hrJezik
Dom / Znanje / Sadržaj

Znanje

Učinci angiotenzina II na proizvodnju eritropoetina u bubrezima i jetri

May 09, 2022

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com
Sažetak: Thebubregje glavno mjesto proizvodnje eritropoetina u tijelu. Razvili smo novu metodu za detekciju EPO proteina deglikozilacijski spregnutim Western blotingom. Detekcija deglikoziliranog Epoa omogućuje ispitivanje malih promjena u proizvodnji Epoa. Koristeći ovu metodu, istraživali smo učinke angiotenzina II (ATII) na proizvodnju Epo u bubrezima. ATII je stimulirao koncentraciju Epoa u plazmi; Ekspresija mRNA Epo, HF2a i PHD2 u segmentima nefrona u korteksu bubrega i vanjskoj srži; i ekspresija Epo proteina u korteksu bubrega. Hibridizacija in situ i imunohistokemija otkrile su da ATII stimulira Epo mRNA i ekspresiju proteina ne samo u proksimalnim tubulima nego i u sabirnim kanalićima, posebno u interkaliranim stanicama. Ovi podaci podupiru regulaciju proizvodnje EPO u bubrezima putem sustava renin-angiotenzin-aldosteron (RAS).

Ključne riječi: eritropoetin; angiotenzin I; sustav renin-angiotenzin-aldosteron; deglikozilacija; Western blotting; HIF2 ; proksimalni tubuli; sabirni kanali

life extension standardized cistanche: protection liver

Kliknite da saznate za što se koristi cistanche

1. Uvod

Eritropoetin (EPO) stimulira proizvodnju eritrocita u koštanoj srži[1]. Hipoksija i anemija stimuliraju proizvodnju Epoa u bubrezima [1-4]. Teška hipoksija i teška anemija uzrokuju više od 500-struko povećanje koncentracije Epoa u serumu [5]. Međutim, takva su stanja rijetka i većina ih ljudi ne doživi tijekom života. Serumska koncentracija EPO u normalnih ljudi je niska, a ekspresija Epo proteina u kontrolnim bubrezima bila je preniska da bi se otkrila [5-8]. Razvili smo novu Western blotting metodu i otkrili da je deglikozilirani Epo točan marker ekspresije Epo [5,9]. EPO protein u bubregu detektira se na 34-43 kDa, a deglikozilacija pomoću PNGase pomiče pojas na 22 kDa. Široki pojas Eoo koncentriran je na uski pojas od 22 kDa, što rezultira povećanjem osjetljivosti detekcije 10-100-puta [5,9]. Tako je detekcija malih promjena u Epo proizvodnji postala moguća.

Sustav renin-angiotenzin-aldosteron (RAS) regulira bubrežno izlučivanje vode i elektrolita kako bi se održala homeostaza tjelesnih tekućina [10,11]. Inhibitori RAS uzrokuju anemiju smanjujući proizvodnju Epo. Kim i sur. objavio je da angiotenzin II (ATI) povećava proizvodnju Epo putem aktivacije ranog odgovora rasta-1(Egr-1) ​​posredovanog receptorom angiotenzina 1 (AT1R) u ljudskim bubrežnim 786-O stanicama [12,13 ] Kato i sur. izvijestili su da transgeni miševi koji imaju gene za renin i angiotenzinogen pokazuju eritrocitozu, a oni nokaut miševi koji nemaju renin i angiotenzinogen pokazuju anemiju [14,15]. Anemija miševa s nokautom angiotenzinogena spašena je infuzijom ATII, što sugerira da genetski put od angiotenzinogena do AT igra ključnu ulogu u proizvodnji Epo izazvanoj ATII. Ova izvješća sugeriraju da proizvodnju Epoa reguliraju ne samo hipoksija ili anemija, već i RAS [4,12,14-18]. U našim prethodnim izvješćima pokazali smo da aldosteron stimulira proizvodnju Epo interkaliranim stanicama sabirnih kanalića[7]. U ovom izvješću ispitali smo učinke ATII na proizvodnju Epoa od stranebubregijetra.

Proširene informacije:Cistancheje sladak, slan i topao po prirodi. Pripada meridijanima bubrega i debelog crijeva. Cistanche može zaštititiishemijski miokard, snižavaju lipide u krvi, odupiru se aterosklerozi i antitrombozi, smanjuju periferni vaskularni otpor, snižavaju krvni tlak i odupiru se masnoj jetri i drugim farmakološkim aktivnostima. UkupnoglukozidiCistanche može značajno poboljšati preživljavanje primarnih kultiviranih hepatocita. Drugim riječima, ukupni glukozidi Cistanche mogu smanjiti apoptozu povećanjem ekspresije inhibitornih gena i smanjenjem ekspresije pro-apoptotskih gena kroz apoptozu. apoptozu i nekrozu, povećava stopu preživljavanja stanica i postiže zaštitni učinak na primarne hepatocite. U eksperimentu s miševima, 15-postotni vodeni uvarak Cistanche može popraviti strukturu tkiva jetrenih stanica i povećati sadržaj jetrenog glikogena kod miševa podvrgnutih stresnom vježbanju, kako bi se postigao njegov zaštitni učinak na jetru.

cistanche herb benefits：improve kidney function

2. Rezultati

2.1. Epo koncentracija u plazmi

Primjena ATI-ja povećala je koncentraciju Epo u plazmi s 1,4 ± 0,2 na 2,9 ±0,3 mIU/mL (Slika la).

2.2. Ekspresija Epo mRNA u bubrežnom korteksu i mikrodiseciranim proksimalnim uvijenim tubulima (PCT) i medularnim debelim uzlaznim udovima (MAL)

ATII je stimulirao ekspresiju Epo i HIF2& mRNA u korteksu bubrega za 13,2±4,7 i 11,4±0.6 puta za A1 i A10, odnosno (n=3-4) i 9,6±3,7 i 8 0,6±2,6 puta za A1 i A10, odnosno (n=3-4)(Slika lbc). U mikrodiseciranom PCT-u, ATI je povećao Epo mRNA za 3,4±0.7 i 2,4± 0.2 puta za 10-9 M odnosno 10-6M ATII (n=3) i HIF2& mRNA za 2.0±{{5{{ 54}}}}.2 i 2,3± 0,8 puta za 10-9M i 10-6 M ATII, odnosno (n=3) (Slika 1ld,e). ATII je također povećao ekspresiju Epo mRNA u MAL-u za 4,3±1,0 i 6,5±2,0 puta za 10-M i10-6MATI (n=3) (Slika 1f

image

Figure 1.Epo mRNA expression.(a)Plasma Epo concentration in control and ATI-injected rats. ATll significantly increased the plasma Epo concentration from 1.4 ± 0,2 to 29±0.3 mIU/mL (*p<0.05).(b,c) ATll significantly increased Epo mRNAexpression in the renal cortex(13.2±4.7 and 11.4±0.6 times increase by A1 and A10, respectively) (b), and HIF2a mRNA expression was also stimulated by ATll(9.6± 3.7 and 8.6 ± 2.6 times increase by AI and A10, respectively)(c)(d-f) In microdissected nephron segments, ATII increased Epo mRNA expression in PCT(d) and MAL(f).HIFla mRNA was also increased by ATI in PCT(e). C,control;A1ATI 1mg/keg; A10. ATII 10 mg/kg; ATII9, AT2 10-9M; ATI6,ATII 10-6 M.*p<0.05,*p<001 by the t-test or a non-parametric analysis using the Kruskal-Wallis test and multiple comparisons by the Dunnettor Shirley-Williams'test.

2.3. In situ hibridizacija Epoa i učinci ATII

Ekspresija EPO mRNA primijećena je u kortikalnim nefronima u bazalnim uvjetima, kao što je ranije objavljeno [19]. ATII je stimulirao ekspresiju Epo mRNA u PCT, MAL i kortikalnim i medularnim sabirnim kanalima (CCD i OMCD) nakon 2 sata (Slika 2:2a, 2d). ). Ekspresija mRNA HIF2a povećala se u većini segmenata nefrona i peritubularnih stanica korteksa i medule (Slika 2:2-4b,2-4e). Ekspresija mRNA PHD2 također se povećala u MAL, CCD i OMCD (Slika 2:3-4c, 3-4f). ATII nije uspio inducirati ekspresiju mRNA Epo u peritubularnim stanicama bubrežnog korteksa.

ATII on Epo mRNA expression evaluated by ISH. In situ hybridization was used to analyze the effects of ATII on Epo, HIF2α, and PHD2 mRNA expression in mouse kidneys. Epo mRNA expression was observed in cortical nephrons under basal conditions (1-a,d). ATII stimulated Epo mRNA expression in PCT, MAL, CCD, and OMCD at 2–6 h (2⁓4-a,d) and HIF2α mRNA expression in most nephron segments and peritubular cells of both the cortex and the medulla at 2– 6 h (2⁓4-b,e). In contrast, ATII stimulated PHD2 mRNA expression in MAL, CCD, and OMCD at 4– 6 h (3⁓4-c,f). (a–c) Renal cortex and (d–f) renal outer medulla. The numbers 1, 2, 3, and 4 show 0, 2, 4, and 6 h after the injection of ATII, respectively. 2.4. Western Blotting Analysis of ATII-Induced Epo Production in the Kidney and Liver The effects of fludrocortisone, an aldosterone agonist, were examined using deglycosylation-coupled Western blotting. The band of deglycosylated Epo at 22 kDa was observed in control rats (C2, C4, and C6 in Figure 3a right side), showing that Epo is produced in control rats. Fludrocortisone significantly stimulated the expression of deglycosylated Epo at 2 and 4 h after injection. The expression became equal to that in control rats Figure 2. Effects of ATII on Epo mRNA expression evaluated by ISH. In situ hybridization was used to analyze the effects of ATII on Epo, HIF2α, and PHD2 mRNA expression in mouse kidneys. Epo mRNA expression was observed in cortical nephrons under basal conditions (1-a,d). ATII stimulated Epo mRNA expression in PCT, MAL, CCD, and OMCD at 2–6 h (2~4-a,d) and HIF2α mRNA expression in most nephron segments and peritubular cells of both the cortex and the medulla at 2–6 h (2~4-b,e). In contrast, ATII stimulated PHD2 mRNA expression in MAL, CCD, and OMCD at 4–6 h (3~4-c,f). (a–c) Renal cortex and (d–f) renal outer medulla. The numbers 1, 2, 3, and 4 show 0, 2, 4, and 6 h after the injection of ATII, respectively

2.4. Western blotting analiza ATI-inducirane Epo proizvodnje u bubrezima i jetri

Učinci fludrokortizona, agonista aldosterona, ispitivani su korištenjem deglikozilacijsko spregnutog Western blottinga. Traka deglikoziliranog Epo pri 22 kDa opažena je u kontrolnih štakora (C2, C4 i C6 na slici 3a s desne strane), pokazujući da se Epo proizvodi u kontrolnih štakora. Fludrokortizon je značajno stimulirao ekspresiju deglikoziliranog Epo 2 i 4 sata nakon injekcije. Ekspresija se izjednačila s onom u kontrolnih štakora nakon 6 h. Zatim je ispitan učinak ekspresije ATIIon Epo. Učinak ATI na proizvodnju Epo bio je veći u bubrežnom korteksu nego u vanjskoj srži bubrega (Slika 3b). Učinak ATI na proizvodnju Epoa nije primijećen u unutarnjoj srži bubrega (podaci nisu prikazani). ATI je ovisno o dozi povećao ekspresiju Epo proteina (Slika 3c). AT je povećao proizvodnju deglikoziliranog Epo u korteksu bubrega za 1,6±0.2 i 3.4±0.3 puta za 1 odnosno 10 mg/kg (n=6-8). Nasuprot tome, proizvodnja EPO nije uočena u jetri, čak ni nakon primjene ATII (Slika 3d).

ffects of fludrocortisone and ATII on Epo protein expression in the kidney and liver. (a) Effects of fludrocortisone on Epo production in the kidney. Fludrocortisone increased deglycosylated Epo protein expression at 2 and 4 h after the injection. The levels returned to basal values after 6 h. (b) ATII dose-dependently increased deglycosylated Epo protein expression in the renal cortex and outer medulla. The effects were larger in the renal cortex than in the renal outer medulla. (c) ATII increased deglycosylated Epo production in the renal cortex by 1.6- and 3.4-fold by 1 and 10 mg/kg, respectively. (d) In contrast, deglycosylated Epo production was not observed in control and ATII-injected livers. Recombinant rat Epo is shown as the control in Figure 3c. Glycosylated Epo and deglycosylated rat Epo were used in lane 1. Glycosylated Epo and deglycosylated Epo were used in lanes 11 and 12, respectively. * p < 0.05, ** p < 0.01 by a non-parametric analysis using the Kruskal–Wallis test and multiple comparisons by the Shirley–Williams' test. Figure 3. Effects of fludrocortisone and ATII on Epo protein expression in the kidney and liver. (a) Effects of fludrocortisone on Epo production in the kidney. Fludrocortisone increased deglycosylated Epo protein expression at 2 and 4 h after the injection. The levels returned to basal values after 6 h. (b) ATII dose-dependently increased deglycosylated Epo protein expression in the renal cortex and outer medulla. The effects were larger in the renal cortex than in the renal outer medulla. (c) ATII increased deglycosylated Epo production in the renal cortex by 1.6- and 3.4-fold by 1 and 10 mg/kg, respectively. (d) In contrast, deglycosylated Epo production was not observed in control and ATII-injected livers. Recombinant rat Epo is shown as the control in Figure 3c. Glycosylated Epo and deglycosylated rat Epo were used in lane 1. Glycosylated Epo and deglycosylated Epo were used in lanes 11 and 12, respectively. * p < 0.05, ** p < 0.01 by a non-parametric analysis using the Kruskal–Wallis test and multiple comparisons by the Shirley–Williams' test.

2.5. Imunohistokemija proizvodnje Epo putem bubrega

Pomoću IHCof miševa, pod bazalnim uvjetima, pronađeno je Epo bojenje od proksimalnih tubula do sabirnih kanalića (proksimalnih tubula

Figure 4. Immunohistochemical study of the effects of ATl on Epo production by the kidney.Under basal conditions, Epo staining was found from the proximal tubules to the collecting ducts (proximal tubules< thick ascending limbs<collecting ducts)(1-a-c).ATIl increased Epoproduction in MAL, CCD, and OMCD(3~4-a-c), particularly in the type A intercalated cells, after 4-6h (brown cells in 3~4-a-c). The renal outer medulla is shown at a different magnification. The numbers 1,2,3,and 4 show 0, 2,4, and 6 h after the injection of ATIl, respectively.

cistanche propiedades blood lipid lowering

3. Rasprava

Detekcija Epoa Western blotingom bila je teška sve dok nismo otkrili test povezan s deglikozilacijom [5,7,9,20-26]. Kod teške hipoksije i anemije, proizvodnja EPO je stimulirana do visoke razine i otkrivanje EPO je lako [2-5]. Međutim, takvi su uvjeti rijetki in vivo. Otkrili smo da Epo proizvode bubrezi čak i u kontroliranim uvjetima. Detekcija Epo u kontrolnom bubregu je teška, čak i našim Western blotingom. Deglikozilacija Epo pomoću PNGase povećava intenzitet vrpce Epo na 22 kDa, što omogućuje otkrivanje nižih razina EPO. Koristeći ovu metodu, istraživali smo učinke fludrokortizona i ATII na proizvodnju Epoa.

ATll je povećao ekspresiju Epo mRNA u korteksu bubrega. Zatim smo ispitali učinke ekspresije ATIIon Epo mRNA u mikrodiseciranim PCT i MAL. ATll je povećao ekspresiju Epo mRNA u PCT i MAL. Također smo ispitali učinke ATI in situ hibridizacijom (ISH). ISH je otkrio da ATI povećava ekspresiju Epo mRNA ne samo u

proksimalnim tubulima ali i u distalnim tubulima. Nadalje, istražili smo ekspresiju Epo proteina Western blotom. U ovoj studiji korišten je Western blotting povezan s deglikozilacijom. Rezultati pokazuju da ATIl ovisno o dozi povećava ekspresiju Epo proteina u bubrezima, ali ne i u jetri. Koncentracija Epoa u plazmi povećala se 2-3-puta, što je kompatibilno s prethodnim izvješćima 4,68,12. Ova razina proizvodnje EPO u krvi ne može se mjeriti Western blotom. Međutim, Western blotting povezan s deglikozilacijom omogućio je detekciju, a ATII je značajno povećao ekspresiju Epo proteina u bubregu. Imunohistokemija je također pokazala da ATlI povećava ekspresiju Epo proteina u proksimalnim i distalnim tubulima. Učinak ATII identičan je onom fludrokortizona u interkaliranim stanicama sabirnih kanalića [7]. Naša studija je prva koja pokazuje intrarenalnu lokalizaciju ATII-inducirane Epo proizvodnje ISH i IHC.

AT 11 je također povećao ekspresiju HIF2 mRNA u bubrežnom korteksu i proksimalnim uvijenim tubulima, pokazujući da je povećanje proizvodnje Epo pomoću ATII uzrokovano stimulacijom HIP2, kao i aldosterona [7l. Naše istraživanje pokazuje da je proizvodnja EPO u bubrezima regulirana sustavom renin-angiotenzin-aldosteron. Predložena je uloga ATIⅡ u proizvodnji Epoa u bubrezima [4,12,16-18]. Jelkmann je sugerirao neizravne učinke angiotenzina Ⅱl kao faktora rasta mijeloidnih eritrocitnih progenitora |4|. Kim i sur. jasno objavljeno da angiotenzin II stimulira proizvodnju Epo preko AT1R-posredovane Egr-1 aktivacije protein kinazom aktiviranom p21Ras-mitogenom/ekstracelularnom signalom reguliranom kinazom (ERK) kinazomERK/2 u ljudskim bubrežnim 786-O stanicama [12.13 ]. Ulogu genetskog puta od angiotenzinogena do ATII ispitali su Kato i sur. [14,15]. Pokazali su da transgeni miševi koji imaju gene za renin i angiotenzinogen pokazuju eritrocitozu. Također su izvijestili da nokautirani miševi bez renina i angiotenzinogena pokazuju anemiju koja je spašena infuzijom ATIl, sugerirajući da genetski put od angiotenzinogena do ATll igra ključnu ulogu u ATI-induciranoj proizvodnji Epo. Mehanizmi proizvodnje Epoa u teškim hipoksičnim i bazalnim uvjetima mogu biti različiti, ali neki koraci poput stimulacije HIF2 mogu biti isti. Sposobnost proizvodnje Epo bila bi različita između bubrežnih intersticijskih stanica i nefrona. Detekcija HIF2 Western blotom nije bila uspješna u ovoj studiji; nismo mogli detektirati HIF2 pojas na oko 115 kDa, čak ni upotrebom sc-46691, sc-13596, Ab8365 i NB100-122.

4. Materijali i metode

4.1.Materijali i životinje

Korišteni su mužjaci Sprague-Dawley štakora (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) i C57BL/6J miševi (Charles River Japan, Yokohama, Japan). Štakorima je dano 1 ili 10 mg/kg ATI (A1 i A10, redom), a miševima je dano 5 mg/kg ATII intraperitonealnom injekcijom. Kontrolnoj skupini ubrizgana je fiziološka otopina. Nakon 4 sata, štakorima je ubrizgan miješani anestetik (0.3 mg/kg medetomidina, 40 mg/kg midazolama i 5,0 mg/kg butorfanola), a krv je uzeti iz trbušne aorte. Bubrezi i jetra su secirani nakon perfuzije 20 mL PBS-a u trbušnu aortu. U nekim pokusima, rezovi bubrega inkubirani su u kolagenazi (tip 1, C-0130; Sigma-Aldrich, Burlington, NJ, SAD) i ribonukleozid vanadil kompleksima (R-3380; Sigma-Aldrich) 20 minuta , a PCT i MAL su mikrodisecirani, kao što je prethodno opisano [7]. Mikrodisecirani PCT ili MAL su inkubirani s ATI ili nosačem 2 h na 37 stupnjeva. Miševi su anestezirani s 1,5 posto izoflurana u 30 posto O2 (mješavina 100 posto O i zraka) nakon 2,4 i 6 sati. Bubrezi su brzo izvađeni i uzdužno prerezani. Glavni dijelovi bubrega fiksirani su uranjanjem u ledeno hladan 4 posto paraformaldehid/0,1 M fosfatni pufer preko noći i obrađeni u parafinu za histološku analizu.

Naše protokole provjerilo je i odobrilo Institucionalno etičko povjerenstvo Medicinskog centra Sveučilišta Kitasato (2018032, 2019029) i Medicinskog fakulteta Sveučilišta Kitasato (2019-141).

4.2. PCR u stvarnom vremenu

RNA je ekstrahirana iz bubrega, jetre i mikrodiseciranih PCT ili MAL pomoću Qiacube i RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Venlo, Nizozemska), kao što je prethodno opisano [5]. cDNA je sintetizirana korištenjem Takara PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (6210; Takara, Otsu, Japan). PCR u stvarnom vremenu proveden je pomoću sondi tvrtke Applied Biosystems (GAPDH Rn01775763 g1, Epo Rn00667869 m1.HIF2 Rn00576515 m1. HIFla Rn01472831 m1, PHD2 Rn00710295 m1; Waltham, MA, SAD) i Premix Ex Taq (RP39LR; Takara).mRNA ekspresija. u kontrolnih i ATII štakora uspoređeni su pomoću AACT.

4.3. Hibridizacija in situ

ISH je izveden, kao što je prethodno opisano [5,27]. Ukratko, ukupna RNA iz mišjih bubrega (636612; BDBioscieces Clontech) je obrnuto transkribirana s RNA PCR kompletom (AMV), ver. 3.0 (RR019; Takara), i cRNA sonda za Epo (GenBank pristupni br. NM 007942).HIF2 (GenBank pristupni broj br. NM 010137), ili PHD2 (GenBank pristupni br. NM_053207) generiran je s PCR početnicama s repom regije promotora T7. Hibridizirane sekcije su sukcesivno tretirane s 0,1 posto avidinom, 0,01 posto otopinom biotina, 0,5 posto kazein/TBS, ovčjim anti-DIG F (ab') fragment antitijelima konjugiranim peroksidazom hrena (HRP) (11207733910; Roche Diagnostics, Basel, Švicarska) .biotinilirana otopina tiramida i HRP-konjugirani streptavidin (P0397; DakoCytomation, Glostrup, Danska). Sekcije su obojene upotrebom DAB tekućeg sustava (BSB 0016: Bio SB.Santa Barbara.CA, SAD) i Mayerovim hematoksilinom (30002; Muto Pure Chemicals, Tokio, Japan).

4.4. Imunohistokemija

Dijelovi bubrega imunološki su obojeni, kao što je prethodno opisano [7,28]. Ukratko, presjeci su blokirani s 5 posto normalnog kozjeg seruma i reagirali su sa zečjim poliklonskim anti-humanim Epo antitijelom (sc-7956,1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD), nakon čega je slijedio Histofine Jednostavna boja MAX-PO (414341F; Nichirei Bioscience, Tokio, Japan). Sekcije su obojene upotrebom DAB tekućeg sustava i obojene Mayerovim hematoksilinom.

Slike su dobivene pomoću optičkog mikroskopa (Axioplan 2; Carl Zeiss, oberkochen, Njemačka) s digitalnom kamerom (AxioCam MRcb; Carl Zeiss). Snimljene slike analizirane su pomoću sustava za analizu slike (AxioVision Rel.4.6; Carl Zeiss).

4.5. Western blotting analiza s deglikozilacijom

Western blotting analiza je provedena, kao što je prethodno opisano [4,6,7]. Protein je sakupljen iz bubrežnog korteksa i jetre pomoću CelLytic MT(C-3228; Sigma-Aldrich) i korišten za Western blotting. Uzorci bubrega i jetre su deglikozilirani pomoću N-glikozidaze F（PNGase,4450; Takara, kao što je prethodno opisano. Ukratko, 1 μL 10 postotnog SDS-a dodan je u 10 μL uzoraka bubrega ili jetre i kuhan 3 minute. Zatim je dodano 11 uL 2x stabilizirajućeg pufera i uzorci su vorteksirani. Nakon dodatka 1-2 μL PBS-a ili PNGase, uzorci su inkubirani u vodenoj kupelji 20 sati na 37 stupnjeva. Nakon inkubacije, uzorci su centrifugirani, a supernatant je sakupljen i korišten za SDS-PAGE (10-20 postotni gradijent gela: Cosmo Bio No, 414893. Tokio. Japan). 2× stabilizirajući pufer sadržavao je 125 mM Tris- HCl (pH 8,6), 48 mMEDTA, 4 posto Nonidet P-40 i 8 posto 2-merkaptoetanola. Rekombinantni ljudski Epo (rhEpo, 587102; BioLegend, San Diego, CA, SAD) korišten je kao pozitivna kontrola. Nakon SDS-PAGE, proteini su preneseni na PVDF membranu (Immobilon-P; IPVH00010: Merck Millipore, Burlington.NI.USA) sa 120 mA tijekom 60-90 min. Membrana je blokirana 5 posto obranim mlijekom (Morinaga, Japan) 60 minuta i inkubirana s antitijelom protiv Epo (sc-5290, 1:500; Santa Cruz Biotechnology) 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, membrana je inkubirana sa sekundarnim protutijelom (kozji anti-mišji IgG(H plus L); 115-035-166, 1:5000; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, SAD) 60 minuta. Trake su vizualizirane pomoću ECL Select Western Blotting Detection System (RPN2235; GE Healthcare Bio-Science AB, Chicago, IL, SAD) i LAS4000 (Fujifilm, Tokyo, Japan).

4.6. Mjerenja koncentracije Epo u plazmi

Plazma je sakupljena od kontrolnih i ATI-tretiranih štakora 4 sata nakon peritonealne injekcije. Koncentracije EPO u plazmi izmjerene su pomoću CLEIA (SRL, Tokio, Japan) koristeći Access Epo Beckman Coulter (Brea, CA, SAD).

4.7. Plazma E

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Statistička značajnost provedena je korištenjem Excel Statistics (BellCurve, Tokyo, Japan). Statistička značajnost analizirana je f-testom ili neparametarskom analizom Kruskal-Wallisovim testom i višestrukim usporedbama Shirley-Williamsovim testom. p-vrijednosti<0.05 were="" considered="" statistically="">

effects of cistanches：improve kidney function

5. Zaključci

Zaključno, naša studija pokazuje da ATII povećava ekspresiju Epo mRNA i proteina u proksimalnim i distalnim bubrežnim tubulima. U kombinaciji s našim prethodnim studijama, proizvodnju Epoa u bubrezima u bazalnim uvjetima regulira sustav renin-angiotenzin-aldosteron.




Mogli biste i voljeti