Ekspresija ljudskog alfa defenzina 5 u ljudskom bubregu i urinarnom traktu

Za više informacija: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer i sur

Sažetak

Pozadina:Mehanizmi koji održavaju sterilnost u urinarnom traktu nisu u potpunosti shvaćeni. Nedavne studije ukazale su na važnost antimikrobnih peptida (AMP) u zaštiti urinarnog trakta od infekcija. Ovdje karakteriziramo ekspresiju i relevantnost AMP humanog alfa-defenzina 5 (HD5) u ljudskombubregi urinarnog trakta u normalnih i zaraženih osoba.

Metodologija/Glavni nalazi:Korištenje RNA izolirane iz čovjekabubreg, mokraćovoda i tkiva mokraćnog mjehura, izveli smo kvantitativni PCR u stvarnom vremenu kako bismo pokazali da se DEFA5, gen koji kodira HD5, konstitutivno eksprimira u cijelom urinarnom traktu. Uz pijelonefritis, ekspresija DEFA5 značajno se povećala ububreg. Korištenjem imunoblot analize, proizvodnja HD5 također se povećala s pijelonefritisom. Imunološko bojenje lokaliziralo je HD5 na urotel mokraćnog mjehura i uretera. U bubregu se HD5 primarno proizvodi u distalnom nefronu i sabirnim tubulima. Korištenjem imunoblota i ELISA testova, HD5 nije rutinski detektiran u uzorcima neinficiranog ljudskog urina, što znači da je proizvodnja HD5 u urinu povećana s infekcijom urinarnog trakta E.coli.

Zaključci/Značaj:DEFA5 se eksprimira u cijelom urinarnom traktu u neinficiranih subjekata. Konkretno, HD5 se eksprimira u čitavom urotelu donjeg urinarnog trakta i u sabirnim tubulimabubreg. Uz infekciju, ekspresija HD5 se povećava ububreg, a razine se mogu otkriti u urinu. Koliko znamo, naša otkrića predstavljaju prvo kvantificiranje ekspresije i proizvodnje HD5 u ljudskom bubregu. Štoviše, ovo je prvo izvješće koje otkriva prisutnost HD5 u zaraženim uzorcima urina. Naši rezultati pokazuju da HD5 može imati važnu ulogu u održavanju sterilnosti urinarnog trakta.

Cistanche nuspojave i Cistanche tubulosa zabubregbolest, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

Uvod

Urinarni trakt, osim meatusa uretre, obično je sterilan unatoč blizini fekalne flore. Precizni mehanizmi pomoću kojih urinarni trakt održava svoju sterilnost nisu dobro poznati. Predloženi mehanizmi koji pridonose obrani urinarnog trakta uključuju protok urina, promjene u pH i osmolarnosti urina, redovito pražnjenje mokraćnog mjehura, kemijske obrambene komponente uroepitela i epitelno odbacivanje/influks efektorskih imunoloških stanica uz bakterijsku stimulaciju [1]. Osim toga, nedavno se pokazalo da antimikrobni peptidi (AMP) imaju važnu ulogu u održavanju sterilnosti urinarnog trakta [2]. AMP, koji služe kao prirodni antibiotici koje proizvode gotovo svi organizmi, sveprisutna su komponenta urođenog imunološkog sustava. AMP su kationske molekule koje eksprimiraju fagocitne bijele stanice i epitelne stanice. Kod ljudi i drugih sisavaca defenzini su glavna obitelj AMP-a. Defenzini obično imaju antimikrobno djelovanje širokog spektra protiv gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija, virusa, gljivica i protozoa [2,3]. Defenzini se inicijalno sintetiziraju kao preproproteini i podvrgavaju se procesuiranju kako bi postali zreli, biološki aktivni peptidi [4]. Kod ljudi se defenzini klasificiraju u jednu od dvije obitelji ovisno o njihovom uzorku disulfidnih mostova – alfa-defenzini ili beta-defenzini [5].

U urinarnom traktu, beta-defenzini su široko izraženi u uroepitelu. Epitelne stanice koje oblažububregHenleova petlja, distalni tubul i sabirni kanal konstitutivno eksprimiraju ljudski beta-defenzin 1 (hBD1). Iako su razine hBD1 u urinu nedovoljne da ubiju bakterije koje napadaju, hBD1 osigurava brzodjelujući antimikrobni omotač tubularnih lumena i sprječava infekciju inhibicijom vezanja bakterija na urotel [6]. Nedavne studije pokazuju da redoks-stanje hBD1 značajno utječe na antimikrobnu moć, tako da je reducirani peptid mnogo snažniji od disulfidno vezanog oksidiranog oblika [7]. Značaj ovoga na površini urotela nije utvrđen. Drugi defensin, humani beta-defensin 2 (hBD2) nije konstitutivno izražen u zdravom tkivu bubrega; međutim, ekspresija hBD2 je inducirana infekcijom [8].

Za razliku od beta-defenzina, uloga alfa-defenzina izvedenih iz epitela nije dobro opisana u urinarnom traktu. Ekspresija i funkcija alfa-defenzina HD5 i HD6 uglavnom su prijavljeni u tankom crijevu gdje ih izlučuju Paneth stanice u crijevne kripte i pridonose ravnoteži crijevne mikrobiote [9]. HD5 je također lokaliziran u muškom i ženskom genitalnom traktu, s dokazima koji sugeriraju da je inducibilan i važan u iskorjenjivanju infekcije [10,11,12]. HD5 u urinu otkriven je kod pacijenata koji su bili podvrgnuti rekonstrukciji neobukraljenog mjehura ileuma i preusmjeravanju urinarnog kanala ileuma pri čemu je izvor proizvodnje HD5 primarno pripisan Panethovim stanicama ileuma [13,14]. HD5 ima antibakterijsko djelovanje protiv uobičajenih uropatogenih gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija [15]. HD5 također ima antimikrobno djelovanje protiv uropatogenih virusa poput adenovirusa i BK virusa [16,17,18]. U ovoj studiji dajemo početni opis i kvantifikaciju ekspresije HD5 kod ljudibubregte dalje definiraju njegovu ekspresiju u donjem urinarnom traktu tijekom steriliteta i infekcije.

Rezultati

DEFA5 mRNA se konstitutivno eksprimira u ljudskom mjehuru, ureteru i bubregu

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu pokazuje da su svi testirani mjehur, ureter ibubreguzorci bez infekcije konstitutivno izraženi DEFA5. Ekspresija DEFA5 bila je značajno veća u donjem urinarnom traktu nego u gornjem urinarnom traktu (p= 0.014). U mjehuru (n=4), srednja ekspresija DEFA5 bila je 4,656637 transkripata po 10 ng RNA, a u ureteru (n=4) srednja ekspresija DEFA5 bila je 4,1126170 transkripata po 10 ngRNA (Slika 1A) . U bubregu (n=6), srednja ekspresija DEFA5 bila je 2,9376274 transkripta po 10 ng RNA. Ekspresija DEFA5 analizirana je zasebno u korteksu bubrega, meduli i zdjelici. Ekspresija DEFA5 nije značajno varirala po regiji bubrega (p= 0.45).

Ekspresija DEFA5 i ekspresija HD5 peptida povećavaju se s pijelonefritisom

Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenu provedena natkiva bubrega sapijelonefritis je pokazao značajno povećanje ekspresije DEFA5 u usporedbi s neinficiranim tkivom bubrega. S pijelonefritisom (n= 6), prosječna ekspresija DEFA5 porasla je na 782961052 transkripata po 10 ng RNA (p= 0.019) (Slika 2A).

Kako bismo dodatno procijenili ovo povećanje ekspresije kod pijelonfritisa, izvršili smo imunoblot analizu na istombubregtkivo korišteno za PCR analizu u stvarnom vremenu za procjenu istodobnog povećanja proizvodnje HD5 peptida (Slika 2B, srednja ploča). Imunoblot analiza, korištenjem poliklonskih HD5 antiseruma, pokazala je značajno veću proizvodnju HD5 peptida u bubrežnom tkivu s pijelonefritisom (n {{5} }) u usporedbi s nezaraženimabubregtkiva(n=6). Neinficiranbubregtkiva su izrazila 300625 ng HD5/gram težine vlažnog tkiva dokbubregtkivo s pijelonefritisom izraženo 600621 ng HD5/gram težine vlažnog tkiva (p,0,0001). Mrlje su ponovno ispitane s GAPDH da služe kao kontrola punjenja (Slika 2B, srednja ploča), a također je izvedeno bojenje srebrom da se potvrdi jednako opterećenje proteinima (Slika 2B, gornja ploča).

HD5 peptid se proizvodi u ljudskim bubrezima i urinarnom traktu

Provedeno je imunološko bojenje kako bi se lokalizirala proizvodnja HD5 u urinarnom traktu. Imunohistokemija (IHC) je pokazala da je HD5 imunoreaktivnost bila prisutna u cijelom urotelu uretera i mokraćnog mjehura svih ispitanih uzoraka (n=4, slika 3). IHC je također pokazala da je HD5 proizveden u tubulima bubrežnog korteksa i medule svih primjerci (n= 6, slika 4). Imunofluorescencija (IF) je pokazala da je ekspresija HD5 najveća u distalnom nefronu i sabirnim tubulima (Slika 5). Intersticij i glomeruli nisu pokazali HD5 imunoreaktivnost. Imunobojenje prikazano na slikama 3, 4 i 5 provedeno je pomoću mišjeg monoklonskog anti-HD5 protutijela (8C8) koje prepoznaje HD5 propeptid (Abcam, Cambridge, MA). Rezultati su bili slični kada se koristilo zečje poliklonsko anti-HD5 protutijelo koje prepoznaje HD5 propeptid i zreli peptid (podaci nisu prikazani) – što sugerira da je HD5 pohranjen kao propeptid.

S pijelonefritisom, imunološko bojenje HD5 značajno se povećalo. Imunoreaktivnost HD5 povećala se kroz proksimalni nefron, distalni nefron i sabirne tubule (Slika 4 i Slika 5). Kao i kod neinficiranih uzoraka, glomeruli i intersticij nisu pokazali ekspresiju HD5 s infekcijom. Negativne kontrole nisu pokazale HD5 imunoreaktivnost.

Zaraženi ljudski urin sadrži mjerljive koncentracije peptida HD5

Imunoblot analiza, korištenjem zečjeg poliklonalnog antiseruma koji detektira prekursor proHD5 i dalje obrađene oblike, identificirala je mjerljive razine HD5 u 13 od 15 testiranih uzoraka urina zaraženih uropatogenom E.coli (Slika 6A i B). Kada su prisutne, razine HD5, normalizirane na kreatinin u mokraći, kretale su se od 299,8–669,7630 ng HD5/mg Cr urina (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), što odgovara 11,10–27,67 nmol/L. Neinficirani uzorci urina (n=15), HD5 je bio na ili ispod granice detekcije (,50 ng). Imunoenzimski test (ELISA) na istim uzorcima urina, koristeći mišje monoklonsko protutijelo (8C8) koje detektira samo prekursor proHD5, otkrio je mjerljive razine proHD5 u 13 od 15 testiranih zaraženih uzoraka. Koncentracije proHD5 u urinu kretale su se od 122,78–490,060,03 ng HD5/mg Cr urina (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) kada je bio prisutan (Slika 7).

Rasprava

U ovoj studiji pružamo početnu karakterizaciju HD5 kod ljudibubreg, uretera i mjehura. Pokazalo se da je HD5 važan AMP koji sprječava invazivnu infekciju u crijevima i pojačan je u genitalnom traktu tijekom infekcije [11,18,19,20,21]. AMP-ovi dobiveni iz epitela, poput HD5, pokazali su se važnima u održavanju sterilnosti u urinarnom traktu [8,22,23,24]. Nedostaci ove urođene obrane sluznice mogu rezultirati akutnom i/ili kroničnom infekcijom [25,26].

Naši kvantitativni rezultati PCR-a u stvarnom vremenu pokazuju da je DEFA5 konstitutivno izražen u ljudskombubrega, mokraćovoda i mjehura. Ekspresija DEFA5 povećava se od gornjeg urinarnog trakta prema donjem urinarnom traktu – prateći tok urinarnog toka i sve veću blizinu točke invazije mikrobiote. Koliko znamo, ovo je prva studija koja je kvantificirala ekspresiju DEFA5 u ljudskom bubregu i mjehuru. Nedavno su Townes i suradnici pokazali da normalni distalni ureter može eksprimirati DEFA5 [14]. Naši rezultati također sugeriraju da se DEFA5 konstitutivno izražava u distalnom ureteru. Iako je ekspresija DEFA5 u urinarnom traktu gotovo 100-puta niža od one pronađene u gastrointestinalnom tkivu, bazalna uroepitelna ekspresija DEFA5 usporediva je s ekspresijom prethodno opisanih pojačala urinarnog traka kao što su katelicidin, hBD-1, hBD -2, i ribonukleaza 7[6,8,22,24,27].

Za razliku od zrelog gastrointestinalnog trakta gdje se DEFA5 eksprimira na visokim razinama u oba stanja zdravlja i infekcije/upale, naši kvantitativni PCR podaci u stvarnom vremenu pokazuju da ekspresija DEFA5 ububregznačajno se pojačava s infekcijom [27,28,29]. Ovaj inducibilni obrazac ekspresije analogan je ekspresiji DEFA5 u ženskom reproduktivnom traktu gdje se ekspresija DEFA5 povećava sa salpingitisom [30]. U urinarnom traktu, Townes i suradnici su pokazali trend prema većoj ureteralnoj ekspresiji DEFA5 u bolesnika s IMS-om koji su bili podvrgnuti urinarnoj diverziji ilealnog kanala [14]

Naša imunoblot analiza nadopunjuje PCR podatke u stvarnom vremenu pokazujući da se proizvodnja HD5 peptida povećava s pijelonefritisom. Ovaj inducibilni obrazac proizvodnje HD5 sličan je onom viđenom kod nekih članova obitelji beta-defenzina. hBD2 pokazuje inducibilni obrazac proizvodnje s infekcijom urinarnog trakta i/ili kroničnim pijelonefritisom [8,31,32]. Pokazalo se da se proizvodnja HD5peptida povećava u gornjem dijelu ženskog genitalnog trakta i muške uretre s upalom [11,30].

Koristeći imunološko bojenje, demonstrirali smo da se HD5 ravnomjerno proizvodi kroz urotel uretera i mokraćnog mjehura. Budući da je velika većina infekcija mokraćnog sustava posljedica fekalne flore koja se penje u mjehur, ovi rezultati sugeriraju da je ekspresija HD5 prisutna na mjestima gdje je izloženost mikrobima najčešća [33]. Stoga je HD5 idealno postavljen za sprječavanje uzlazne mikrobne infekcije. ububreg, HD5 se prvenstveno proizvodi u distalnom nefronu i sabirnom tubulu. Ova otkrića sugeriraju da se HD5 proizvodi na mjestima gdje će biti postavljen kako bi imao optimalnu antimikrobnu aktivnost. Prethodne studije su pokazale da antimikrobna svojstva defenzina ovise o koncentraciji soli – pri čemu veće koncentracije soli smanjuju antimikrobnu aktivnost [23,34,35]. Nagađamo da niske koncentracije soli u distalnom nefronu i sabirnim tubulima pružaju povoljno okruženje za antimikrobno djelovanje HD5.

Imunoblot i ELISA analiza također pokazuju da se HD5 izlučuje u urinu u niskim razinama. S obzirom na veličinu (8,1 kDa i 3,7 kDa) i pozitivan naboj proHD5 i potpuno obrađenog HD5, moguće je da neki urinarni HD5 peptid potječe, barem djelomično, iz filtrata plazme. Ipak, malo je dokaza koji sugeriraju da HD5 postoji u plazmi [27]. Dodatno, da bi se pojavio u urinu, HD5 bi trebao izbjeći učinkovite mehanizme apsorpcije peptida u proksimalnom tubulu [6,36]. Konačno, korišteni uzorci urina prošli su centrifugiranje prije izvođenja testova, čime su uklonjeni stanični izvori HD5.

U otkrivenim koncentracijama, HD5 u urinu vjerojatno neće biti izravno antimikroban protiv uropatogenih mikroorganizama budući da potpuno prerađeni HD5 ima minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIC) između 6-10 mg/mL protiv uobičajenih gram-negativnih uropatogenih bakterija [15]. Međutim, koncentracije na površini sluznice vjerojatno će biti veće. Nadalje, imunoblot analiza pokazuje da su koncentracije HD5 značajno veće ububreg. Ovi rezultati sugeriraju da je HD5 uključen u obranu sluznice urinarnog trakta. Analogni uzorak se vidi s hBD1, gdje koncentracije hBD1 u urinu nisu dovoljne da pokažu antimikrobno djelovanje, ali se veće koncentracije peptida otkrivaju u blizini bubrežnih tubula [6,31].

Budući da IHC pokazuje da je proHD5 glavni oblik HD5 ububrega budući da se i zreli i proHD5 detektiraju u urinu, nagađamo da se HD5 primarno izlučuje kao prekursorska molekula, a zatim prolazi proteolitičku obradu kako bi se stvorili zreli oblici – slično gastrointestinalnom i genitourinarnom traktu [11,30,37]. U tankom crijevu, Panethove stanice proizvode tripsin, koji cijepa propeptid HD5 tako da je potpuno obrađeni peptid dominantan oblik u lumenu crijeva [37]. U muškoj uretri, ključni enzimi za obradu i aktivaciju HD5 su neutrofilne proteaze kojima doprinose neutrofili regrutirani na mjesto infekcije [11]. Doprinosi epitelnog tripsinogena, urinarnog tripsina i/ili neutrofilnih proteaza procesuiranju HD5 u urinarnom traktu tijekom infekcije tek treba utvrditi. Štoviše, učinci promjena u urinarnom okruženju na funkciju HD5 (promjene u osmolarnosti, pH i kationskim koncentracijama) također se trebaju utvrditi.

Zaključno, ovo je prva studija koja je identificirala i kvantificirala ekspresiju i proizvodnju HD5 u urinarnom traktu. Naši rezultati sugeriraju da je HD5 AMP epitelnog porijekla koji može igrati važnu ulogu u urođenom imunitetu ljudskog uroepitelija sprječavajući translokaciju invazivnih patogena u cirkulaciju. Razjašnjenje čimbenika koji reguliraju proizvodnju HD5 može pružiti novi uvid u patogenezu IMS kod pacijenata kod kojih postoji rizik od IMS i pacijenata s kroničnim infekcijama.

metode

Odobrenje studije

Informirani pismeni pristanak dobiven je od svih pacijenata koji su sudjelovali u ovoj studiji. Za ispitanike mlađe od 18 godina dobiven je pismeni pristanak roditelja/skrbnika. Odbor za institucionalni pregled NationwideChildren's Hospital (NCH) odobrio je ovu studiju zajedno s postupkom pristanka i dokumentima (IRB07-00383).

Uzorci ljudskog tkiva i urina

Neinficirano distalno tkivo uretera i mokraćnog mjehura (n= 4) dobiveno je od djece koja su podvrgnuta ponovnoj implantaciji uretera iz razloga koji nisu ponovljena infekcija. Neinficiranbubreguzorci (n=6) dobiveni su od pacijenata koji su podvrgnuti nefrektomiji zbog tumora bubrega. Uzorci tkiva bili su bez makroskopskih znakova bolesti ili upale.Bubregtkiva pacijenata s kroničnim pijelonefritisom osigurala je Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Dva neovisna patologa potvrdila su histopatološku dijagnozu pijelonefritisa. Uzorci tkiva su brzo zamrznuti ili sačuvani kao neutralni formalinom fiksirani parafinski isječci. Dijelovi neinficiranog bubrežnog tkiva secirani su u korteks, medulu ili bubrežnu zdjelicu prije skladištenja (n=4).

Uzorci neinficiranih i inficiranih urina uzeti su od djece koja su se javila u hitnu službu NCH-a ili na nefrološku kliniku. Dijagnoza IMS postavljena je pozitivnom urinokulturom prema smjernicama Američke akademije za pedijatriju [39]. Svi uzorci zaraženog urina imali su 0,106 CFU/mL E.coli. pH vrijednosti urina kretale su se od 5,5 do 8,5 (srednja vrijednost urina 6,9). Ionski sastav urina nije mjeren. Uzorci urina su centrifugirani kako bi se uklonio sediment urina i dodan je koktel inhibitora proteaze (Thermo Scientific, Rockford, IL, SAD).

Izolacija ribonukleinske kiseline i reverzna transkripcija

Ukupna RNA izolirana je iz smrznutog tkiva korištenjem PromegaTotal RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA). Za sintezu DNA, 4-8 mg ukupne RNA je obrnuto transkribirano reverznom transkriptazom Superscript III korištenjem oligo-(dT)12-18 primera prema protokolu dobavljača (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD).

Kloniranje genski specifičnih plazmida za standardne krivulje

cDNA koja kodira DEFA5 i GAPDH klonirana je u 4-Topo plazmidni vektor (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Plazmidi su sekvencionirani kako bi se potvrdilo da su točni

dobiveni su konstrukti. Serijska razrjeđenja genski specifičnih plazmida su kvantificirana (spektrofotometrijskom apsorbancijom na 260 i elektroforezom u agaroznom gelu obojenom etidijevim bromidom) i korištena u PCR-u u stvarnom vremenu za generiranje standardnih krivulja za svaku reakciju.

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu proveden je korištenjem jednolančane cDNA iz čovjekabubreg, mokraćovoda i tkiva mokraćnog mjehura sa specifičnim parovima oligonukleotidnih početnica korištenjem 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SAD). Dizajnirani su PCR primeri za spajanje eksona i sekvencije su potvrđene pomoću DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 forward primer : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 i DEFA5 reverzni primer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

Ukratko, cDNA koja odgovara 10 ng RNA poslužila je kao uzorak u reakciji od 25 ml koja je sadržavala 2.0 mM svake početnice i 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green mješavine. Uvjeti PCR-a bili su: početna denaturacija na 95 °C tijekom 10 minuta, nakon čega slijedi 40 ciklusa od kojih se svaki ciklus sastoji od denaturacije na 94 °C tijekom 30 sekundi, žarenja na 64 °C tijekom 30 sekundi i produžetka na 72 °C tijekom 30 sekundi. Emisija fluorescencije od ciklusa do ciklusa praćena je na 530 nm i analizirana korištenjem 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Standardi plazmida specifični za gen uključeni su u svaki skup reakcija. Kao pozitivna kontrola, RNA terminalnog ileuma uključena je u svaki skup reakcija, a rezultati su uspoređeni s prethodno objavljenim standardima [27].

Kako bi se potvrdila PCR amplifikacija željenog produkta, reprezentativni uzorak je analiziran elektroforezom na 1,5 postotnom agaroznom gelu. Produkti su vizualizirani bojenjem etidijevim bromidom i uspoređeni sa standardima veličine DNK da se potvrdi očekivana veličina proizvoda (nije prikazano). Dodatno, krivulja profila temperature taljenja za svaku PCR reakciju određena je na kraju svake reakcije.

HD5 antitijela

HD5 propeptid (AA20-94) i djelomično obrađeni oblici (AA36-94 i 56-94) identificirani su pomoću komercijalno dostupnog mišjeg monoklonskog (8C8) anti-HD5 protutijela (Abcam). HD5 propeptid i zreli peptid (AA63-94) identificiran je korištenjem prethodno opisanog zečjeg poliklonalnog antiseruma[13,40].

Imunoblot

Odjeljci istogbubreguzorci korišteni za kvantitativnu PCR analizu u stvarnom vremenu (3-6 mg mokre težine) usitnjeni su u prah pomoću tarionika i tučka u tekućem dušiku i otopljeni u RIPA puferu s inhibitorima proteaze. Urinarni proteini ekstrahirani su iz uzoraka urina pomoću ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Kanada). Koncentracije proteina u bubrezima i urinu kvantificirane su korištenjem modificiranog Bradfordovog testa i potvrđene korištenjem očitanja anOD280 nm. Jednake koncentracije bubrežnog tkiva ili urinarnog proteina nanesene su na 18 postotne gradijentne gelove natrijevog dodecil sulfata i podvrgnute elektroforezi. Kako bi se osiguralo jednako opterećenje proteinima, izvršeno je bojenje srebrom.

Nakon elektroforetskog odvajanja, proteini su prebačeni na nitroceluloznu membranu. Nakon fiksacije s 0.05 posto glutaraldehida u TBS-u, membrane su blokirane u 5 postotnom mlijeku bez masti tijekom 30 do 60 minuta i inkubirane u 1:1,000 razrjeđenju zečjeg poliklonalnog HD5 antiseruma preko noći . Nakon ispiranja, sekundarno protutijelo, anti-zečji IgG konjugiran s peroksidazom hrena razrijeđen 1:10, 000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD), primijenjeno je 1 sat na sobnoj temperaturi. Imunoblotovi izbubregtkiva su također ispitana s anti-GAPDH antitijelima (Sigma Aldrich) dva sata na sobnoj temperaturi i zatim inkubirana sa sekundarnim antitijelima opisanim gore. Proteini su vizualizirani korištenjem ECL detekcijskog sustava i kemiluminiscentnog filma prema uputama proizvođača (BioExpress, Kaysville, UT, SAD).

HD5 je kvantificiran usporedbom rezultirajućih intenziteta trake sa serijskim razrjeđenjem rekombinantnog standardnog proHD5 proteina (Peptides International, Louisville, KY, SAD).BubregKoncentracije HD5 su standardizirane na težinu mokrog tkiva. UrinaryHD 5 koncentracije su podijeljene s kreatininom u urinu kako bi se uspostavili standardizirani omjeri HD5-urina i kreatinina (mg/mg) kako bi se uzela u obzir razrjeđenost urina. Koncentracije kreatinina u urinu određene su korištenjem testa kreatinina na mikroploči Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, SAD).

Imunohistokemija

Nakon deparafinizacije, rehidracije i pronalaženja antigena, provedeni su blok biotina i proteinski blok bez seruma (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, SAD). Stakalca su inkubirana preko noći na 4°C s monoklonskim mišjim HD5(8C8) antitijelom (1:2{{10}}0; Abcam) ili zečjim poliklonalnim antiserumom (1:500) nakon čega je slijedila falsificirana anti-polivalentna biotinilirana antitijela Streptavidin/HRP (ScyTek Laboratories). Sekcije su razvijene upotrebom 0,1 posto diaminobenzidin tetraklorida s 0,02 posto vodikovog peroksida i obojene hematoksilinom. Sekcije negativne kontrole su inkubirane s neimunim serumom umjesto HD5 antitijela.

Imunofluorescencija

Dvostruko obilježena imunofluorescencija je provedena kako bi se pomoglo lokalizirati ekspresiju HD5 ububreg. Sabirni kanal je dvostruko obilježen za glavne stanice s kozjim poliklonalnim anti-humanim akvaporin-2 protutijelom (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD) [41]. Henleova petlja dvostruko je obilježena mišjim poliklonskim anti-humanim uromodulinskim protutijelom (Sigma-Aldrich), a proksimalni tubul dvostruko je obilježen kozjim poliklonalantihumanim akvaporinom-1 (Santa Cruz) [41,42]. Rodamin magareće poliklonsko anti-kozje (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SAD), rodamin kozje anti-mišje (JacksonImmunoResearch Laboratories) i FITC magareće poliklonsko anti-zečje (Santa Cruz) poslužila su kao sekundarna antitijela.

Svi dijelovi su pripremljeni kako je gore navedeno. Inkubirani su sa mješavinom mišjih antiseruma protiv HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulina (1:500), AQP-1 (1:400) u sobi temperaturi 90 minuta. Sekundarno antitijelo primijenjeno je 90 minuta na sobnoj temperaturi, a sekcije su montirane pomoću medija za montiranje s DAPI. Kao negativna kontrola korišten je neimuni serum. Stakalca su ispitana mikroskopom Leica DM4000B i digitalno fotografirana pomoću kamere/softvera Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, SAD).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) mišje monoklonsko antitijelo 2 sata na sobnoj temperaturi, streptavidin-peroksidaza hrena (Biolegend, San Diego CA, SAD) dodana je 30 minuta. Nakon inkubacije s otopinom supstrata TMB tijekom 15 minuta (Kem-En-Tec Diagnostics), reakcija je prekinuta otopinom STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD) i očitana na valnoj duljini od 450 nm. Koncentracije HD5 iz ELISA testa podijeljene su s kreatininom u urinu kako bi se uspostavili standardizirani omjeri HD5-urina i kreatinina (mg/mg) da bi se uzela u obzir razrjeđenost urina kao što je gore opisano.

Reference

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008.) Trenutačni koncepti molekularnih obrambenih mehanizama koji djeluju tijekom infekcije urinarnog trakta. Europski časopis za klinička istraživanja 38 Suppl 2: 29–38.

2. Zasloff M (2007) Antimikrobni peptidi, urođeni imunitet i normalno sterilni urinarni trakt. J Am Soc Nephrol 18: 2810-2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defenzini: antimikrobni i citotoksični peptidi stanica sisavaca. Annu Rev Immunol 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Posttranslacijska obrada defenzina u nezrelim ljudskim mijeloidnim stanicama. Blood 79: 1538–1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Ljudski beta-defensin-1 i alfa-defenzini kodirani su susjednim genima: dvije obitelji peptida s različitom disulfidnom topologijom dijele zajedničko podrijetlo. Genomika 43: 316–320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Humani beta-defensin-1: antimikrobni peptid urogenitalnog tkiva. J Clin Invest 101: 1633–1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Redukcija disulfidnih veza razotkriva snažno antimikrobno djelovanje ljudskog beta-defenzina 1. Nature 469: 419–423.

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Ekspresija ljudskih beta-defenzina 1 i 2 u bubrezima s kroničnom bakterijskom infekcijom. BMC Infect Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Defenzini Panethovih stanica: ključne efektorske molekule urođenog imuniteta. Transakcije Biokemijskog društva 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Ekspresija gena, imunolokalizacija i izlučivanje ljudskog defenzina-5 u ljudskom ženskom reproduktivnom traktu. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005.) Različiti defenzinski profili kod Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia trachomatis uretritis otkrivaju nove interakcije epitelne stanice i neutrofila. Infect Immun 73: 4823–4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Ekspresija antimikrobnih defenzina u muškom reproduktivnom traktu štakora, miševa i ljudi. Biologija reprodukcije 68: 95–104.

13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Izolacija ljudskih intestinalnih defenzina iz urina ilealnog nemjehura. FEBS pisma 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011.) Tolerancija bakteriurije nakon urinarne diverzije povezana je s antimikrobnom aktivnošću peptida. Urologija 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010.) Antobakterijska aktivnost i mehanizam rekombinantnog humanog alfa defenzina 5 protiv kliničkih sojeva otpornih na antibiotike. Afr J Microbiol Res 4: 626–633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Epitelni defenzini oštećuju adenovirusnu infekciju: implikacije za gensku terapiju posredovanu adenovirusom. Humana genska terapija 10: 957–964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mehanizam neutralizacije adenovirusa pomoću ljudskih alfa-defenzina. Stanični domaćin i mikrob 3: 11–19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gašparović ML, Manley K, et al. (2008) Ljudski alfa-defenzini inhibiraju infekciju virusom BK agregacijom viriona i blokiranjem vezanja na stanice domaćina. Časopis biološke kemije 283: 31125–31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et al. (2009) Studija lokalne imunosti infekcija donjeg genitalnog trakta. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) Urođeni i rani imunološki odgovor na izazov patogena u ženskom genitalnom traktu i ključna uloga epitelnih stanica. Journal of Reproductive Imunology 57: 61–79.