale su ključnu ulogu CD36-JNK signalne kaskade u formiranju pjenastih stanica makrofaga7. Receptori slični Tollu TLR2, TLR4 i TLR6 djeluju kao koreceptori u interakciji s CD36 i pokazalo se da su uključeni u aterogenezu2,56,63. Ispitali smo mogućnost da je nedostatak stvaranja pjenastih stanica viđen u makrofagima tretiranim Linkedinom uzrokovan smanjenom ekspresijom proteina CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 ili TLR6. Zanimljivo je da liječenje Linkedinom nije značajno smanjilo ekspresiju CD36, TLR2, TLR4 ili TLR6 proteina na bazalnim razinama ili u uvjetima stimuliranim oxLDL. Međutim, Linkedin je specifično blokirao oxLDL-induciranu regulaciju ekspresije TRPV4 proteina, dok je njegova ekspresija na bazalnim razinama ostala nepromijenjena. Uzimajući u obzir sve zajedno, ovi rezultati sugeriraju da ginkgetin blokira stvaranje pjenastih stanica izazvano oxLDL putem mehanizma neovisnog o ekspresiji CD36 i TLR, ali ovisnog o TRPV4. Prethodne studije naše i drugih skupina pokazale su da je aktivacija JNK2 uključena u stvaranje pjenastih stanica i razvoj aterosklerotskih lezija7,57. Također je objavljeno da je JNK uključena u modulaciju MMP-9 i MMP-13, koji su prekomjerno izraženi u aterosklerotskim lezijama64-68. S obzirom na prepoznatu vezu JNK u aterogenim procesima, htjeli smo utvrditi može li ginkgetin inhibirati aktivaciju JNK. U skladu s prethodnim izvješćima, naši su rezultati također pokazali da ginkgetin blokira fosforilaciju JNK2 u makrofagima izazvanu upalnim podražajem. Ovaj rezultat sugerira mogući mehanizam kojim Linkedin blokira stvaranje pjenastih stanica. Nadalje, pronašli smo značajno smanjenje ekspresije TNF, IL12, IL1 i MCP1 mRNA izazvane oxLDL-om u stanicama tretiranim ginkgetinom u usporedbi s kontrolom nosača, naglašavajući potencijalne protuupalne uloge ginkgetina kao odgovor na oxLDL. Ukratko, naši su rezultati pokazali da ginkgetin inhibira proaterogenu i upalnu funkciju makrofaga na način ovisan o TRPV4-. Ova otkrića stoga jačaju razloge za korištenje prirodnih spojeva u razvoju potencijalnih terapeutskih i/ili kemopreventivnih reagensa.

Reference
1. Barquera, S. i sur. Globalni pregled epidemiologije aterosklerotske kardiovaskularne bolesti. Arh. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Stanična biologija makrofaga u aterosklerozi. Cell 145, 341-355 (2011).
3. Libby, P. Upala kod ateroskleroze. Nature 407, 233-241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Citokini, metabolizam lipida makrofaga i pjenaste stanice: implikacije za terapiju kardiovaskularnih bolesti. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. i sur. Ciljani poremećaj klase B čistača receptora CD36 štiti od razvoja aterosklerotskih lezija u miševa. J. Clin. Ulagati. 105, 1049-1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV i sur. Receptori čistača klase AI/II i CD36 glavni su receptori odgovorni za unos modificiranog lipoproteina niske gustoće što dovodi do opterećenja lipidima u makrofagima. J. Biol. Chem. 277, 49982-49988 (2002).
7. Rahaman, SO i sur. CD36-ovisna signalna kaskada neophodna je za stvaranje pjenastih stanica makrofaga. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Ateroskleroza-upalna bolest. N Engl J Med. 340(2), 115-126 (1999).
9. Libby P. Molekularni mehanizmi trombotičkih komplikacija ateroskleroze. J. Intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Ateroskleroza. Nature 407, 233-241 (2000).
11. Matthews, BD i sur. Ultrabrza aktivacija ionskih kanala TRPV4 mehaničkim silama primijenjenim na beta1 integrine na staničnoj površini. Cijeli broj. Biol. (Camb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ mehanotransdukcijska signalna os u krutosti matriksa i TGF-om 1-induciranom epitelno-mezenhimskom prijelazu. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Vaniloid 4 s prolaznim receptorskim potencijalom potreban je za reakciju stranog tijela i stvaranje divovskih stanica. Am. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. i sur. TRPV4 kanal propusni za kalcij novi je regulator oksidiranog LDL-induciranog stvaranja pjenastih stanica makrofaga. Slobodan Radić. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).