Kako transformirajući faktor rasta B1 (TGF 1) utječe na fibrozu bubrega
Mar 18, 2022
za više informacija:ali.ma@wecistanche.com
Inhibicija signaliziranja transformirajućeg čimbenika rasta b1 u rezidentnim intersticijskim stanicama smanjuje ekspresiju profibrotičnog gena i čuva proizvodnju eritropoetina tijekom eksperimentalne fibroze bubrega u miševa
Michaela AA Fuchs, Katharina AE Broeker & et al.
Fibroza bubregakarakteriziran je razvojem miofibroblasta koji potječu iz rezidentnih bubrega i imigracijskih stanica. Stvaranje miofibroblasta i proizvodnja izvanstaničnog matriksa tijekom oštećenja bubrega pokreću različiti citokini. Između ovih,transformirajući faktor rasta B1(TGF 1) smatra se središnjim okidačem zafibroza bubrega. Našli smo visoko reguliranu ekspresiju TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i TGF receptor 2(TGF-R2) mRNA u intersticijskim stanicama bubrega u eksperimentalnimfibroza. Ovdje smo istražili doprinos TGF 1(transformirajući faktor rasta B1) signaliziranje u rezidentnim intersticijskim stanicama bubrega do fibroze organa korištenjem modela nefropatije izazvane adeninom i jednostrane okluzije uretera u miševa. U tu svrhu TGFB1 signalizacija je prekinuta inducibilnom delecijom TGF-R2 gena u intersticijskim stanicama koje eksprimiraju fibroblastni marker receptor faktora rasta trombocita-B. Ekspresija profibrotskih gena bila je oslabljena do 50 posto u bubrezima bez TGF-R2 u stanicama pozitivnim na receptor B faktora rasta koji potiče iz trombocita. Dodatno, delecija TGF-R2 spriječila je pad proizvodnje eritropoetina u bubrezima povezanim ureterom. Značajno, ekspresija aktina x-glatkog mišića povezana s fibrozom kao markera miofibroblasta i naslage izvanstaničnog kolagena nisu promijenjeni u miševa s ciljanom delecijom TGF-R2. Prema tome, naši nalazi ukazuju na pojačani učinak TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signaliziranje u rezidentnim intersticijskim stanicama koje pridonose ekspresiji profibrotskog gena i smanjenoj regulaciji proizvodnje eritropoetina, ali ne i razvoju miofibroblasta tijekomfibroza bubrega.
Kliknite za zdravstvenu korist cistanche praha kod bolesti bubrega
Razvoj i napredovanjefibroza bubregaje obilježje kronične bubrežne bolesti. Obično se smatra rezultatom povećane proizvodnje i taloženja proteina izvanstaničnog matriksa (ECM) poput kolagena, fibronektina ili tenascina. U tijekufibroza bubregadovodi do progresivnog pada glomerularne i tubularne funkcije i također ograničava endokrine funkcije bubrega što rezultira nedovoljnom proizvodnjom eritropoetina (EPO) što dovodi do anemije.-y
Među citokinima i signalnim čimbenicima koji su uključeni u bubrežnu bolest ifibrozanapredovanje,transformirajući faktor rasta 1(TGF 1) proučavan je u različitim modelima.6.0-1 TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)veže se za TGF receptor 2(TGF -R2). Stvaranje heteromernog kompleksa s TGF receptorom 1 bitno je za intracelularnu aktivaciju SMAD signalne kaskade. i.1-18 U oštećenim bubrezima, povećana ekspresija TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)Zabilježena je mRNA u različitim tipovima bubrežnih stanica.1517,19-2lVažna uloga TGF 1 ububregfibrozatakođer je razlučeno iz nalaza da primjena egzogenog TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)može induciratifibroza bubregai taj TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)antitijela mogu oslabiti eksperimentalno izazvanefibroza,10.22-24Osim toga, genetska delecija Smad2 ili 3, unutarstaničnih efektora za TGF -R2, pokazala je pozitivne učinke na razvojfibroza.1,1
Ekspresija TGF-R2 zabilježena je u mnogim tipovima stanica, čime se ograničava precizna informativna vrijednost nalaza dobivenih općom interferencijom globalnog TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signalizacija. Ovo također može objasniti neka od kontroverznih izvješća posljednjih godina. 1.1.2 TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)također je prijavljeno da promovirabubreg fibrozapojačavanjem infiltracije makrofaga, koji se mogu transdiferencirati u miofibroblaste.
Međutim, središnja uloga TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)ububregfibrozanedavno je osporeno otkrićem dabubregfibrozane smanjuje se blokiranjem TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signaliziranje u stanicama koje aktivno proizvode proteine matriksa. Dobro je utvrđeno da povećana proizvodnja proteina matriksa uglavnom potječe iz miofibroblasta, koji se mogu transdiferencirati iz nekoliko vrsta stanica uključujući fibroblaste, monocite, pericite te tubularne i endotelne stanice.6,10,2-32 Relativni doprinos ovi tipovi stanica populaciji miofibroblasta mogu varirati ovisno o eksperimentalnom modelu. Unatoč tome, sve je veći konsenzus da su rezidentni fibroblasti, periciti i stanice koje potječu iz koštane srži glavni prekursori miofibroblasta u bubregu i pridonosebubregfibrozau sličnom omjeru..102933-35 Rezidentni fibroblasti i periciti izražavaju receptor čimbenika rasta koji potječe od trombocita (PDGFR-) i jedni su od najvećih,31,36. Nedavna studija također je istražila brojne vrste stanica u bubregu. potvrdio je PDGFR-f stanice kao glavne prekursore za miofibroblaste u ljudskim bubrezima. Ove PDGFR-f stanice također uključuju sve stanice bubrega koje mogu proizvoditi EpOs,-9
Bubreg fibrozapovezuje se sa smanjenom sposobnošću bubrega da proizvode EPO.-,3,0 Iako razlozi za to nisu jasno razjašnjeni, smatra se da transformacija intersticijske PDGFR- plus stanice u miofibroblaste ide ruku pod ruku s gubitkom njihove sposobnosti da proizvode EPO. S obzirom na glavnu ulogu intersticijskih PDGFR-B stanica kao nativnih proizvođača EPO i kao prekursora miofibroblasta, zanimalo nas je definirati ulogu TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signalizacije u ovoj staničnoj populaciji.
U tu smo svrhu generirali mišji model s tamoksifenom induciranom delecijom TGF-R2 u PDGFR-plus stanicama (PDGFR-CeERT7 plus TGF-R2/, u daljnjem tekstu TGF-R2ko miševi). Nakon delecije TGF(transformirajući faktor rasta)-R2 u PDGFR- plus stanicama u odraslih miševa, životinje su proučavane u 2 eksperimentalna modelabubregfibroza: unilateralna okluzija uretera (UUO) i nefropatija izazvana adeninom (AN). Nefropatija izazvana adeninom model je kroničnog oštećenja s jakim paralelama s patologijama izazvanim ljudskim kristalima, dok je UUO model akutnog oštećenja za mehanički stres.2933,42- Korištenje visoko specifične metode RNAscope in situ hibridizacije omogućilo je kolokalizaciju ciljne i markerske mRNA sve do rezolucije jedne stanice. U ovim patološkim modelima ispitani su učinci delecije TGFB-R2 u PDGFR-f stanicama na ekspresiju d-aktina glatkih mišića (a-SMA) kao markera za stvaranje miofibroblasta. Nadalje, istraživali smo profibrotičnu ekspresiju gena i taloženje ECM-a. Sposobnost bubrega da proizvode EPO u eksperimentalnim stanjimabubreg fibrozaprocijenjen je mjerenjem razine EPO u plazmi te broja i lokalizacije stanica koje eksprimiraju EPO mRNA u oštećenim bubrezima.
METODE
Životinje
TGF -R2lo miševi stvoreni su križanjem PDGFR-cexr2 miševa (ekspresija Cre rekombinaze inducibilne tamoksifenom pod kontrolom PDGFR-promotora; JAX zaliha #029684) i mic s loxP-frankiranim TGF6- R2 aleli (IAX zaliha #012603) u mješovitoj pozadini C57BJ/6 i 129S1/SvmJ."Za praćenje loze, dvostruki fluorescentni reporter konstruirao je mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute.IGFLm/; JAX zaliha #007676) uzgojena je u TGF -R2ko miševima. Genotipizacija je provedena pomoću početnica navedenih u tablici 1. Srodnici iz legla negativni na Cre korišteni su kao kontrolne životinje. Životinje su držane na standardnoj hrani za glodavce (0,6 posto NaCl; Sniff) sa slobodnim pristup vodi iz slavine Svi pokusi na životinjama izvedeni su u skladu s Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja koji je objavio Nacionalni institut za zdravlje SAD-a i odobrilo lokalno etičko povjerenstvo.
Liječenje tamoksifenom
Cre rekombinacija je izazvana hranjenjem hranom koja je sadržavala 400 mg tamoksifen citrata po kilogramu (A115T00404, Sniff) tijekom 4 tjedna nakon čega je slijedio 3-tjedni period sa standardnom hranom. Ekscizija floksiranog TGF-R2 gena potvrđena je lančanom reakcijom polimeraze,
Nefropatija izazvana adeninom
Izazvan adeninomfibrozaje stvoren u odraslih miševa. Nakon liječenja tamoksifenom i sljedećeg perioda odmora, mužjaci miševa hranjeni su hranom koja je sadržavala adenin (0.2 posto) kontinuirano tijekom 3 tjedna. Eksperimenti su izvedeni nakon točno 3 tjedna (3-tjedan adenina).
In situ hibridizacija putem RNAscope
Lokalizacija ekspresije mRNA proučavana je s kompletom RNAscope Multiplex Fluorescent v2 (Advanced Cell Diagnostics ACD) u skladu s uputama proizvođača. Bubrezi su perfuzijski fiksirani s 10 postotnom neutralnom puferiranom otopinom formalina, dehidrirani u nizu etanola i uklopljeni u parafin. Hibridizacijski signali detektirani su na 5-µm sedicijama tkiva pomoću TSA Plus fluorofora Cy3 i Cy5 (PerkinElmer). Kriške su postavljene s ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i pregledane s Axio Observer Z1 mikroskopom (Zeiss). Pozitivne i negativne kontrole su rutinski priložene. RNAsape sonde navedene su u tablici 2
Tablica 1|Primer sekvence korištene za genotipizaciju miševa
REZULTATI
TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i TGF(transformirajući faktor rasta)Ekspresija -R2 u intersticijskim stanicama pojačana je tijekom eksperimentalne bolesti bubrega
Lokalizacija ekspresije mRNA TGFB1 i TGFB-R2 u bubregu u bazalnim uvjetima i tijekom eksperimentalnogfibrozaizvedena je RNAscope in situ hibridizacijom. Pod bazalnim uvjetima, ekspresija mRNA TGFB-R2 otkrivena je u tubulointersticijskim PDGFR-B stanicama u svim zonama bubrega i u glomerularnim mezangijalnim stanicama (Slika 1, lijevo). TGF-R2 također je otkriven u proksimalnim tubulima; ekspresija u drugim tubularnim segmentima bila je niža (dopunske slike S1 i S2).
Tablica 2|RNAscope sonde koje se koriste za in situ hibridizaciju
TGFb1(transformirajući faktor rasta B1)mRNA je lokalizirana u intersticijskim PDGFR-bþ stanicama u svim zonama bubrega i u glomerularnim mezangijskim stanicama (Slika 1). Čini se da su tubuli negativni na TGFb1 mRNA. Ovo implicira PDGFR- plus stanice kao glavno mjesto ekspresije za TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)u bubregu u bazalnim uvjetima.
Tablica 3|Prajmer sekvence koje se koriste za kvantitativnu lančanu reakciju polimerazom
Nakon 3 tjedna na adeninskoj dijeti (AN) ili 5-dnevnom UUO, bubrežni TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i razine ekspresije mRNA TGF-R2 bile su snažno povećane u kontrolnih miševa (Slika 2).
Povećana ekspresija TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i TGF -R2 nakon što je AN ili UUO lokaliziran RNAscope. Kroz kolokalizaciju markera specifičnih za stanični tip, mogli smo identificirati tipove bubrežnih stanica koje pokazuju pojačanu regulaciju TGF -R2 tijekom oštećenja bubrega (Slika 3; Dodatne slike S2 i S3). U AN, ekspresija mRNA TGF -R2 bila je snažno povećana u intersticijalnom PDGFR- plus stanice u fibrotičnim područjima (Slika 3a). Oštećeni tubuli s povišenom ekspresijom TGF-R2 pojavili su se sa spljoštenim epitelom i bili su okruženi PDGFR-plus stanicama s jakim TGF-R2 i TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)mRNA signali (Slika 3a i c, strelice; Dodatna slika S2). Tubuli s povećanim TGF-R2 signalima pokazali su de novo TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)Ekspresija mRNA (Slika 3c; Dodatna slika S3).
U UUO bubrezima, povećani signali za TGF -R2 mRNA otkriveni su u intersticijskim stanicama preostale vanjske medule (Slika 3b) i korteksa (Dopunska slika S2). Ove PDGFR-plus stanice također su pokazale povećane signale za TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)(Slika 3d).
Ukratko, ovi nalazi ukazuju na snažnu aktivaciju TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signaliziranje između intersticijskih PDGFR- plus stanica i oštećenih tubula tijekom eksperimentalnog oštećenja bubrega.
Slika 1|Bazalna ekspresija (lijevo) transformirajućeg faktora rasta b receptora 2 (TGFb-R2) i (desno) transformirajućeg faktora rasta b1 (TGFb1) mRNA na dijelovima bubrega divljeg tipa miševa.
Inducibilna delecija TGF-R2 u PDGFR- plus stanicama smanjuje ekspresiju profibrotičnog gena tijekom eksperimentalne bolesti bubrega
Za analizu relevantnosti TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signalizaciju za funkciju PDGFR-plus stanica, ispitali smo odrasle TGF-R2ko miševe. Bazalna ekspresija TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)bio je nepromijenjen nakon brisanja TGF-R2 u intersticijskim stanicama bubrega (Slika 2). Ekspresija TGF -R2 mRNA bila je značajno smanjena u nokautiranih životinja (Slika 2). Preostala ekspresija nastala je zbog tubularne ekspresije TGF-R2 (Slika 1). Morfologija bubrega nije bila drugačija u TGF-R2ko miševa do 8 tjedana nakon brisanja TGF-R2.
Uočeno povećanje ekspresije TGF-R2 tijekom AN i UUO bilo je značajno smanjeno u TGF-R2ko bubrezima u usporedbi s kontrolnim bubrezima (Slika 2). TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)ekspresija je značajno smanjena tek nakon AN.
Histološka studija fosforiliranog SMAD3 pokazala je smanjenu translokaciju faktora transkripcije u jezgru a-SMAþ intersticijskih stanica u TGFb-R2ko životinja, što ukazuje na poremećenu TGFb1 signalizaciju nakon uspješnog Cre posredovanog brisanja TGFb-R2 (Slika 4).
Slika 2|Obilje mRNA transformirajućeg faktora rasta b1 (TGFb1) i TGFb receptora 2 (TGFb-R2) u kontrolnim bubrezima i bubrezima s tamoksifenom induciranom delecijom TGFb-R2 u stanicama pozitivnim na receptor b faktora rasta izvedenog iz trombocita (TGFb-R2ko) pod bazalnim i patološka stanja.
Inducibilna delecija TGFb-R2 u PDGFR-bD stanicama smanjuje ekspresiju profibrotičnog gena tijekom eksperimentalne bolesti bubrega
Tijekomfibroza, proizvodnja komponenti matriksa je pojačana, što dovodi do opsežnog taloženja ECM-a i stvaranja ožiljaka. Za procjenu moguće uloge TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signaliziranja u rezidentnim PDGFR-Bf stanicama za proizvodnju matriksa, usporedili smo ekspresiju gena fibroznih markera između kontrolnih i TGF-R2ko miševa.
Hranjenje adeninom i UUO doveli su do -25-strukog povećanja Collal mRNA u kontrolnim bubrezima. Dok su u TGF -R2ko bubrezima, povećanja Collar mRNA smanjena za -50 posto u usporedbi s kontrolama (Slika 5). Hranjenje adeninom i UUO također su doveli do značajnog povećanja mRNA kolagena 3al i fibronektina. Povećanje obje mRNA također je značajno oslabljeno u TGF-R2ko bubrezima.
KLIKNITE OVDJE ZA DIO Ⅱ
REFERENCE
1. Schimdf C. Duffield JS.Mehanizmi odfibroza: roka pericita. Curr Opin Nephrol Hoertens.2011:20297-305.
2. Neelisetty S, Aford C Reynalds K, et al. Bubrežnafibrozane smanjuje se blokiranjem signalizacije transformirajućeg faktora rasta u intersticijskim stanicama koje proizvode matriks. Kidney Int. 201588:503-514.
3. Bülow RD, Boor P. Ekstracelularna matrica ufibroza bubrega: više od same skele. J Histochem Cytochem. 2019;67643-661.
4. Humphreys BD.Mehanizmi bubrežne fibroze.Annu Rey PhysioL201880: 309-326.
5. Maxwell PH, Ferguson DJP, Nicholls LG, et al. Intersticijski odgovor na ozljedu bubrega Stanice slične fibroblastima pokazuju fenotipske promjene i imaju smanjeni potencijal za ekspresiju gena eritropoetina. Kidney Int. 1997;52.715-724.
6. Souma T, Yamazaki S, MoriguchiT, et al. Plastičnost bubrežnih stanica koje proizvode eritropoetin upravljafibroza. J Am Soc Nephrol, 2013;24:1599-1616.
7. Babit 儿L, Lin HY. Mehanizmi anemije u CKD.JAm Soc Nephrol. 2012:23:1631-1634.
8. Eschbach JW, Adamson JW. Anemija završne faze bubrežne bolesti (ESRD). Kidney Int. 1985;28:1-5.
9. Broeker KAE, Fuchs MAA, Schrank J, et al. Različite subpopulacije intersticijske stanice bubrega proizvode eritropoetin i faktore koji podržavaju oksigenaciju tkiva kao odgovor na hipoksiju u Vivo.Kidney Int. 2020;98:918-931.
10. Falke LL, Gholizadeh S, Goldschmedinq R et al Različito porijeklo miofibroblasta – implikacije zafibroza bubrega. Nat Rey Nephrol. 2015;11:233-244.
Napomena: gore navedeno nije potpuni popis referenci
