Kako eksprimirati ljudski defensin u bubregu i urinarnom traktu 5

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer i sur

Sažetak

Pozadina:Mehanizmi koji održavaju sterilnost u urinarnom traktu nisu u potpunosti shvaćeni. Nedavne studije ukazale su na važnost antimikrobnih peptida (AMP) u zaštiti urinarnog trakta od infekcija. Ovdje karakteriziramo ekspresiju i relevantnost AMP humanog alfa-defenzina 5 (HD5) u ljudskombubregi urinarnog trakta u normalnih i zaraženih osoba.

Metodologija/Glavni nalazi:Korištenje RNA izolirane iz čovjekabubreg, uretera i tkiva mokraćnog mjehura, izveli smo kvantitativni PCR u stvarnom vremenu kako bismo pokazali da se DEFA5, gen koji kodira HD5, konstitutivno eksprimira u cijelom urinarnom traktu. Uz pijelonefritis, ekspresija DEFA5 značajno se povećala ububreg. Korištenjem imunoblot analize, proizvodnja HD5 također se povećala s pijelonefritisom. Imunološko bojenje lokaliziralo je HD5 na urotel mokraćnog mjehura i uretera. U bubregu se HD5 primarno proizvodi u distalnom nefronu i sabirnim tubulima. Korištenjem imunoblota i ELISA testova, HD5 nije rutinski detektiran u uzorcima neinficiranog ljudskog urina, što znači da je proizvodnja HD5 u urinu povećana s infekcijom urinarnog trakta E.coli.

Zaključci/Značaj:DEFA5 se eksprimira u cijelom urinarnom traktu u neinficiranih subjekata. Konkretno, HD5 se eksprimira u čitavom urotelu donjeg urinarnog trakta i u sabirnim tubulimabubreg. Uz infekciju, ekspresija HD5 se povećava ububreg, a razine se mogu otkriti u urinu. Koliko znamo, naša otkrića predstavljaju prvo kvantificiranje ekspresije i proizvodnje HD5 u ljudskom bubregu. Štoviše, ovo je prvo izvješće koje otkriva prisutnost HD5 u zaraženim uzorcima urina. Naši rezultati pokazuju da HD5 može imati važnu ulogu u održavanju sterilnosti urinarnog trakta.

Cistanche UK za bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

Uvod

Urinarni trakt, osim meatusa uretre, obično je sterilan unatoč blizini fekalne flore. Precizni mehanizmi pomoću kojih urinarni trakt održava svoju sterilnost nisu dobro poznati. Predloženi mehanizmi koji pridonose obrani urinarnog trakta uključuju protok urina, promjene u pH i osmolarnosti urina, redovito pražnjenje mokraćnog mjehura, kemijske obrambene komponente uroepitela i epitelno odbacivanje/influks efektorskih imunoloških stanica uz bakterijsku stimulaciju [1]. Osim toga, nedavno se pokazalo da antimikrobni peptidi (AMP) imaju važnu ulogu u održavanju sterilnosti urinarnog trakta [2]. AMP, koji služe kao prirodni antibiotici koje proizvode gotovo svi organizmi, sveprisutna su komponenta urođenog imunološkog sustava. AMP su kationske molekule koje eksprimiraju fagocitne bijele stanice i epitelne stanice. Kod ljudi i drugih sisavaca defenzini su glavna obitelj AMP-a. Defenzini obično imaju antimikrobno djelovanje širokog spektra protiv gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija, virusa, gljivica i protozoa [2,3]. Defenzini se inicijalno sintetiziraju kao preproproteini i podvrgavaju se procesuiranju kako bi postali zreli, biološki aktivni peptidi [4]. Kod ljudi se defenzini klasificiraju u jednu od dvije obitelji ovisno o njihovom uzorku disulfidnih mostova – alfa-defenzini ili beta-defenzini [5].

U urinarnom traktu, beta-defenzini su široko izraženi u uroepitelu. Epitelne stanice koje oblažububregHenleova petlja, distalni tubul i sabirni kanal konstitutivno eksprimiraju ljudski beta-defenzin 1 (hBD1). Iako su razine hBD1 u urinu nedovoljne da ubiju bakterije koje napadaju, hBD1 osigurava brzodjelujući antimikrobni omotač tubularnih lumena i sprječava infekciju inhibicijom vezanja bakterija na urotel [6]. Nedavne studije pokazuju da redoks-stanje hBD1 značajno utječe na antimikrobnu moć, tako da je reducirani peptid mnogo snažniji od disulfidno vezanog oksidiranog oblika [7]. Značaj ovoga na površini urotela nije utvrđen. Drugi defensin, humani beta-defensin 2 (hBD2) nije konstitutivno izražen u zdravom tkivu bubrega; međutim, ekspresija hBD2 je inducirana infekcijom [8].

Za razliku od beta-defenzina, uloga alfa-defenzina izvedenih iz epitela nije dobro opisana u urinarnom traktu. Ekspresija i funkcija alfa-defenzina HD5 i HD6 uglavnom su prijavljeni u tankom crijevu gdje ih izlučuju Paneth stanice u crijevne kripte i pridonose ravnoteži crijevne mikrobiote [9]. HD5 je također lokaliziran u muškom i ženskom genitalnom traktu, s dokazima koji sugeriraju da je inducibilan i važan u iskorjenjivanju infekcije [10,11,12]. HD5 u urinu otkriven je kod pacijenata koji su bili podvrgnuti rekonstrukciji neobukraljenog mjehura ileuma i preusmjeravanju urinarnog kanala ileuma pri čemu je izvor proizvodnje HD5 primarno pripisan Panethovim stanicama ileuma [13,14]. HD5 ima antibakterijsko djelovanje protiv uobičajenih uropatogenih gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija [15]. HD5 također ima antimikrobno djelovanje protiv uropatogenih virusa poput adenovirusa i BK virusa [16,17,18]. U ovoj studiji dajemo početni opis i kvantifikaciju ekspresije HD5 kod ljudibubregte dalje definiraju njegovu ekspresiju u donjem urinarnom traktu tijekom steriliteta i infekcije.

Rezultati

DEFA5 mRNA se konstitutivno eksprimira u ljudskom mjehuru, ureteru i bubregu

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu pokazuje da su svi testirani uzorci mokraćnog mjehura, uretera i bubrega bez infekcije konstitutivno eksprimirali DEFA5. Ekspresija DEFA5 bila je značajno veća u donjem urinarnom traktu nego u gornjem urinarnom traktu (p= 0.014). U mokraćnom mjehuru (n=4), prosječna ekspresija DEFA5 bila je 4,656637 transkripata po 10 ng RNA, au ureteru (n=4) srednja ekspresija DEFA5 bila je 4,1126170 transkripata po 10 ncRNA (Slika 1A) . U bubregu (n=6), srednja ekspresija DEFA5 bila je 2,9376274 transkripta po 10 ng RNA. Ekspresija DEFA5 analizirana je zasebno u korteksu bubrega, meduli i zdjelici. Ekspresija DEFA5 nije značajno varirala po regiji bubrega (p= 0.45).

Ekspresija DEFA5 i ekspresija HD5 peptida povećavaju se s pijelonefritisom

Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenu provedena na bubrežnom tkivu s pijelonefritisom pokazala je značajno povećanje ekspresije DEFA5 u usporedbi s neinficiranim bubrežnim tkivom. S pijelonefritisom (n= 6), prosječna ekspresija DEFA5 porasla je na 782961052 transkripata po 10 ng RNA (p= 0.019) (Slika 2A).

Kako bismo dodatno procijenili ovo povećanje ekspresije s pijelonefritisom, proveli smo imunoblot analizu na istom bubrežnom tkivu korištenom za PCR analizu u stvarnom vremenu kako bismo procijenili istodobno povećanje proizvodnje HD5 peptida (Slika 2B, srednja ploča). Imunoblot analiza, korištenjem poliklonskih HD5 antiseruma, pokazala je značajno veću proizvodnju HD5 peptida u tkivima bubrega s pijelonefritisom (n=6) u usporedbi s neinficiranim tkivima bubrega (n=6). Neinficirano tkivo bubrega izražavalo je 300625 ng HD5/gram težine vlažnog tkiva, dok je tkivo bubrega s pijelonefritisom izražavalo 600621 ng HD5/gram težine vlažnog tkiva (p,0,0001). Mrlje su ponovno ispitane s GAPDH da služe kao kontrola punjenja (Slika 2B, srednja ploča), a također je izvedeno bojenje srebrom da se potvrdi jednako opterećenje proteinima (Slika 2B, gornja ploča).

HD5 peptid se proizvodi u ljudskim bubrezima i urinarnom traktu

Provedeno je imunološko bojenje kako bi se lokalizirala proizvodnja HD5 u urinarnom traktu. Imunohistokemija (IHC) je pokazala da je HD5 imunoreaktivnost bila prisutna u cijelom urotelu uretera i mokraćnog mjehura svih ispitanih uzoraka (n=4, slika 3). IHC je također pokazala da je HD5 proizveden u tubulima bubrežnog korteksa i medule svih primjerci (n= 6, slika 4). Imunofluorescencija (IF) je pokazala da je ekspresija HD5 najveća u distalnom nefronu i sabirnim tubulima (Slika 5). Intersticij i glomeruli nisu pokazali HD5 imunoreaktivnost. Imunobojenje prikazano na slikama 3, 4 i 5 provedeno je pomoću mišjeg monoklonskog anti-HD5 protutijela (8C8) koje prepoznaje HD5 propeptid (Abcam, Cambridge, MA). Rezultati su bili slični kada se koristilo zečje poliklonsko anti-HD5 protutijelo koje prepoznaje HD5 propeptid i zreli peptid (podaci nisu prikazani) – što sugerira da je HD5 pohranjen kao propeptid.

S pijelonefritisom, imunološko bojenje HD5 značajno se povećalo. Imunoreaktivnost HD5 povećala se kroz proksimalni nefron, distalni nefron i sabirne tubule (Slika 4 i Slika 5). Kao i kod neinficiranih uzoraka, glomeruli i intersticij nisu pokazali ekspresiju HD5 s infekcijom. Negativne kontrole nisu pokazale HD5 imunoreaktivnost.

Zaraženi ljudski urin sadrži mjerljive

koncentracije HD5 peptida

Imunoblot analiza, korištenjem zečjeg poliklonalnog antiseruma koji detektira prekursor proHD5 i dalje obrađene oblike, identificirala je mjerljive razine HD5 u 13 od 15 testiranih uzoraka urina zaraženih uropatogenom E.coli (Slika 6A i B). Kada su prisutne, razine HD5, normalizirane na kreatinin u mokraći, kretale su se od 299,8–669,7630 ng HD5/mg Cr urina (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), što odgovara 11,10–27,67 nmol/L. U uzorcima zaraženog urina (n=15), HD5 je bio na ili ispod granice detekcije (,50 ng). Imunoenzimski test (ELISA) na istim uzorcima urina, koristeći mišje monoklonsko protutijelo (8C8) koje otkriva samo prekursor proHD5, otkrio je mjerljive razine proHD5 u 13 od 15 testiranih zaraženih uzoraka. Koncentracije proHD5 u urinu kretale su se od 122,78–490,060,03 ng HD5/mg Cr urina (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) kada je bio prisutan (Slika 7).

Rasprava

U ovoj studiji pružamo početnu karakterizaciju HD5 u ljudskom bubregu, ureteru i mjehuru. Pokazalo se da je HD5 važan AMP koji sprječava invazivnu infekciju u crijevima i pojačan je u genitalnom traktu tijekom infekcije [11,18,19,20,21]. AMP-ovi dobiveni iz epitela, poput HD5, pokazali su se važnima u održavanju sterilnosti u urinarnom traktu [8,22,23,24]. Nedostaci ove urođene obrane sluznice mogu rezultirati akutnom i/ili kroničnom infekcijom [25,26].

Naši kvantitativni rezultati PCR-a u stvarnom vremenu pokazuju da se DEFA5 konstitutivno eksprimira u ljudskim bubrezima, ureterima i mjehuru. Ekspresija DEFA5 povećava se od gornjeg urinarnog trakta prema donjem urinarnom traktu – prateći tok urinarnog toka i sve veću blizinu točke invazije mikrobiote. Koliko znamo, ovo je prva studija koja je kvantificirala ekspresiju DEFA5 u ljudskom bubregu i mjehuru. Nedavno su Townes i suradnici pokazali da normalni distalni ureter može eksprimirati DEFA5 [14]. Naši rezultati također sugeriraju da se DEFA5 konstitutivno izražava u distalnom ureteru. Iako je ekspresija DEFA5 u urinarnom traktu gotovo 100-puta niža od one pronađene u gastrointestinalnom tkivu, bazalna uroepitelna ekspresija DEFA5 usporediva je s ekspresijom prethodno opisanih pojačala urinarnog traka kao što su katelicidin, hBD-1, hBD -2, i ribonukleaza 7[6,8,22,24,27]. Za razliku od zrelog gastrointestinalnog trakta gdje se DEFA5 izražava na visokim razinama u oba stanja zdravlja i infekcije/upale, naša kvantitativna analiza u stvarnom vremenu PCR podaci pokazuju da je ekspresija DEFA5 u bubrezima značajno pojačana s infekcijom [27,28,29]. Ovaj inducibilni obrazac ekspresije analogan je ekspresiji DEFA5 u ženskom reproduktivnom traktu gdje se ekspresija DEFA5 povećava sa salpingitisom [30]. U urinarnom traktu, Townes i suradnici pokazali su trend prema većoj ureteralnoj ekspresiji DEFA5 u bolesnika s IMS-om koji su bili podvrgnuti urinarnoj diverziji ilealnog kanala [14].

Naša imunoblot analiza nadopunjuje PCR podatke u stvarnom vremenu pokazujući da se proizvodnja HD5 peptida povećava s pijelonefritisom. Ovaj inducibilni obrazac proizvodnje HD5 sličan je onom viđenom kod nekih članova obitelji beta-defenzina. hBD2 pokazuje inducibilni obrazac proizvodnje s infekcijom urinarnog trakta i/ili kroničnim pijelonefritisom [8,31,32]. Pokazalo se da se proizvodnja HD5peptida povećava u gornjem dijelu ženskog genitalnog trakta i muške uretre s upalom [11,30].

Koristeći imunološko bojenje, demonstrirali smo da se HD5 ravnomjerno proizvodi kroz urotel uretera i mokraćnog mjehura. Budući da je velika većina infekcija mokraćnog sustava posljedica fekalne flore koja se penje u mjehur, ovi rezultati sugeriraju da je ekspresija HD5 prisutna na mjestima gdje je izloženost mikrobima najčešća [33]. Stoga je HD5 idealno postavljen za sprječavanje uzlazne mikrobne infekcije. U bubregu se HD5 prvenstveno proizvodi u distalnom nefronu i sabirnom tubulu. Ova otkrića sugeriraju da se HD5 proizvodi na mjestima gdje će biti postavljen kako bi imao optimalnu antimikrobnu aktivnost. Prethodne studije pokazale su da antimikrobna svojstva defenzina ovise o koncentraciji soli – pri čemu veće koncentracije soli smanjuju antimikrobnu aktivnost [23,34,35]. Nagađamo da niske koncentracije soli u distalnom nefronu i sabirnim tubulima pružaju povoljno okruženje za antimikrobno djelovanje HD5.

Imunoblot i ELISA analiza također pokazuju da se HD5 izlučuje u urinu u niskim razinama. S obzirom na veličinu (8,1 kDa i 3,7 kDa) i pozitivan naboj proHD5 i potpuno obrađenog HD5, moguće je da neki urinarni HD5 peptid potječe, barem djelomično, iz filtrata plazme. Ipak, malo je dokaza koji sugeriraju da HD5 postoji u plazmi [27]. Dodatno, da bi se pojavio u urinu, HD5 bi trebao izbjeći učinkovite mehanizme apsorpcije peptida u proksimalnom tubulu [6,36]. Konačno, korišteni uzorci urina prošli su centrifugiranje prije izvođenja testova, čime su uklonjeni stanični izvori HD5. U otkrivenim koncentracijama, HD5 u urinu vjerojatno neće biti izravno antimikroban protiv uropatogenih mikroorganizama budući da potpuno prerađeni HD5 ima minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIC) između 6-10 mg/mL protiv uobičajenih gram-negativnih uropatogenih bakterija [15]. Međutim, koncentracije na površini sluznice vjerojatno će biti veće. Nadalje, imunoblot analiza pokazuje da su koncentracije HD5 značajno veće u bubrezima. Ovi rezultati sugeriraju da je HD5 uključen u obranu sluznice urinarnog trakta. Analogni uzorak se vidi s hBD1, gdje koncentracije hBD1 u urinu nisu dovoljne da pokažu antimikrobno djelovanje, ali se veće koncentracije peptida otkrivaju u blizini bubrežnih tubula [6,31].

Budući da IHC pokazuje da je proHD5 glavni oblik HD5 u bubrezima i budući da se i zreli i proHD5 otkrivaju u urinu, nagađamo da se HD5 primarno izlučuje kao prekursorska molekula, a zatim prolazi proteolitičku obradu kako bi se stvorili zreli oblici – slično gastrointestinalnom i genitourinarnog trakta [11,30,37]. U tankom crijevu, Panethove stanice proizvode tripsin, koji cijepa propeptid HD5 tako da je potpuno obrađeni peptid dominantan oblik u lumenu crijeva [37]. U muškoj uretri, ključni enzimi za obradu i aktivaciju HD5 su neutrofilne proteaze kojima doprinosi

neutrofili regrutirani na mjesto infekcije [11]. Doprinosi epitelnog tripsinogena, urinarnog tripsina i/ili neutrofilnih proteaza procesuiranju HD5 u urinarnom traktu tijekom infekcije tek treba utvrditi. Štoviše, učinci promjena u urinarnom okruženju na funkciju HD5 (promjene u osmolarnosti, pH i kationskim koncentracijama) također se trebaju utvrditi.

Zaključno, ovo je prva studija koja je identificirala i kvantificirala ekspresiju i proizvodnju HD5 u urinarnom traktu. Naši rezultati sugeriraju da je HD5 epitelni AMP koji može igrati važnu ulogu u urođenom imunitetu ljudskog uroepitela sprječavajući translokaciju napadačkih patogena u cirkulaciju. Razjašnjenje čimbenika koji reguliraju proizvodnju HD5 može dati novi uvid u patogenezu IMS kod pacijenata kod kojih postoji rizik od IMS i pacijenata s kroničnim infekcijama.

Metode

Odobrenje studije

Informirani pismeni pristanak dobiven je od svih pacijenata koji su sudjelovali u ovoj studiji. Za ispitanike mlađe od 18 godina dobiven je pismeni pristanak roditelja/skrbnika. Odbor za institucionalni pregled NationwideChildren's Hospital (NCH) odobrio je ovu studiju zajedno s postupkom pristanka i dokumentima (IRB07-00383).

Uzorci ljudskog tkiva i urina

Neinficirano distalno tkivo uretera i mokraćnog mjehura (n= 4) dobiveno je od djece koja su podvrgnuta ponovnoj implantaciji uretera iz razloga koji nisu ponovljena infekcija. Neinficirani uzorci bubrega (n=6) dobiveni su od pacijenata koji su podvrgnuti nefrektomiji zbog tumora bubrega. Uzorci tkiva bili su bez makroskopskih znakova bolesti ili upale. Bubrežno tkivo pacijenata s kroničnim pijelonefritisom osigurala je Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Dva neovisna patologa potvrdila su histopatološku dijagnozu pijelonefritisa. Uzorci tkiva su brzo zamrznuti ili sačuvani kao neutralni formalinom fiksirani parafinski isječci. Dijelovi neinficiranog bubrežnog tkiva secirani su u korteks, medulu ili bubrežnu zdjelicu prije skladištenja (n=4).

Uzorci neinficiranih i inficiranih urina uzeti su od djece koja su se javila u hitnu službu NCH-a ili na nefrološku kliniku. Dijagnoza IMS postavljena je pozitivnom urinokulturom prema smjernicama Američke akademije za pedijatriju [39]. Svi uzorci zaraženog urina imali su.106 CFU/mL E.coli. pH vrijednosti urina kretale su se od 5,5 do 8,5 (srednja vrijednost urina 6,9). Ionski sastav urina nije mjeren. Uzorci urina su centrifugirani kako bi se uklonio sediment urina i dodan je koktel inhibitora proteaze (Thermo Scientific, Rockford, IL, SAD).