Guy JM Cameron, et al

Akutna ozljeda bubrega(AKI) može biti fatalan i dobro je definiran čimbenik rizika za razvojkroničnibubregbolest. Urođene limfoidne stanice skupine 2 (ILC2) urođeni su proizvođači citokina tipa -2 i ključni su regulatori homeostaze u perifernim organima. Međutim, naše znanje o njihovoj funkciji ububregje relativno ograničen. Nedavni dokazi sugeriraju da povećanje broja ILC2 sustavnom primjenom rekombinantnog interleukina (IL)-25 ili IL-33 štiti od oštećenja bubrega. Dok se ILC2 mogu inducirati radi zaštite od AKI izazvane ishemijom ili kemikalijama, utjecaj nedostatka ili iscrpljenosti ILC2 na ozbiljnost oštećenja bubrega nije poznat. Prvo, fenotip i lokacija ILC2 ububregprocijenjeni su u homeostatskim uvjetima.BubregILC2 konstitutivno izražavaju visoke razine IL-5 i nalaze se u neposrednoj blizini bubrežne vaskulature. Za testiranje funkcionalne uloge ILC2 ububreg, korišten je eksperimentalni model bubrežne ishemijsko-reperfuzijske ozljede (IRI), a težina ozljede procijenjena je kod divljeg tipa, ILC2-smanjenog, ILC2-nedovoljnog i ILC{{4} }iscrpljeni miševi. Iznenađujuće, nije bilo razlika u histopatologiji, taloženju kolagena ili ekspresiji mRNA faktora povezanih s ozljedom (Lcn2), upalnih (Cxcl1, Cxcl2 i Tnf) ili izvanstaničnog matriksa (Col1a1, Fn1) čimbenika nakon IRI u odsutnosti ILC2. Ovi podaci sugeriraju da odsutnost ILC2 ne mijenja težinu bolestiozljeda bubrega, što ukazuje na moguću redundanciju. Stoga, drugi mehanizmi tipa 2-posredovane aktivacije imunoloških stanica vjerojatno kompenziraju odsutnost ILC2. Stoga je malo vjerojatno da će gubitak ILC2 povećati osjetljivost ili težinu AKI.

Ključne riječi:ILC2, urođena limfoidna stanica grupe 2, IL-5, IL-13,bubreg, bubrežni, IRI, ishemijsko-reperfuzijska ozljeda

Za više informacija kontaktirajte:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

UVOD

Akutna ozljeda bubrega(AKI) i s njim povezane patologije imaju duboke učinke na ljudsko zdravlje (1). Čest uzrok AKI je bubrežna ishemija, koja prvenstveno zahvaća tubularni epitel zbog visoke gustoće mitohondrija i metaboličke aktivnosti u tim stanicama (2); pregledano u Devarajan (3) i Bonventre i Yang (4). Akutna tubularna nekroza otežava izlučivanje otpadnih tvari, mijenja neravnotežu vode i elektrolita i uzrokuje jake upalne reakcije; pregledano u Bonventre i Yang (4). Priljev neutrofila i monocita pridonosi ozljedi, međutim druge urođene imunološke stanice mogu olakšati povratak na homeostazu (5); pregledano u Friedewald i Rabb (6). Urođene limfoidne stanice (ILC) novi su dodatak ovoj obitelji i kategorizirane su u 3 skupine na temelju faktora transkripcije koji su potrebni za njihov razvoj i efektorskih citokina koje proizvode (7). Grupa 2 ILC (ILC2s) snažni su proizvođači citokina tipa 2, pretežno interleukina (IL)-5 i IL-13 (8, 9). Ove stanice također potiču oporavak tkiva nakon ozljede u više organa i imaju različite funkcije in vivo (10). Na primjer, nakon respiratorne virusne infekcije virusom influence, ILC2 koordinira popravak epitela dišnih putova proizvodnjom faktora rasta amfiregulina (AREG) (11). U novije vrijeme, ILC2 su istraživani u modelima oštećenja bubrega uključujući ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu (IRI) i nefrotoksičnu kemijski induciranu ozljedu s doksorubicinom ili cisplatinom (12-16). Bubrežni IRI obično se postiže privremenim ograničavanjem dotoka krvi u bubreg na 20-30 minuta, modelirajući traumu od transplantacije ili kirurške intervencije (17-21). Zajedno, ove studije pokazuju da je in vivo primjena rekombinantnih mišjih citokina koji aktiviraju ILC2, naime IL-25 ili IL-33, dovoljna za smanjenje ozbiljnosti ozljede tubularnih epitelnih stanica (12-16). Slični rezultati postignuti su usvojenim prijenosom ex vivo aktiviranih ILC2 (12, 15). Dok se ILC2 mogu umjetno potaknuti na proliferaciju i zaštitu od štetnih posljedica eksperimentalnog oštećenja bubrega, utjecaj nedostatka ILC2-i dalje nije u potpunosti shvaćen. Doista, druge imunološke stanice, koje imaju složene interakcije s ILC2, kao što su regulatorne T stanice (Treg) i alternativno aktivirani makrofagi (AAM; također poznate kao M2), kritične su za ovaj renoprotektivni učinak (22-25). U ovoj smo studiji nastojali dodatno okarakterizirati ILC2 u bubregu, njihov položaj unutar ovog organa i odrediti njihovu funkcionalnu ulogu u IRI-u koristeći pristup gubitka funkcije. Evo, to smo našlibubregILC2 konstitutivno izražavaju IL- 5 i primarno su smješteni u neposrednoj blizini bubrežne vaskulature, unutar adventicije. Dodatno, pokazujemo da je smanjenje, manjak ili smanjenje ILC2 imalo minimalan utjecaj na ozbiljnost IRI. Dok je prethodno pokazano da aktivacija ILC2 i povezano pojačanje lokalnog imuniteta tipa 2 smanjuju štetne posljedice AKI, naši rezultati otkrivaju da se usporediva ozljeda događa u odsutnosti ILC2, što sugerira da ILC2 mogu biti suvišni u IRI kada drugi kompenzacijski imunološki prisutne su stanice kao što su T stanice.

MATERIJALI I METODE

Miševi

Osam do dvanaest tjedana star mužjak divljeg tipa (WT; C57BL/6JAusb), nosač (Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), ILC2-smanjeni (Roraflfl/ plus Il7rcre/ plus), ILC{{ 8}}deficijentan (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus ), smanjen ILC2- (liječen toksoidom dipterije [DTx] Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ) i IL-5/IL-13 dvostruki reporterski miševi (Il5venus/ plus Il13td tomato/ plus ) miševi dobiveni su iz Australian Bioresources (Moss Vale, Australija). Il5td paradajzCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker miševi dobiveni su od Jackson Labs (ref# 030926 i 007914). Svi miševi koji su podvrgnuti operaciji bili su smješteni u specifičnim uvjetima bez patogena, fizičkog ograničenja 2, u pojedinačno ventiliranim kavezima. Miševi su tijekom operacije bili izloženi normalnom sobnom zraku u steriliziranom okruženju. Miševima je dopušteno 1 tjedan da se aklimatiziraju prije početka pokusa i držani su u ciklusu 12- h dan/noć uz pristup standardnoj laboratorijskoj hrani i vodi ad libitum.

Protočna citometrija i t-SNE analiza

Bubrezia pluća su prikupljena od miševa reportera. Suspenzije pojedinačnih stanica pripremljene su kako je opisano u "Priprema suspenzija pojedinačnih stanica iz pluća miša s tretmanom kolagenazom D" (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach, Njemačka). Stanice su blokirane Fc blokom (pročišćeni anti-mišji CD16/32; Biolegend, San Diego, SAD) tijekom 30 minuta i obojene fluorescentno konjugiranim antitijelima protiv površinskih antigena ciljnih stanica (dodatna tablica 1). Koraci bojenja i ispiranja provedeni su s BSA puferom za bojenje (BD Biosciences, North Ryde, Australija). Uzorci su prikupljeni na BD LSR Fortessa X20 protočnom citometru. Podaci protočne citometrije analizirani su pomoću FlowJo v10.5.3 (Tree Star, Ashland, SAD). T-distribuirano stohastičko ugrađivanje susjeda (t-SNE) izvedeno je na ILC2 (CD45 plus Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1 ] IL7R plus CD90.2 plus ST2 plus FSClowSSClow pojedinačne stanice). Korištenjem dodatka za nasumično smanjivanje uzorkovanja, broj događaja u svakom uzorku normaliziran je na najmanji, zaokružen na najbližih 10 događaja. Sve su populacije kombinirane u jednu .fcs datoteku ulančavanjem smanjenih populacija. Analiza t-SNE provedena je na spojenom uzorku koji je sadržavao zatvorene populacije iz svih uzoraka bubrega i pluća zajedno. Za to su kompenzirani kanali koji nisu korišteni za usmjeravanje procijenjeni pod sljedećim t-SNE postavkama: Iteracija 1000, Perplexity 20, Eta 224. Histogrami su korišteni za prikaz diferencijalne ekspresije površinskih antigena i citokina u plućima ibubreg

Imunofluorescencija Il5td tomatoCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker miševi eutanazirani su i intrakardijalno perfundirani fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS), a zatim 4-postotnim paraformaldehidom (PFA) u PBS-u. Bubrezi su uklonjeni i držani u svježem 4 posto PFA 24 h na 4 °C i zatim isprani u PBS. Tri stotine mikrometarskih presjeka pripremljeno je pomoću vibratoma. Zatim su sekcije tkiva inkubirane u puferu za permeabilizaciju (PBS/0.2 posto Triton X-100/0.3M glicin) zatim blokirane u PBS/0.2 posto Triton X- 100/5 posto magarećeg seruma na 4°C preko noći. Uzorci su isprani u PBS/0.2 posto Tween-20 jednom, zatim inkubirani s primarnim antitijelima razrijeđenim u PBS/0.2 posto Tween-20/3 posto magarećem serumu na sobnoj temperaturi do sljedećeg dana. Zatim su uzorci isprani u PBS/0.2 posto Tween-20 30 min, 3-4 puta, zatim inkubirani sa sekundarnim antitijelima razrijeđenim u PBS/0 .2 posto Tween-20/3 posto magarećeg seruma na sobnoj temperaturi 6-8 h. Uzorci su isprani u PBS/0.2 posto Tween-20 tijekom 1 dana i zatim dehidrirani u uzlaznoj seriji etanola (20, 30, 50, 70, 95, 100 posto), 10 minuta u svakom koraku . Konačno, dijelovi bubrega su očišćeni namakanjem u metil salicilatu (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australija) i zatim postavljeni u svježem metil salicilatu na konkavno pokrovno stakalce ili komoru. Slike su snimljene s konfokalnim laserskim skeniranjem Nikon A1R uključujući 405, 488, 561 i 650 laserskih linija za pobudu i snimanje s 16X/0,8 ili 25X1,1, NA Plan Apo objektivima velike radne udaljenosti za uranjanje u vodu. Z koraci su dobiveni svakih 6µm. Slike su obrađene pomoću ImageJ (NIH, Bethesda, MD, US) i softvera Bitplane Imaris v8 (Andor Technology PLC, Belfast, Sjeverna Irska). Površinske rekonstrukcije alfa-glatkih mišićnih krvnih žila označenih aktinom izvedene su s Imarisom i pseudobojane na temelju njihove karakteristične arhitekture i volumena za vizualizaciju velikih arterija i vena. Upotrijebljena su sljedeća protutijela i razrjeđenja: Living Colours anti-DsRed Rabbit Policlonal Pan Antibody (1:500; TaKaRa, Mountain View, SAD), kozja poliklonalna anti-alpha-glatki mišić aktin protutijela (1:200; Abcam, Cambridge, UK) ), eFluor 660 LYVE1 monoklonsko protutijelo (1:300, klon ALY7, eBioscience), antitijelo protiv CD3 miša armenskog hrčka (1:100, klon 145-2C11, Biolegend), Alexa Fluor R 488 magareći anti-kozji IgG (H plus L), Alexa Fluor R 555 magareći anti-zečji IgG (H plus L) Alexa Fluor R 647 kozji anti-hrčak IgG (H plus L) unakrsno adsorbirani (1:400, ThermoFisher Scientific).

Unilateralna ishemijsko-reperfuzijska ozljeda

Kirurška anestezija inducirana je inhalacijom 4 posto izoflurana i održavana kontinuiranom inhalacijom 1-1,5 posto izoflurana kroz nosni konus. Tijekom cijelog postupka, miševi su držani na kirurškoj platformi održavanoj na 37 ± 1 °C pomoću toplinske prostirke kontrolirane digitalnim termostatom. Kod svih životinja učinjena je nefrektomija desnog bubrega. Da bi se izazvala unilateralna ishemija, žile lijevog bubrega stegnute su u blizini bubrežne peteljke 29-min upotrebom ne-traumatske sterilne vaskularne stezaljke (Coherent Scientific; Hilton, Australija) primjenom dovoljne sile da se spriječi dotok krvi ui odbubregbez ireverzibilnog oštećenja krvnih žila. Ujednačena i brza reperfuzijabubregopažen je nakon uklanjanja vaskularne stezaljke kod svih miševa. Rane mišića i kože zatvorene su pomoću 5/0 vikrilnog konca (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Australija), koža je zatim zapečaćena dermalnim ljepilom (Provet, Charlestown, Australija) kako bi se zaštitila rana i spriječiti infekciju. Kontrolne životinje podvrgnute su lažnoj operaciji s identičnim vremenom anestezije i primile su samo kontralateralnu nefrektomiju. Za učinkovitu analgeziju, miševi su primili 0.1 mg/kg buprenorfina supkutano 30 min prije operacije, a zatim 0.05–0.1 mg/kg svakih 8–12 sati, po potrebi. Životinje su tipično odviknute od analgezije 4 dana nakon operacije bez ikakvih znakova boli ili uznemirenosti kako je definirano karakteristikama lica korištenjem standardne mišje skale grimase; kako je opisano (26). Svi miševi su preživjeli do unaprijed određene krajnje točke.

Deplecija ILC2 in vivo

ILC2 su iscrpljeni u Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus miševima intraperitonealnom injekcijom 0.025 mg/kg DTx (Sigma-Aldrich) kao što je prethodno opisano (27). DTx je primijenjen 30 minuta prije operacije i svakodnevno nakon toga do krajnje točke. Kako bi se potvrdilo smanjenje ILC2-, podskupina naivnih životinja primala je DTx 3 dana. Kontrolni miševi Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus primili su intraperitonealnu injekciju fiziološke otopine.

Histologija

Izrezanobubregaodmah su prepolovljeni uzdužno kroz hilum. Polovica je fiksirana u 10 postotnom puferiranom formalinu, koji sadrži 4 posto formaldehida tijekom 24 sata prije privremenog skladištenja u 10 postotnom etanolu, ugradnje u parafin i rezanja. Uzdužno izrezani rezovi veličine četiri mikrometra obojeni su periodnom kiselinom-Schiff (PAS) i Massonovim trikromom. Histopatologija je kvantificirana vizualizacijom dilatacije tubula, apoptoze ili formiranja odljeva od strane jednostruko slijepog istraživača koristeći dobro uspostavljenu polukvantitativnu metodu (28), s manjim promjenama kao što je opisano (15). Uzet je prosjek rezultata iz duplikata PAS obojenih sekcija svake životinje. Rezultat od 0=0 posto tubula bio je zahvaćen gore navedenim histopatološkim značajkama; 1=1–10 posto ; 2=11–25 posto ; 3=26–50 posto; 4=51–75 posto; 5=76–100 posto. Taloženje kolagena procijenjeno je pomoću Massonovog trikroma, a kolagen je identificiran kao sadržaj metil plavog između susjednih tubula.

Ekstrakcija RNA, reverzna transkripcija i qPCR

Za analizu ekspresije gena zadržana je polovica jednog bubrega. Tkivo je homogenizirano u 400 µl PBS pomoću TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, Australija) kroz 50 oscilacija u sekundi tijekom 2 minute. Dvjesto mikrolitara uzorka uzeto je za druge analize. Jedan mililitar TRI reagensa R (Sigma-Aldrich) dodan je u preostalih 200 µl uzorka, koji je dobio daljnjih 50 oscilacija u sekundi tijekom 1-2 minute do potpune homogenizacije. Nakon 5 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi i centrifugiranja na 12,000xg tijekom 10 minuta, supernatant je ekstrahiran i vorteksiran s 250 µl kloroforma (Sigma-Aldrich). Nakon inkubacije tijekom 10 minuta na sobnoj temperaturi i centrifugiranja na 12,000xg tijekom 15 minuta, supernatant je ekstrahiran i miješan s 500 µl 70 postotnog izopropanola (Sigma-Aldrich). Uzorak je ponovno inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi, zatim je centrifugiran na 12,000xg 10 minuta. Supernatant je odbačen bez prekidanja taloga bogatog RNA. Talog je ispran dva puta s 1 ml etanola 75-postotnog RNA-grade (Sigma-Aldrich), centrifugiran na 10,000xg 5 minuta i supernatant je svaki put odbačen. Talog je kratko osušen na zraku na sobnoj temperaturi prije resuspendiranja u 80-100 µl dvostruko destilirane vode bez UltraPureTM DNaze/RNaze (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) i zatim je pohranjen na 80°C prije obrnute transkripcije . Neposredno prije reverzne transkripcije, prinos RNA određen je spektrofotometrijskom procjenom pomoću Nanodrop2000TM (Thermo-Fisher Scientific). Pet mikrolitara svakog uzorka razrijeđeno je u ddH2O tako da je 1000 ng RNA napunjeno po uzorku. Nakon tretmana DNAse (Sigma-Aldrich), cDNA je generirana korištenjem standardnih operativnih postupaka enzima M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, Australija) korištenjem termociklera T100TM (BioRad Laboratories, Gladesville, Australija). Koristeći metodologiju temeljenu na SYBR-u, qPCR je izveden pomoću CFX384 TouchTM (BioRad Laboratories) prema standardnim radnim postupcima. Svaki set početnica ispitan je gradijentom kako bi se odredila optimalna temperatura za pojačavanje (dodatna tablica 2). Kvantifikacija ciklusa je interpretirana korištenjem regresije za svaki cilj, ekspresija gena je normalizirana u odnosu na hipoksantin-gvanin fosforiboziltransferazu (Hprt). Krivulje taljenja su procijenjene na znakove dimerizacije početnica i nespecifične amplifikacije. Na svakoj ploči korištena je najmanje jedna negativna kontrola i kontrola bez uzorka za svaku metu kako bi se osiguralo da kontaminacija nije prisutna unutar svake glavne mješavine ili ddH2O koji se koristi.

RT2 Profiler Array

RT² ProfifilerTM PCR Array Mouse Extracellular Matrix & Adhesion Molecules (Qiagen) izveden je u skladu s uputama proizvođača, a podaci su učitani i zatim analizirani online alatom, dostupnim na https://dataanalysis. qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. Ovaj niz omogućuje profiliranje 84 gena u maksimalno 4 uzorka, stoga su jednake količine cDNA za svaki replikat u skupini skupljene iz WT miševa 1., 3. ili 7. dana nakon IRI-a, a lažno skupljene iz svakog replikata iz svake ovih vremenskih točaka. Za svaku metu, promjena nabora nakon IRI-a uspoređena je s lažnom ekspresijom.

Statistička analiza

Svi podaci analizirani su softverom Graphpad Prism v8.02 korištenjem neparametarskih neuparenih t-testova (Mann-Whitney U-test). P < 0.05="" postavljen="" je="" kao="" prag="" za="" određivanje="" statistički="" značajnih="" razlika.="" ∗p="">< 0,05,="" ns="" nije="" značajan.="" svi="" podaci="" su="" izraženi="" kao="" srednja="" vrijednost="" ±="" sem.="" u="" svakoj="" analizi="" bilo="" je="" n="4–8" ponavljanja="" po="" skupini,="" a="" rezultati="" su="" bili="" reprezentativni="" za="" najmanje="" dva="" eksperimenta.="" veličina="" uzorka="" za="" svaki="" eksperiment="" opisana="" je="" u="" odgovarajućoj="" legendi="">

REZULTATI

Bubrežni ILC2 konstitutivno izražavaju IL-5 i lokalizirani su u bubrežnoj vaskulaturi u homeostatskim uvjetima

Provedena je detaljna analiza bubrežnog fenotipa ILC2 i lokacije u homeostatskim uvjetima. Bilo je značajno više ILC2 (CD45 plus Lineage IL- 7R plus CD90.2 plus ST2 plus FSClowSSClow pojedinačnih stanica) u bubrezima u usporedbi s plućima kada su predstavljeni kao postotak ukupnih CD45 plus pojedinačnih stanica (Slika 1A; Dopunske slike 1A, B). t-SNE analiza ILC2 bubrega i pluća pokazala je jedinstveno grupiranje, iako se ti klasteri nisu potpuno razlikovali jedan od drugog (Slika 1B). Međutim, ILC2 bubrega imale su izrazito nižu ekspresiju CD25, dosljednu ekspresiju ICOS i KLRG1, ali veću ekspresiju IL-5 u usporedbi s ILC2 pluća (Slika 1C). Bubrežni ILC2 imali su višu konstitutivnu ekspresiju IL-5 nego IL-13 (Slika 1D; Dodatne slike 1C, D). Utvrđeno je da su ILC2 glavni tip stanica koje proizvode IL-5 u bubrezima, sa zanemarivim doprinosom stanica T pomoćnika -2 (TH2) (Slika 1E, Dodatne slike 1E, F). Stoga je IL-5 korišten kao surogat marker za identifikaciju lokacije ILC2 unutar mišjeg bubrega, kao što je opisano za više perifernih organa (29-31). To je postignuto korištenjem miševa koji eksprimiraju IL-5 povezanu Cre-rekombinazu ukrštenu s uređajem za praćenje loze Rosa-rajčica (30, 31). IL-5 plus stanice (pretežno ILC2s) pronađene su posvudabubregali su prvenstveno bili lokalizirani na glavnu vaskulaturu, kako je vizualizirano pozitivnim bojenjem na alfa-glatki mišićni aktin (-SMA) (slika 2A; dodatne slike 2A, B), u skladu s našim nedavnim izvješćem (29). Utvrđeno je da su ILC2 povezani s interlobularnim i arkuatnim bubrežnim žilama u korteksu i medularnim regijama, kao što je prikazano ekspresijom limfnog endotelnog hijaluronanskog receptora-1 (LYVE1) (Slika 2B). Daljnje snimanje pokazalo je da je vrlo malo CD3 plus stanica (pretežno TH2 stanica) pridonijelo endogenom IL-5 plus signalu (Slika 2C). ILC2 su identificirani u adventiciji krvne žile korištenjem pseudobojnih površinskih rekonstrukcija arterijske -SMA.

Smanjenje, nedostatak ili iscrpljivanje ILC2 ne mijenja ozbiljnost eksperimentalne bubrežne ishemije-reperfuzijske ozljede kod miševa

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2-puta u usporedbi s lažnim kontrolama, dok su 1/84 i 6/84 povećani 1. odnosno 3. dana (dodatna slika 4A). IRI je izazvao akutnu tubularnu nekrozu karakteriziranu proširenim tubulima i stvaranjem odljeva, u usporedbi s lažnim kontrolama (Slika 3B, Dodatne slike 3A, 4B). To je kvantificirano kao rezultat tubularne ozljede, a ozbiljnost ozljede bila je slična u svim genotipovima (Slika 3C). IRI je također inducirao taloženje kolagena, obilježeno sadržajem metil plavog između tubula u meduli i korteksu, u usporedbi s lažnim kontrolama (Slika 3D; Dodatna slika 3B). Odsutnost ILC2 nije utjecala na taloženje kolagena. IRI je također povećao ekspresiju mRNA faktora povezanih s ozljedom, kemokina i proupalnih citokina (slike 3E–J, dopunske slike 4C–K). Lipokalin povezan s neutrofilnom želatinazom (Lcn2; NGAL), biomarker oštećenja bubrega (33, 34), bio je povećan IRI i nije bio pod utjecajem smanjenja, nedostatka ili smanjenja ILC2 (Slika 3E). CXC motiv kemokinskog liganda 1 (Cxcl1) i Cxcl2 također su značajno povećani pomoću IRI u svim genotipovima (slike 3F, G). Slično tome, proupalni citokin čimbenik nekroze tumora (Tnf) povećan je pomoću IRI, u usporedbi s lažnim kontrolama (Slika 3H). U skladu s vidljivim taloženjem kolagena, ekspresija mRNA faktora izvanstaničnog matriksa kolagena tipa I alfa 1 lanca (Col1a1) i fibronektina 1 (Fn1) povećana je pomoću IRI u svim genotipovima (slike 3I, J).

RASPRAVA

ILC2 su kritični regulatori homeostaze tkiva, ali njihova uloga u bubrezima tek treba biti u potpunosti razjašnjena. Dok se ILC2 mogu potaknuti na proliferaciju i zaštitu od štetnih posljedica eksperimentalnog oštećenja bubrega, još nije poznato što se događa u nedostatku tih stanica. Prvo smo ispitali jesu li brojevi ILC2, kao udio CD45 plus hematopoetskih stanica, različiti u plućima i bubrezima. ILC2 čine veći udio CD45 plus stanica u bubrezima nego u plućima. t-SNE analiza različito je grupirala ILC2 s oba mjesta, međutim, klasteri nisu bili posve različiti između tih tkiva. Postojale su razlike u njihovoj ekspresiji antigena stanične površine i citokina tipa 2, pri čemu su ILC2 bubrega eksprimirali veće količine IL-5. Doista, ILC2 bubrega konstitutivno izražava visoke razine IL-5 u homeostatskim uvjetima. ILC2 su također bili glavni izvor IL-5 u bubrezima, sa zanemarivim doprinosom TH2 stanica. Stoga je IL-5 korišten kao surogat marker za određivanje položaja tih stanica u bubregu. ILC2 su identificirani unutar bubrega i lokalizirani su gotovo isključivo duž bubrežne vaskulature. U ovim studijama, Cre-rekombinaza povezana s IL-5 korištena je u kombinaciji s flox-stop-flox sekvencom uzvodno od CAG-RFP-WPRE kazete u konstitutivno izraženom ROSA26 lokusu za lociranje ILC2. LYVE1, koji se eksprimira u bubrežnim limfnim endotelnim stanicama, korišten je za daljnje definiranje lokacije tih stanica unutar mišjeg bubrega (35). Kao što se i očekivalo, bojanje LYVE1 bilo je ugrađeno u vezivno tkivo bubrežnih arterija korteksa, ali ne unutar medule jer u ovoj regiji bubrega ne postoji vidljiva limfna mreža (35-37). Pretpostavlja se da su ILC2 smješteni blizu vaskularnog jer su endotelne stanice bubrega glavni izvor IL-33 u bubregu (38, 39). Potvrđujući naše opažanje FACS suspenzija jednostaničnih bubrega, ponovno je utvrđeno da su ILC2 glavni proizvođači IL-5 u dijelovima bubrežnog tkiva, s minimalnim doprinosom CD3 plus T stanica. Dok ove studije pokazuju lokaciju ILC2s u bubregu koristeći reporterske miševe, ostaje da se utvrdi jesu li ILC2 također smještene uz vaskulaturu u ljudskom bubregu i je li lokacija ILC2s promijenjena kao odgovor na oštećenje bubrega. Iako je više izvješća pokazalo da se brojevi ILC2 ne mijenjaju zbog ozljede bubrega, njihov fenotip i stanje aktivacije nakon ozljede zahtijevaju daljnje razjašnjenje (12-16). Zatim smo opisali funkcionalnu ulogu ILC2 u bubrezima koristeći pristup gubitka funkcije. Da bismo to postigli, iskoristili smo miševe sa smanjenim ILC2-i nedostatkom te miševe koji mogu biti uvjetno osiromašeni za ILC2 nakon primjene DTx (27). Potvrdili smo upotrebu ovih alata za obaranje ili ablaciju ILC2 u bubregu. Odabran je eksperimentalni model IRI-a, s obzirom na blizinu ILC2s bubrežnoj vaskulaturi. Iako su značajke ozljede bile vidljivo vidljive nakon IRI, smanjenje, manjak ili smanjenje ILC2 nije promijenilo grubu histopatologiju u bubregu, niti je uzrokovalo smrtnost. Doista, remodeliranje izazvano IRI-jem i taloženje kolagena dogodilo se neovisno o ILC2. Iako je moguće da je ranija vremenska točka nakon ozljede mogla identificirati razlike u histopatologiji i ekspresiji gena, vremenska točka u našoj studiji također je omogućila procjenu taloženja kolagena, važne značajke remodeliranja koja je regulirana ILC2 (16, 32, 40 –44). Također je moguće da smanjenje ILC2s tijekom

AKI bi mogao biti štetan za strukturu i funkciju bubrega kada se procjenjuje u kasnijim vremenskim točkama zbog potencijalnih neprilagodljivih reakcija popravka u odsutnosti ILC2. Kako bi se to pozabavilo, buduće će studije trebati istražiti ulogu ILC2 u progresiji AKI u kroničnu bubrežnu bolest (45, 46).

Zajedno, ova studija pokazuje da smanjenje, nedostatak ili iscrpljivanje ILC2 ne mijenja težinu eksperimentalnog AKI-a kod miševa. Dok je prethodno pokazano da aktivacija ILC2 i povezano pojačanje lokalnog imuniteta tipa 2 smanjuju štetne posljedice AKI, usporediva ozljeda se događa kada su ILC2 smanjeni, odsutni ili iscrpljeni, što ukazuje na moguću redundantnost i kompenzaciju od strane drugih imunoloških stanica, kao što je Treg , AAM i TH2 stanice. Ovaj koncept podupiru studije na miševima Rag1 / ili Rag2 / kojima nedostaju zrele T i B stanice, u modelimaozljeda bubrega(13, 15, 47, 48). U jednoj studiji, primjena anti-CD90.2 korištena je za smanjenje ILC2, međutim, te su životinje također imale nedostatak Treg i TH2 stanica (15). U ovom modelnom sustavu, unatoč smanjenju ILC2 s anti-CD90.2, kompenzacija iz odjeljka T stanica nije moguća. Naši podaci pokazuju da gubitak ILC2s, kada odjeljak T stanica ostaje netaknut, ima minimalne učinke na ozbiljnost IRI. Naši podaci podržavaju koncept da ILC2 uz druge imunološke stanice, kao što su Treg i AAM, doprinose AKI. Doista, smanjenje Treg pogoršalo je histopatologiju nakon IRI (15). Slično tome, polarizacija makrofaga prema AAM-u potiče rješavanje ozljede (5, 12, 46, 49, 50). Potrebne su daljnje studije kako bi se razjasnio razlog prisutnosti ILC2 u bubrezima, uključujući uzlazne infekcije urinarnog trakta i druge bubrežne ozljede, kao i progresiju dokronične bolesti.

ETIČKA IZJAVA

Sve kirurške zahvate odobrio je Odbor za brigu o životinjama i etiku Sveučilišta u Newcastleu u skladu s australskim Kodeksom za brigu i korištenje životinja u znanstvene svrhe. Postupci za imunofluorescentno snimanje odobreni su i provedeni u skladu sa smjernicama koje je utvrdio Odbor za brigu i korištenje životinja UCSF-a i Centar za laboratorijske životinje.

AUTORSKI PRILOZI

Prikazani rad izveden je u suradnji sa svim autorima. GC je izvršio kirurški model, protočnu citometriju, histološku procjenu, analizu ekspresije gena i analizirao podatke. KC i ABM izveli su pokuse imunofluorescencije. SL potpomognut praćenjem životinja i protočnom citometrijom. SJ i AD pružili su klinički uvid u dizajn studije i kiruršku tehniku. ANM je stvorio, isporučio i savjetovao o upotrebi ILC2-deficitarnih & -depletiranih miševa i Il13td paradajz miševa. PF je isporučio i savjetovao o korištenju Il5venus reporter linije. PF i PH su savjetovali o eksperimentalnom dizajnu. MS je dizajnirao, nadgledao i omogućio sve aspekte studija. Svi su autori sudjelovali u interpretaciji podataka, pripremi i uređivanju rukopisa za intelektualni sadržaj.

FINANCIRANJE

MS je podržan stipendijom Australskog istraživačkog vijeća (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA) i potporama Nacionalnog zdravstvenog i medicinskog istraživačkog vijeća (NHMRC), Hunter Medical Research Institute i Hunter Children's Research Foundation.

REFERENCE

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, et al. Incidencija AKI u svijetu: meta-analiza.Clin J Am Soc Nefrol. (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. Višefotonsko snimanje otkriva razlike u mitohondrijskom funkcioniranju između segmenata nefrona.J Am Soc Nephrol. (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. Najnovije informacije o mehanizmima ishemijske akutne ozljede bubrega.J Am Soc Nefrol. (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. Stanična patofiziologija ishemijske akutne ozljede bubrega.J Clin Invest.(2011) 121: 4210-21. DOI: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS, et al. Različiti fenotipovi makrofaga pridonose oštećenju i oporavku bubrega.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. Upalne stanice u ishemijskom akutnom zatajenju bubrega.Kidney Int.(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Urođene limfoidne stanice - prijedlog jedinstvene nomenklature.NatRev Immunol.(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H, et al. Urođena proizvodnja T(H)2 citokina pomoću c-Kit( plus )Sca-1( plus ) limfoidnih stanica povezanih s masnim tkivom.Priroda. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA, et al. Nuociti predstavljaju nove urođene efektorske leukocite koji posreduju u imunosti tipa -2.Priroda. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, Cameron GJM, Starkey MR, Hansbro PM. Razvoj pluća i nove uloge za imunitet tipa 2.J Pathol.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA, et al. Urođene limfoidne stanice potiču homeostazu plućnog tkiva nakon infekcije virusom influence.Nat Immunol. (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H, et al. IL-25 izaziva urođene limfoidne stanice i multipotentne progenitorske stanice tipa 2 koje smanjuju ishemično/reperfuzijsko oštećenje bubrega.J Am Soc Nephrol.(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C, et al. IL-33-posredovana ekspanzija urođenih limfoidnih stanica tipa 2 štiti od progresivne glomeruloskleroze.J Am Soc Nephrol.(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR, et al. IL233, novi hibridni citokin IL-2 i IL-33, ublažava oštećenje bubrega.J Am Soc Nephrol. (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z, et al. Potenciranje urođenih limfoidnih stanica tipa 2 rezidentnih u tkivu pomoću IL-33 kako bi se spriječilo ishemijsko-reperfuzijsko oštećenje bubrega.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R, Mohammad S, Sharma R. Novi hibridni citokin IL233 posreduje u regeneraciji nakon nefrotoksične ozljede izazvane doksorubicinom.Sci Rep. (2019) 9:3215. 

17. Cameron GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. Novi terapijski potencijal urođenih limfoidnih stanica skupine 2 u akutnoj ozljedi bubrega.J Pathol. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K, et al. Životinjski modeli akutnog zatajenja bubrega.Pharmacol Rep. (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Mišji modeli i metode za proučavanje bolesti kod ljudi, akutne ozljede bubrega (AKI).Metode Mol Biol.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, de Caestecker MP. Ishemijsko-reperfuzijski model akutne ozljede bubrega i fibroze nakon ozljede u miševa.J VisExp.(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. Mišji model ishemijske akutne ozljede bubrega: tehničke napomene i trikovi.Am J Physiol Renal Physiol.(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM. Urođene limfoidne stanice plućne skupine 2: iznenađenja i izazovi.Mucosal Immunol.(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. Imunološke stanice u eksperimentalnoj akutnoj ozljedi bubrega.Nat vlč. Nefrol.(2015) 11:88-101. DOI: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. Limfociti koji žive u tkivu u bubregu.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. Urođeni imunološki odgovor kod ishemijske akutne ozljede bubrega.Clin Immunol. (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S, et al. Kodiranje izraza lica boli u laboratorijskog miša.Natmetode.(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM, et al. Dijalog posredovan MHCII između urođenih limfoidnih stanica grupe 2 i CD4 plus T stanica potencira imunitet tipa 2 i potiče izbacivanje parazitskih helminta.Imunitet. (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. Učinci ciklosporina A na razvoj imunološki posredovanog intersticijalnog nefritisa.Bubreg Int. (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S, et al. Adventivne stromalne stanice definiraju urođene tkivne niše limfoidnih stanica grupe 2.Imunitet. (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A, et al. Urođene limfoidne stanice tipa 2 održavaju eozinofile visceralnog masnog tkiva i alternativno aktivirane makrofage.J Exp Med.(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB, et al. Urođene limfoidne stanice tipa 2 kontroliraju homeostazu eozinofila.Priroda.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B, et al. Uloge T/B limfocita i ILC2 u eksperimentalnoj kroničnoj opstruktivnoj plućnoj bolesti.J Leukoc Biol.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J, et al. Identifikacija lipokalina povezanog s neutrofilnom želatinazom kao novog ranog urinarnog biomarkera za ishemijsko oštećenje bubrega.J Am Soc Nephrol.(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. Diferencijalna ekspresija gena nakon rane bubrežne ishemije/reperfuzije.Kidney Int.(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. Anatomija bubrega: Limfni sustavi. U:Brenner iRektorovaE-knjiga o bubrezima. 10. izd. Amsterdam: Elsevier (2015). str. 80–1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R, et al. LYVE-1, novi homolog glikoproteina CD44, je limfni specifični receptor za hijaluronan.J Ćelija Biol. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH, et al. Ekspresija hijaluronanskog receptora LYVE-1 specifičnog za limfni endotel u mišjem bubregu u razvoju.ĆelijaTkivoRes.(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J, et al. IL- 33-ovisna endotelna aktivacija doprinosi apoptozi i oštećenju bubrega kod miševa zaraženih tsutsugamushijem.PLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G, et al. Endogeni IL-33 doprinosi oštećenju ishemije-reperfuzije bubrega kao alarm.J Am Soc Nefrol. (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M, et al. Interleukin-33-ovisne urođene limfne stanice posreduju u fibrozi jetre.Imunitet. (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Pariano M, Iannitti RG, et al. Put mastocita-ILC2-Th9 potiče upalu pluća kod cistične fibroze.Nat Komun. (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G, et al. IL-25 i urođene limfoidne stanice tipa 2 induciraju plućnu fibrozu.ProcNatlAkad Sci SAD. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usherenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C, et al. Broj urođenih limfoidnih stanica tipa 2 povećan je u bolesnika sa sistemskom sklerozom i korelira s opsegom fibroze.Ann Rheum Dis.(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L, et al. IL-33 potiče ST2-ovisnu fibrozu pluća indukcijom alternativno aktiviranih makrofaga i urođenih limfoidnih stanica u miševa.J Allergy Clin Immunol. (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Doll MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. Subklinička ozljeda bubrega izazvana ponovljenom primjenom cisplatina rezultira progresivnom kroničnom bolešću bubrega.Am J Physiol Renal Physiol.(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C, et al. Molekularna karakterizacija prijelaza iz akutne u kroničnu ozljedu bubrega nakon ishemije/reperfuzije.JCI Insight.(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK, et al. Aktivacija NKT stanica posreduje u proizvodnji IFN-gama neutrofila i bubrežnoj ishemiji-reperfuzijskoj ozljedi.J Immunol.(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobašić D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM, et al. Urođeni leukociti koji proizvode IL-17A potiču akutnu ozljedu bubrega putem inflamasoma i aktivacije receptora sličnog Tollu.Am J Pathol.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM, et al. IL-25 inducira M2 makrofage i smanjuje oštećenje bubrega kod proteinurične bolesti bubrega.J Am Soc Nefrol. (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S, et al. TGF-beta potiče fibrozu nakon teške akutne ozljede bubrega pojačavanjem infiltracije bubrežnih makrofaga.JCI Insight.(2018) 3:123563.