HPLC otisak prsta i odnos spektra i antitumorskog učinka za diskriminaciju između Mylabris Phalerata Pallas i Mylabris Cichorii Linnaeus

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Farmaceutski fakultet, Medicinsko sveučilište Zunyi, Zunyi, Kina,

2 Ključni laboratorij za osnovnu farmakologiju Ministarstva obrazovanja i Zajednički međunarodni istraživački laboratorij etnomedicine Ministarstva obrazovanja, Medicinsko sveučilište Zunyi, Zunyi, Guizhou, Kina.

3 Škola temeljnih medicinskih znanosti, Medicinsko sveučilište Zunyi, Zunyi, Kina, 4 Ključni laboratorij za prevenciju i liječenje tumora posebnim lijekovima sa sjedištem na Provincijskom fakultetu u Guizhou, Medicinsko sveučilište Zunyi, Zunyi, Kina.

Kliknite ovdje za više informacija o Cistanche anti-tumor

Naglasci

Ova studija pruža primjenjivu, vjerodostojnu i učinkovitiju HPLC metodu za razlikovanje dviju vrsta Mylabrisa. A HPLC otisak prsta i spektar-antitumorske učinkeintegrirani su i pronađena su tri važna diferencijalna markera za novi marker Mylabrisa.

Sažetak

Cilj: Procjena diskriminacije između dvije vrste Mylabris na temelju HPLC otiska prsta i spektraantitumorski učinakodnos. Metode: U ovoj studiji, jednostavna i učinkovita metoda tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) koja se integrira s kemometrijskom analizom i spektralnimantitumorski učinakodnos je razvijen za razlikovanje između dvije vrste Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Rezultati: U analizi otiska prsta odabrano je 14 karakterističnih vrhova za procjenu razlika između MP i MC pomoću analize sličnosti i prepoznavanja uzoraka pomoću PCA i OPLS-DA. HPLC kromatogrami uzoraka iz 10 regija Kine pokazali su razlike između MP i MC, a pronađeno je 7 karakterističnih kemijskih markera. U spektru-antitumorski učinakanalizom odnosa, 4 markera aktivnosti igrala su vitalnu ulogu u smanjenju IC50 i mogli bi biti antitumorske komponente Mylabrisa prema sivoj relacijskoj analizi i multivarijatnoj linearnoj regresijskoj analizi. Kemometrijska analiza u kombinaciji s rezultatima odnosa spektar-učinak pokazala je da su vrhovi 2 (citozin), 4 (nepoznato) i 14 (nepoznato) važni diferencijalni markeri za razlikovanje dviju vrsta Mylabrisa.

Zaključak: Metoda je primjenjiva, vjerodostojna i učinkovitija za razlikovanje MP i MC, te će ponuditi novi način za olakšavanje kontrole kvalitete lijekova protiv insekata.

Ključne riječi: HPLC, otisak prsta, spektar-antitumorski učinak, Mylabris, Diskriminacija

Pozadina

Mylabris, koji se u Kini naziva ban mao, koristio se kao tradicionalna kineska medicina (TCM) za liječenje čira, duboko ukorijenjenih čireva, abdominalne mase i važan jeantitumorskiagent. Osim toga, naširoko se koristi u Europi kao narodni lijek [1]. Glavni aktivni sastojak Mylabrisa je kantaridin, koji je učinkovitprotutumorskispoj [2]. Suvremene farmakološke studije pokazale su da Mylabris ima višestruko djelovanje, te je vrlo cijenjen za liječenje tumora zbog svoje dvojneprotiv rakasvojstva i sposobnost povećanja broja leukocita [3-4]. Trenutačno se Mylabris naširoko koristi u nekim kliničkim receptima TCM-a protiv karcinoma u Kini, kao što su Aidi injekcija i Compound ban mao kapsula.

Prema Farmakopeji Narodne Republike Kine (verzija iz 2015.), Mylabris je definiran kao osušeno tijelo Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC), koje se razlikuju po svojim botaničkim karakteristikama, dinamici populacije i ekologiji [ 5-6]. Mylabris je također vrlo toksičan lijek. Budući da su lijekovi dostupni u Kini obično mješavina MP i MC, potrebno je identificirati kemijske razlike i razlike u djelovanju između dviju vrsta.

Budući da TCM sadrže brojne poznate i nepoznate sastojke, kvantitativna analiza profila njihovih kemijskih sastojaka predstavlja značajan izazov. Otisak prsta visokoučinkovite tekućinske kromatografije (HPLC) igra važnu ulogu u kontroli kvalitete (QC) TCM-a zbog njegovih ukupnih karakteristika profila većine spojeva u složenom sustavu. Nadalje, analiza otisaka prstiju TCM-a ima dobru ponovljivost i stabilnost za autentifikaciju vrsta i procjenu kvalitete, a prihvaćaju je Svjetska zdravstvena organizacija, Državna agencija za hranu i lijekove Kine (SFDA) i Europska agencija za procjenu lijekova (EMEA). Nedavno je razvijena kemometrijska analiza koja kombinira HPLC otisak prsta za QC i razlikuje različite složene prirodne izvore [7]. Međutim, neučinkovito je razlikovati razlike u TCM-u jer ne može odražavati razlike u aktivnim sastojcima, što je važnije za kliničku upotrebu. Do sada, spektar-antitumorski posljedicapristupi odnosa korišteni su za uspješno identificiranje bioaktivnih sastojaka TCM-a [8]. HPLC otisak prsta u kombinaciji s kemometrijskom analizom i odnosom spektra i antitumorskog učinka bolje će razjasniti razliku između višestrukih izvora TCM-a.

Nedavno su objavljene neke metode za određivanje sadržaja kantaridina, koje se mogu koristiti za određivanje kvalitete Mylabrisa [9]. Neki kromatografski otisci prstiju također su primijenjeni za QC [10-11]. Samo je jedna studija koristila metodu koja uključuje gradijentnu eluciju u vodi topivih spojeva Mylabrisa na temelju HPLC-a. U međuvremenu je korišteno samo deset uzoraka, a nijedan MC uzorak [12]. Koliko nam je poznato, razlikovanje MP i MC na temelju kemijskog sastava i aktivnosti nije dosad proučavano.

Ova je studija imala za cilj razviti jednostavnu i učinkovitu metodu za razlikovanje dviju vrsta Mylabrisa korištenjem HPLC otiska prsta u kombinaciji s kemometrijskom analizom i spektralnimantitumorskiposljedicaodnos, koji će pružiti osnovu za QC Mylabrisa. Ova se metoda također može primijeniti za identifikaciju QC markera drugih TCM-ova.

Materijali i metode

Ukupno je 20 serija Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC) prikupljeno iz različitih provincija Kine (Tablica 1) i identificirao ih je naš profesor Xiao-Fei Li. Uzorci vaučera pohranjeni su u našim laboratorijima.

Referentni standardni citozin, uridin, gvanozin i adenozin nabavljeni su od ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Acetonitril i metanol kvalitete za HPLC kupljeni su od Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, SAD). Tijekom istraživanja korištena je Watsonova čista voda. Ostale kemikalije i otapala bili su analitičkog stupnja i dobiveni od Aladdin Reagent (Šangaj, Kina), Chengdu Kelong Reagent (Chengdu, Kina) i Sinopharm Chemical Reagent (Peking, Kina)

Aparatura i kromatografski uvjeti

HPLC analiza je provedena korištenjem Agilent 1260 Infinity HPLC sustava na 30 stupnja na Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) za otisak prsta. Ispiranje linearnim gradijentom s eluentima A (voda/ledena octena kiselina, 100:1, v/v) i B (metanol) korišteno je za odvajanje. Program gradijenta razvijen je na sljedeći način: 0-1 min, 3.0-4.6 posto B; 1-9 min, 4.6-6.8 posto B; 9-25 min, 6.8-51.0 posto B; 25-30 min, 51.0-100 posto . Brzina protoka mobilne faze bila je 1,0 mL/min. Kromatogram je praćen na 254 nm. Nakon perioda uspostavljanja ravnoteže od 15 minuta, 10 μL uzoraka korišteno je za injekciju.

Priprema uzorka

Osušeni uzorci usitnjeni su u prah, a 2,5 g svakog praškastog uzorka ekstrahirano je dva puta s 50 mL 75-postotnog etanola refluksom 1,5 sat svaki put. Ekstrahirani uzorak je pomiješan i koncentriran pod smanjenim tlakom do 20 mL. Smjesa je zatim taložena s 80 mL vode 24 sata na 4 stupnja. Nakon toga, ekstrakt je centrifugiran na 3000 g min-1 tijekom 10 minuta kako bi se odvojio supernatant. Supernatant je koncentriran pod smanjenim tlakom do 25 mL. Na kraju, supernatant je filtriran kroz Millipore film od 0,22 µm prije HPLC analize.

Validacija metodologije

HPLC metoda potvrđena je za preciznost, ponovljivost i stabilnost (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). Validacija je procijenjena na temelju vremena zadržavanja (RT) i površine vrha (PA). Konačno, utvrđeni su kemijski otisci 20 serija Mylabrisa kako bi se identificirale integrirane kemijske karakteristike više spojeva. Neke kemometrijske tehnike uvedene su na kemijski otisak prsta za analizu.

Analiza prepoznavanja uzoraka

Statistička značajnost razlika između dviju vrsta područja vrhova procijenjena je nesparenim Studentovim t-testom. P-vrijednost manja od 0.05 smatrala se statistički značajnom. Kao klasična nenadzirana metoda, analiza glavnih komponenti (PCA) široko se primjenjuje za statističku analizu podataka. Umjesto upotrebe mnogih varijabli, PCA uzima mali broj računala bez gubitka puno informacija, a bodovni dijagrami se zatim vizualiziraju radi slobodnog odvajanja opažanja. U ovoj studiji, PCA je proveden na normaliziranim površinama vrhova svake komponente u HPLC otiscima pomoću softvera SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Švedska) kako bi se utvrdila razlika između dviju vrsta Mylabrisa.

Za poželjniju diskriminaciju između dviju vrsta Mylabris, primijenjena je nadzirana metoda ortogonalne djelomične diskriminantne analize najmanjih kvadrata (OPLS-DA) za analizu razlika u normaliziranim područjima vrhova svake komponente u HPLC otiscima. VIP vrijednost je ponderirani zbroj kvadrata OPLS težina, koji odražava relativni doprinos svake X varijable modelu. Smatra se da su varijable s VIP > 1, zajedno sa S-plotom, utjecajne za odvajanje uzoraka u bodovnim dijagramima generiranim iz OPLS-DA analize. Zatim su dobiveni karakteristični kemijski markeri za razlikovanje.

Analiza odnosa spektar-antitumorski učinak

Za istraživanjeprotutumorskipodručje vrha učinka za Mylabris uzorke integrirane s podacima o otiscima prstiju i usporedite razlike između dviju vrsta, korelaciju između vrha otiska prsta ianti-tumoručinci su proučavani. SPSS19.0 (IBM, SAD) i GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Kina) primijenile su dvije metode kombiniranja sive relacijske analize i multivarijatne linearne regresijske analize (MLRA). Theanti-tumortest proveden našim objavljenim metodama [12], stanice HepG2 linije stanica humanog hepatocelularnog karcinoma održavane su u mediju RPMI1640 s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma. Stanice su uzgajane u vlažnoj atmosferi koja je sadržavala 5 posto CO2 na 37 C. Za procjenu proliferacije korištena je SRB metodaanti-tumoraktivnosti, zatim je izračunat IC50 HepG2 stanica, konačno, IC50 i normalizirana područja vrhova korišteni su za kemometrijsku analizu. Zatim su dobiveni karakteristični markeri aktivnosti Mylabrisa.

Rezultati i rasprava

Optimizacija uvjeta ekstrakcije

Za dostatnu ekstrakciju spojeva otopljenih u vodi iz Mylabrisa, sustav ekstrakcije je optimiziran. Ultrazvuk i refluksiranje pokazali su da se ti spojevi mogu optimalno ekstrahirati refluksiranjem.

Optimizacija HPLC metode

Kako bi se dobili maksimalni kromatografski vrhovi za opisivanje cjelokupne značajke biljke, ispitan je sastav kromatografskog stupca, mobilne faze i valne duljine detekcije (200, 254, 265 i 278 nm). Rezultati su pokazali da su kolona Phenimenex Synergy Polar-RP80, voda (koja sadrži 1 posto ledene octene kiseline) i metanol, te 254 nm bili najbolji uvjeti za Mylabris HPLC analizu (slika 1), struktura 4 standardne tvari prikazana je na slici 2. .

Validacija metode

U ovoj studiji, 14 vrhova je dobro odvojeno i korišteno kao "zajednički vrhovi". Preciznost, ponovljivost i stabilnost temeljene su na vremenu zadržavanja (RT) i površini vrha (PA). RSD vrijednosti RT i PA za preciznost (n=6) nisu premašile 0.2 odnosno 4 posto; RSD vrijednosti RA i PA za ponovljivost (n=6) bile su ispod 0.2 odnosno 4 posto, a RSD vrijednosti za stabilnost (0-24 h) bile su manje od { {10}}.4 odnosno 5 posto, što ukazuje da su uzorci bili stabilni unutar 24 sata. Ovi rezultati pokazuju da je kvaliteta ispitivanih uzoraka i HPLC metoda stabilna i dobro kontrolirana.

Procjena sličnosti otiska prsta

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 osim MC uzoraka (iz Guizhou2 i Guizhou4), čije su sličnosti bile 0.888 odnosno 0.887. Ovi podaci pokazuju da je kvaliteta Mylabrisa unutar jedne vrste bila stabilna. Međutim, sličnosti samo tri MP uzorka u usporedbi s referentnim HPLC otiskom bile su > 0.930; a sličnosti samo dva MC uzorka u usporedbi s referentnim HPLC otiskom bile su > 0,921. Ovi rezultati su pokazali da dvije vrste Mylabrisa imaju značajne varijacije u nekim područjima vrha.

Diskriminacija MP i MC analizom prepoznavanja uzoraka

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, vrhovi 1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14 mogli bi biti najznačajnije varijable u razlikovanju dviju vrsta (Slika 6). Grupa vrhova (1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14) može imati vitalnu ulogu u razlikovanju između MP i MC kao karakterističnih kemijskih markera.

Odnos spektar-učinak sivom relacijskom analizom

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Odnos spektar-učinak prema MLRA

MLRA model je najčešća metoda modeliranja za određivanje složenosti odnosa između dvije ili više varijabli i odgovora koji je izgrađen sljedećom formulom

Gdje je Y procijenjena vrijednost i predstavlja odgovor; Xn je nezavisna varijabla, b{{0}} je presjek, a bn je regresijski koeficijent za Xn. U ovoj studiji, MLRA je primijenjen kako bi se utvrdio odnos između otisaka prstiju i učinkovitosti između vrijednosti područja vrhova u HPLC otiscima prstiju i IC50 anti-HepG2, a zatim su se pronašle moguće antitumorske komponente. Kolineacija podataka pronađena je uobičajenim MLRA modelom, koji nije prikladan za istraživanje korelacije između Y (IC50) i X (PA). PCA MLRA model korišten je za proučavanje odnosa otisaka prstiju i učinka, a za analizu je odabrano prvih šest osobnih računala s kumulativnom stopom doprinosa varijance: 91,068 posto. Konačno, sljedeća jednadžba je uspostavljena prema izlazu SPSS-a i računalima: IC50=1.115864 plus （ 1.87268PA1- 699.722PA2 plus 25.7138PA3 - 24.1528PA4 plus 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 plus 2.95283PA7- 15.5305PA8 plus 13.0297PA9 plus 22.5683PA10 - 10.3462PA11 plus 123.762PA12 plus 31.0428PA13 - 10.702PA14) ×10-6. (R je bio 0,682, P <>

Integrirajuća analiza dviju vrsta Mylabrisa

Eksperiment je pokazao da se HPLC otisak može koristiti za odraz kemijskih karakteristika Mylabrisa. Algoritmi sličnosti, PCA i OPLS-DA primijenjeni su kako bi se utvrdila razlika između MC i MP. Grupa vršnih vrijednosti (1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14) definirana je kao karakteristični kemijski markeri.

Osim toga, i GRA i MLRA su se pokazale kao zadovoljavajuće metode za daljnju diskriminaciju. Integrirajući rezultate analize GRA i MLRA, vrhovi 2, 4 i 14 kao markeri aktivnosti Mylabrisa trebali bi biti odgovorni za antitumorski učinak, što bi mogla biti osnova farmakodinamičkog materijala Mylabrisa.

Važni diferencijalni markeri definirani su za vrh s karakterističnim svojstvima markera kemijske aktivnosti i aktivnosti. Dakle, između MC i MP na HPLC otiscima nakon analize odnosa spektra i učinka, vrhovi 2 (citozin), 4 (nepoznato) i 14 (nepoznato) bili su važni diferencijalni markeri za razlike između MP i MC kao što je prikazano na slici 7.

Zaključak

Konačno, u ovom istraživanju predložena je HPLC metoda za kemijski otisak MP i MC. Kombinacijom HPLC otiska prsta, PCA i analize odnosa spektra i učinka kao što su GAS i MLRA, kemijska i farmakološka svojstva dviju bliskih vrsta Mylabrisa mogu se razlikovati. To je pokazalo da spojevi iz vrhova 2 (citozin), 4 (nepoznato) i 14 (nepoznato) kao važni diferencijalni markeri igraju dominantnu ulogu u razlikovanju između MP i MC. Struktura vrhova 4 i 14 trebala bi se identificirati drugom tehnologijom. Metoda HPLC otiska prsta u kombinaciji sa statističkom, kemometrijskom analizom i analizom odnosa spektar-učinak pokazala se učinkovitom u otkrivanju komponenti markera ili za promicanje QC-abiljni lijekovi.

Reference

1 Wang GS. Medicinska upotreba Mylabrisa u drevnoj Kini i novije studije. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, et al. Određivanje sadržaja kantaridina i njegov inhibitorni učinak na HepG2 stanice humanog hepatoma. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, et al. Acyl-CoA: inhibitorne aktivnosti kolesterol aciltransferaze amida masnih kiselina izoliranih iz Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Day RM, Harbord M, Forbes A, et al. Kantaridin mjehurići: tehnika za ispitivanje prometa leukocita i proizvodnje citokina na mjestima upale kod ljudi. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Studija o preferiranoj hrani odraslih Mylabris phalerata u različitim geografskim populacijama. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Biološka svojstva meloidae i njihova umjetna ishrana. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Kvantitativna analiza u kombinaciji s tehnologijom otiska prsta i kemometrijskom analizom primijenjena za procjenu šest vrsta divljeg parisa pomoću UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, et al. Praćenje i procjena konzistencije kvalitete tableta spoja bizmut aluminata jednostavnom metodom kvantificiranog omjera otiska prsta u kombinaciji s istodobnim određivanjem pet spojeva i u korelaciji s antioksidativnim aktivnostima. Plos One 2015.; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analiza kantaridina u lažnih mjehuraša (Coleoptera: Oedemeridae) mikroekstrakcijom u čvrstoj fazi i plinskom kromatografijom-masenom spektrometrijom. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Studija GC otisaka Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010.; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX i Shi XF. HPCE digitalizirao otiske prstiju Mylabrisa. Central South Pharmacy (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX i Wang, Z. Studija o digitaliziranim HPLC otiscima Mylabrisa. Kineski časopis za farmaceutsku analizu (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Anti-humani hepatocelularni karcinom HepG 2 aktivnost kantaridina dobivenog iz provincije Guizhou i okolnih regija. Časopis za modernu medicinu i zdravlje (Chin) 2016.; 32(5): 648-650.