Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Poboljšanje proizvodnje feniletanoidnih glikozida uz pomoć gljivičnog elicitora u kulturi stanične suspenzije Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-guo Mei²

Ključne riječi Cistanche deserticola, izazivač gljivica,feniletanoidni glikozid, kultura biljnih stanica

Sažetak
Kada se 15. dana rasta pojavi elicitor izFusarium solanidodano je 40 mg l^-1 doCistanche deserticolastanične suspenzijske kulture, sadržaj ehinakozida, akteozida i ukupnofeniletanoidni glikozidi(PeGs) u kultiviranim stanicama svi su porasli tijekom sljedećih 27 dana za preko 100 posto na 15 mg g^-1suha težina, 9 mg g-1 suha težina i 57 mg g^-1 suhe mase, respektivno. Konačna biomasa (1,3 mg suhe mase ml^-1) nije zahvaćeno.

Cistanche deserticola

Uvod

Cistanche deserticolamama (Orobanchaceae), autohtona biljka iz Kine naširoko se koristi u tradicionalnoj medicini za različite tretmane, uključujući upotrebu kao sedativ ili pojačivač imunološkog odgovora (Hsu i sur. 1995., Chang i sur. 1995.).Feniletanoidni glikozidi(PeG) su glavni bioaktivni metaboliti uCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) i sastoje se od mnogih komponenti kao što su ehinakozid, akteozid, cizakteozid, izoakteozid, 2-acetilakteozid, cistanozid A i osmantusid B (Wang i sur. 2000). S povećanjem potražnje za ovim proizvodima i brzim padomCistanche deserticolabiljaka, kultura stanica bila bi atraktivan alternativni način proizvodnje. Mnogi pobuđivači (osobito pobuđivači gljiva) mogu poboljšati proizvodnju metabolita u kulturi biljnih stanica (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) otkrili su da je gljivični izazivač Fusarium solani izoliran iz korijenskog sustava obaCistanche deserticolai njegov domaćin, Halaxylon ammodendron, mogao bi poboljšati sadržaj aminokiselina u kalusimaCistanche deserticolaAli promjene sadržaja PeG-a u ovoj liniji kalusa nisu spomenute u njihovoj studiji. U ovom su radu proučavani učinci elicitora iz F. solani na biosintezu ukupnih PeG-a i dva glavna bioaktivna PeG-a (ehinakozid i akteozid), te na promjene rasta stanica u suspenzijskoj kulturiCistanche deserticola.

Materijali i metode

Kulture biljnih stanica
Kalus je nastao iz ljuskicaCistanche deserticolai održava se na Gamborgovom mediju B5 (1968.) s dodatkom 0.5 mg indol-3-octene kiseline l^-1, 2 mg kinetina l^-1,i 1 g hidrolizata kazeina l^-1. pH je podešen na 6 prije sterilizacije. Svi eksperimenti su izvedeni u tikvicama za mućkanje od 250 ml, od kojih je svaka sadržavala 100 ml medija na rotacijskoj mućkalici (120 okretaja u minuti i 25 stupnjeva) u tami. Inokulum je bio oko 100 g svježeg wt l^-1.

učinkovit sadržaj cistanche deserticola--feniletanoidni glikozid

Priprema sredstva za izazivanje gljivica

Odvajanje soja gljive, Fusarium solani, i priprema gljivičnog elicitora provedeni su kao što je prethodno opisano (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Različite količine (ekvivalenata ugljikohidrata) gljivičnog elicitora dodane su kulturama tikvica za mućkanje 15. dana (ukupno razdoblje kulture bilo je 42 dana).

Test akumulacije biomase i održivosti
Stanice iz tikvice za mućkanje su isprane destiliranom vodom i osušene smrzavanjem do konstantne težine. Tako je određena suha masa. Viabilnost stanica (postotak stanica sposobnih za život u staničnoj populaciji) određena je redukcijom 2,3,5-trifenil tetrazolij klorida (Towill & Mazur 1975).

feniletanoidni glikozidodcistanche deserticola

Određivanje sadržaja ehinakozida, akteozida i ukupnogfeniletanoidni glikozidi(PeGs)
Ekstrakcija PeG-a provedena je prema metodi Du & Liu (1993). LiofiliziranoCistanche deserticolastanice su ekstrahirane sa 70 posto (v/v) etanolom. Etanolna frakcija je koncentrirana, odmašćena etil acetatom zasićenim vodom i zatim isprana n-butanolom zasićenim vodom. Frakcija n-butanola je koncentrirana, otopljena u vodi, stavljena u kolonu smole s makroporama (AB-8, kemijski proizvod Sveučilišta Nankai, Tianjin, Kina) i eluirana vodom i metanolom, uzastopno. Frakcija metanola je sakupljena i ukupni sadržaj PeGs je određen korištenjem ehinakozida kao standarda na 334 nm. Ehinakozid i akteozid određeni su pomoću stupca Nova Pak C18 (250 × 4,6 mm) u HPLC sustavu (voda) s UV detektorom (334 nm).

Rezultati

Učinak gljivičnog elicitora na nakupljanje biomase i ukupnu biosintezu PeG-a Učinci gljivičnog elicitora na staničnu biomasu i ukupno nakupljanje PeG-a ovisili su o dodanoj dozi (ekvivalenata ugljikohidrata). Kao što je prikazano na slici 1, niže doze elicitora bile su povoljne za suhu masuCistanche deserticolaStanice. Vrhunac je bio s elicitorom na 20 mg l^-1(dajući 1,76 mg suhe mase ml^-1).
Ukupna akumulacija PeG-a značajno je povećana gljivičnim elicitorom između 20 mg l^-1i 80 mg l^-1. Elicitor pri 40 mg l-1 postigao je najveći prinos (57 mg g^-1), što je više od dvostruko više od dobivenog u kontrolnoj kulturi bez izazivača. U daljnjem eksperimentu korišten je elicitor gljivica od 40 mg1^-1.

Slika 1. Masa suhe stanice i ukupna akumulacija PeG-a u suspenzijskoj kulturi stanicaCistanche deserticolakao odgovor na različite doze stimulatora gljivica. Gljivični elicitor je dodan u medij 15. d. Uzorci su uzeti nakon daljnjih 27 dana. ▲, Konačna masa suhe ćelije; ◆, ukupni sadržaj PeG. Vrijednosti su srednje vrijednosti trostrukih rezultata, a stupci pogrešaka predstavljaju standardna odstupanja.

Vremenski tijek rasta stanica i biosinteze PeGs
Slika 2 prikazuje vremenski tijek stanične vitalnosti i biosinteze PeGs (ehinakozid i akteozid) suspenzijskih stanica nakon što su kulture podvrgnute 40 mg l^-1gljivični elicitor na 15. d. U sljedećih 27 dana kulture, ehinakozid i akteozid, dva glavna bioaktivna PeG-a uCistanche deserticola, oba su se znatno povećala. 39. dana postignuta su maksimalna nakupljanja, dosegnuvši 14,7 mg g^-1suhe mase i 8,9 mg g^-1 suhe mase, respektivno. Nije primijećena značajna razlika u viabilnosti stanica između kultura tretiranih elicitorom i kontrole.

Slika 2. Preživljavanje stanica i biosinteza ehinakozida i akteozida u suspenzijskoj kulturi stanicaCistanche deserticolanakon tretmana od 40 mg l^-1izazivač gljivica. Gljivični elicitor dodan je u medij 15. d.◆, Echinacoside-tretiran elicitorom; ◇, kontrola ehinakozida; ●, tretirano akteozidom s elicitorom;○,

akteozid-kontrola; ▲, preživljavanje stanica tretirano elicitorom;△ , kontrola preživljavanja stanica. Vrijednosti su srednje vrijednosti trostrukih rezultata, a stupci pogrešaka predstavljaju standardna odstupanja.

Rasprava

Mnoge komponente dobivene iz gljiva (fragmenti stanične stijenke, polisaharidi, oligosaharidi, glikoproteini, itd.) korištene su kao različiti gljivični poticatelji u proizvodnji sekundarnih metabolita s mnogim vrstama biljnih stanica. U ovom radu, homogenat (uglavnom sastavljen od polisaharida) iz soja gljive Fusarium solani izoliran iz korijenskog sustavaCistanche deserticolai pokazalo se da je Halaxylon ammodendron učinkovit pokretač biosinteze PeGs u staničnoj kulturiCistanche deserticola. Upotreba ovog pobuđivača za stimulaciju sinteze PeG-a u stanicama nije bila samo značajna, već je bila i prikazana ubrzo nakon pobuđivanja. Ovaj se zaključak slaže s nekim prethodnim studijama o kulturi biljnih stanica (Wang et al. 2001).

U prethodnoj studiji Li i sur. (1998.), kada je u medij kulture dodan gljivični elicitor iz F. solani, kalus induciran iz sjemenaCistanche deserticolamogao ostati živ u kasnijoj dugoročnoj subkulturi, a proizvodnja iridoida mogla bi se poboljšati. Pokazalo se da kultivirane stanice mogu sintetizirati sekundarne metabolite otpornosti na bolesti kada ih napadnu mikroorganizmi. Iako iridoidi nisu određeni u našem eksperimentu, pokazali smo da se polisaharidi iz F. solani mogu koristiti kao učinkoviti stimulatori gljivica u proizvodnji PeG-a sCistanche deserticolaStanice.

učinkovit sadržaj cistanche deserticola--feniletanoidni glikozid

Od: ' Poboljšanje odfeniletanoidni glikozidiproizvodnja gljivičnim elicitorom u kulturi stanične suspenzijeCistanche deserticola' autora Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Tiskano u Nizozemskoj.

Reference

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995.) Studija jakih učinakaCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. i Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. Kina J. Chin. Mater. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) Određivanjefeniletanoidni glikozidiuCistanche deserticolaspektrofotometrijom makrovezikularne smole. Nat. proizvod Res. Razviti. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Potrebe za hranjivim tvarima suspenzijskih kultura stanica korijena soje. Exp. Cell Res. 50: 151–158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995.) Studija kemijskih sastojaka i farmakoloških učinakaCistanche deserticolamama i Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Brada. Tradicija. Biljka. Lijekovi 26: 143–146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Učinak izazivača Fusarium solani na sadržaj aminokiselina uCistanche deserticolažulj. China J. Northwest Pharm. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975.) Studije redukcije 2,3,5-trifeniltrazolij klorida kao analiza održivosti za kulture biljnog tkiva. Limenka. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001.) Poboljšanje proizvodnje i izlučivanja taksola u kulturi stanica Taxus Chinensis izazivanjem gljivica i obnavljanjem medija. Appl. Microbiol. biotehnologija. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000.) Analizafeniletanoidni glikozidu ekstraktu biljke Cistanchis pomoću LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Grijeh. 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000.) Inhibicija dušikovog oksida feniletanoidima u aktiviranim makrofagima. Eur. J. Pharm. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Učinci salicilne kiseline na membransko-lipidnu peroksidaciju izazvanu gljivičnim elicitorom i proizvodnju taksola u kulturama stanične suspenzije Taxus Chinensis. Proc. Biochem. 37: 477–482.