Gosipitrin, prirodni flavonoid, smanjuje oštećenje neurona i mitohondrija izazvano željezom: 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

2.5. Detekcija Gos-Fe(I) kompleksa

Vjerodostojna hipoteza za objašnjenje gornjih rezultata jest da Gos tvori prolazni kompleks s Fe(ll) koji olakšava njegovu oksidaciju kisikom. Ovaj prijelazni kompleks mogao bi predati svoje elektrone lakše nego Fe()-citrat, generirajući stabilniji kompleks s Fe(III). Slika 6A prikazuje tipični spektar Gos s maksimalnom apsorpcijom na 276, 332 i 380 nm (crna linija). Dodatak Fe() izazvao je o koncentraciji ovisan pad maksimalnih apsorpcijskih vrhova i pojavu novog blizu 500 nm (Slika 6A). Pojava niza spektara koji potječu iz Gos spektra potvrđena je prisutnošću izosbestične točke na λiso=405 nm （vidi crne točke）, što ukazuje na kemijsku ravnotežu (kompleksiranje) između slobodnog i kompleksiranog Gos. Umetak (Slika 6A) prikazuje stvaranje kompleksa sa stehiometrijom 2:1 (Gos-željezo). Stehiometrija takvih kompleksa Gos-željezo određena je Jobovom metodom koja pokazuje prijelomnu točku pri molarnom omjeru od 0,5.

Kliknite ovdje da saznate više

Dodatni dokazi o korelaciji između željeza i Gos dobiveni su IR spektroskopijom (Slika 6B). Za slobodni Gos i njegov kompleks željeza, širokopojasni pojas koji se nalazi u rasponu od 3000-4000 cm- smatran je istezanjem vodika- vezane hidroksilne skupine zbog prisutnosti molekula vode. Način rastezanja v(C=O) slobodnog Gos javlja se na 1654 cm-I, koji je pomaknut prema 1636 cm-I nakon formiranja kompleksa. Ovaj rezultat sugerira da je Fe(Ⅱ) u korelaciji s karbonilnim kisikom [31]. Štoviše, prisutnost v(Fe-O) vibracije istezanja na 630 cm-I potvrđuje formiranje kompleksa željezo-Gos, budući da slobodni Gos ne pokazuje takav pojas.

Slika 6. (A) Učinci Fe(II) na Gos UV-VIS spektar (200-600 nm). Inkubacijska smjesa koja je sadržavala 125 mM saharoze, 65 mM KCl, 10 mM HEPES pufera (pH 7,2), 2 mM citrata i Gos 1,6 μM. Koncentracije Fe（I） od vrha do dna tragova bile su {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 i 1.12 μM. Umetak∶ Jobov dijagram za Gos-Fe（II） kompleks pri konstantnoj ukupnoj koncentraciji 【Fe（D）】 plus 【Gos】=1.6 μM. Crna točka označava izosbestičku točku. Strelice prema dolje i prema gore pokazuju smanjenje odnosno povećanje vrijednosti apsorbancije pri 380 odnosno 500 nm. Eksperimenti su provedeni na 28 stupnjeva. Brzina skeniranja bila je 2 nm/sA. Osnovna linija je uspostavljena s inkubacijskom smjesom plus 1,6 μM Fe(I).（B）Infracrveni spektri Gos i Gos-Fe（I）. Prikazani su tipični primjeri.

2.6. Gos sprječava Fe(III) redukciju askorbatom

Feri stanje željeza koje promiče Gos predstavlja vjerojatan antioksidativni mehanizam budući da sprječava katalitičku aktivnost Fe(II). Unatoč tome, Fe(III) se još uvijek može ponovno reducirati u željezni oblik prirodnim redukcijskim agensima poput askorbata. Potonji bi mogao ponovno napuniti biološke sustave s Fe(II), koji sudjeluje u Fenton-Haber-Weiss reakcijama, stvarajući ekstremno reaktivan ·OH radikal. Kako bismo ispitali ove mogućnosti, upotrijebili smo 1,10-fenantrolin za mjerenje razina stvaranja Fe(II) iz Gos otopine （100 µM） tretirane s 2 mM askorbata i različitim koncentracijama Fe(II） （{{6} } μM）. Slika 7 pokazuje da je odsutnost Gos omogućila maksimalnu stopu smanjenja Fe(II) u Fe(II) (crna linija s nagibom od 5,85×10-3); međutim ovaj proces je usporen prisutnošću Gos (1-min inkubacije, zelena linija), a nakon 5 minuta inkubacije s Gos, stopa redukcije Fe(I) pomoću askorbata smanjila se gotovo 3 puta (crvena linija s nagibom od 2,04× 10-3). Ovaj rezultat pokazuje sposobnost Gos da inhibira askorbatom posredovanu redukciju Fe() u Fe(I)

Slika 7. Gos inhibira Fe(ⅢI)-redukciju askorbatom u odsutnosti mitohondrija jetre štakora. Eksperimentalni uvjeti: 125 mM saharoza, 65 mM KCl, 10 mM HEPES pufer (pH7,2), 1 mM citrat, Gos 100 μM. Eksperimenti su provedeni na 28 stupnjeva. Askorbat（4 mM） i 5 mM 1,10-fenantrolin dodani su nakon 1 minute ili 5 minuta Gos-Fe(I) inkubacije. Linije su reprezentativne za tri testa.

2.7. Gos štiti od 2-oksidativne razgradnje deoksiriboze

Kako bi se dokumentirala sposobnost Gos da preferirano djeluje na željezo umjesto na slobodne radikale, provedene su kompetitivne studije za procjenu učinkovitosti Gos i dva·OH čistača (DMSO i salicilat) u zaštiti 2,8 ili 28 mM 2-deoksiriboze od željeza -posredovano oksidativno oštećenje (Slika 8). Čistači ·OH pri 20 mM zaštitili su 28 mM 2-dezoksiriboze znatno manje od 2,8 mM2-deoksiriboze (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Slika 8. Učinak čistača Gos i ·OH dimetil sulfoksida (DMSO) i salicilata na oksidativno oštećenje 2,8 ili 28 mM 2-deoksiriboze izazvano Fe(II)-EDTA plus askorbat. Otopine su inkubirane 30 min na 37 stupnjeva i sadržavale su 10 mM fosfatnog pufera (pH7,2), 2-deoksiribozu (2,8 ili 28 mM）, 150 μM EDTA i 50 μM Fe（ⅢI） Reakcije su započete dodavanjem askorbata do konačne koncentracije od 2 mM. Stupci pokazuju srednju vrijednost ± SD (n=3). Kontrole sadrže samo DMSO (0,001 posto), što je koncentracija otapala u Gos uzorcima. Jednostrani t-test korišten je za*p<0.05, n.s.,="">

3. Rasprava

Željezo koje se oslobađa u nekoliko neurodegenerativnih stanja, uključujući ishemijski i hemoragijski moždani udar, izaziva deregulaciju homeostaze željeza u mozgu, što dovodi do patofiziologije neuroloških ozljeda [4,32-34]. Na podstaničnim razinama, čini se da je oštećenje mitohondrija uključeno u neuronsku smrt posredovanu željezom [10,15,35-38]. Pretklinički dokazi podupiru prednost korištenja kelatora željeza, uglavnom deferoksamin mesilata, protiv neurodegeneracije uključujući sve vrste moždanog udara [7,16]. Međutim, njihova visoka cijena i nedostupnost te širok raspon štetnih učinaka klasičnih kelatora željeza doveli su do upotrebe prirodnih kelatora za kontrolu željeza kod dishomeostaze [39,40].

Cistanche može poboljšati imunitet

Zaštitno djelovanje Gos-a prikazano je na HT-22 stanicama i mitohondrijima štakorskog mozga inkubiranim sa smjesom željeza/citrata, gdje smo pronašli jaku zaštitu od oksidativnog oštećenja izazvanog željezom. Mišje hipokampalne HT-22 stanice izložene preopterećenju željezom (24 h) pokazale su smanjenu održivost, što je bilo usko povezano s ranom disipacijom potencijala mitohondrijske membrane i smanjenjem ATP-a (Slika 2A-C, respektivno). Ovo sugerira da mitohondrijsko oštećenje doprinosi smrtnosti neurona. Zaista, pod našim uvjetima, očekuje se da će barem dio Fe(II) prenesenog u neurone doći do organela, budući da je neuronskoj smrti izazvanoj željezom prethodio gubitak mitohondrijske funkcije. Stoga je pokazano da preopterećenje željezom uzrokuje smrt HT-22 stanica mišjeg hipokampusa i fragmentaciju mitohondrija [41,42]. Isto tako, kontinuirana izloženost željezu povećava mitohondrijske razine ROS-a u stanicama dopaminergičkog neuroblastoma SHSY5Y [43]. Nadalje, opsežan priljev željeza u neurone hipokampusa, kao i oštećenje mitohondrija, potvrđeni su nakon izlaganja 100 uM željeza (36). Ovdje smo uočili da je Gos-inducirano očuvanje održivosti neurona hipokampusa na koje utječe željezo usko povezano s očuvanjem potencijala njihove mitohondrijske membrane i razina ATP-a.

Kao iu intaktnim stanicama, izravna izloženost mitohondrija fero-željezu izazvala je veliko oticanje organela, rasipanje membranskog potencijala i gubitak ATP-a (Slika 3A-C, tim redom). U ovom eksperimentalnom okruženju, Gos je uspio zaštititi mitohondrija preopterećenih željezom, što je izraženo očuvanjem gore navedenih parametara. U tom smislu, primijećeno je da su mitohondriji opterećeni mikromolarnom koncentracijom željeza prošli kroz otvaranje pora prijelazne propusnosti mitohondrija i disipaciju △Y na način koji je osjetljiv na kelaciju željeza, ali ne ovisi o antioksidativnom djelovanju katalaze |44]. Zanimljivo je da antioksidans Mito-Tempo štiti od oštećenja hipokampalnih neurona od preopterećenja željezom tako što čisti mitohondrijski superoksidni anionski radikal i čuva morfološki integritet mitohondrija i membranski potencijal [36]. Nedavno smo opisali antioksidativne učinke ovog flavonoida i njegovu sposobnost da zaštiti PC12 stanice od smrti izazvane kemijskom hipoksijom [29], gdje je zaključeno da je sposobnost hvatanja slobodnih radikala i antioksidativna sposobnost Gos-a djelomično uključena u zaštitu od željeza posredovanih HT-22 i oštećenje mitohondrija. Međutim, poboljšana učinkovitost Gos-a protiv lipoperoksidacije posredovane željezom u odnosu na lipoperoksidaciju posredovanu tertbutil hidroperoksidom (Slika 4A, B, redom) snažno sugerira da je njegova sposobnost interakcije sa željezom glavni mehanizam protiv oštećenja izazvanih željezom.

Kako bi se dodatno okarakterizirala interakcija Gos-Fe, provedeno je nekoliko pokusa bez stanica i mitohondrija. Uočili smo da kada je polifenol koinkubiran s Fe (II), koncentracija metalnih iona opada, dok je došlo do odgovarajućeg povećanja stope potrošnje kisika (Slika 5A-C). Ovi učinci sugeriraju da Gos uklanja Fe(II) iz citratnog kompleksa i oksidira ga u željezni oblik u procesu koji zahtijeva O2 kao akceptor elektrona. Posljedično, Gos potiče pad koncentracije Fe(II) koji može spriječiti hidroksilne radikale kroz Fentonove reakcije. Budući da kompleks Gos-Fe(II) omogućuje oksidaciju relevantnih redukcijskih sredstava kao što je askorbat, što rezultira stvaranjem/regeneracijom Fe(II), uspjeli smo pokazati da Gos inhibira redukciju Fe(II) posredovanu askorbatom. na Fe(II).

Hipoteza da Gos snažno stupa u interakciju sa željezom ovdje je također potvrđena spektroskopskim tehnikama i potkrijepljena prethodnim rezultatima gdje su različiti nizovi

Stehiometrija kompleksa Gos-željezo karakterizirana je masenom spektroskopijom spinske ionizacije [45].

Ovi rezultati dokazuju zaštitne učinke Gos-a protiv oštećenja neurona posredovanih željezom, vjerojatno interakcijom s ionima željeza, sprječavajući njegovu uključenost u katalitičko stvaranje reaktivnih vrsta kisika. Nadalje, ovo sugerira stvaranje prolaznog kompleksa prijenosa naboja između Fe(Ⅱ) i Gos, ubrzavajući Fe(II) oksidaciju i stvaranje stabilnijeg Fe(III)-Gos kompleksa koji ne može sudjelovati u fazi propagacije lipida peroksidacija. Štoviše, biološki relevantno redukcijsko sredstvo kao što je askorbat nije bilo u mogućnosti reducirati feri željezo u prisutnosti Gos, ograničavajući prooksidacijsku karakteristiku određenih flavonoida uključenih u ponovno cikliranje željeznih iona. [30]. Gos u mikromolarnim koncentracijama bio je učinkovitiji od klasičnih čistača u sprječavanju oksidacije 2-deoksiriboze posredovane željezom. Ova visoka učinkovitost može se pripisati stvaranju redoks-aktivnog Gos-Fe(II)/() kao što smo prethodno primijetili za druge polifenole koji su poboljšali svoje djelovanje kao antioksidansa nakon interakcije sa željezom u različitim in vitro paradigmama oksidativnog oštećenja [ 22, 46-48].

Utvrđeno je da kelirajuća sredstva koja sadrže kisik kao ligand (okso ligand, O2-) mogu kelirati željezo i pospješiti oksidaciju Fe(I), stabilizaciju Fe(II), te posljedično dovesti do smanjenja njegov redukcijski potencijal49]. Pri fiziološkom pH, kateholi lako tvore termodinamički stabilne bis komplekse s feri željezom, čemu pogoduju niske koncentracije liganada. Prisutnost kateholnog dijela u Gos strukturi sugerira sličan mehanizam interakcije sa željezom, što bi moglo objasniti postignutu zaštitu protiv željezom induciranih oštećenja neuronskih stanica i mitohondrija. S tim u vezi, također smo prethodno pokazali da mangiferin i gutiferon A stimuliraju oksidaciju feri željeza i sprječavaju redukciju feri željeza [23,24,26-28].

Sposobnost Gos da kelira željezo također može potaknuti signalne putove koji pridonose neuroprotekciji. Na primjer, enzimi domene prolil hidroksilaze (PHD), klasični enzimi koji modificiraju hidroksilaciju pod normoksijom inducibilni čimbenik hipoksije-lalpha(HIF-1o), identificirani su kao kritične mete kelatora željeza koji su klinički korisni u mnogim neurološki poremećaji [50,51]. To je razumljivo jer PHD ovisi o dvovalentnom željezu kao faktoru povezivanja [52]. Nekoliko gena koji su uključeni u neuroprotekciju regulira HIF-la, kao što su eNOS, VEGF i EPO[53]. Štoviše, aktivacija HIF-a koja proizlazi iz inhibicije PHD-a mogla bi spriječiti oštećenje mitohondrija posredovano oksidativnim stresom i apoptozu, neovisno o njegovoj ulozi faktora transkripcije [54].

Ferroptoza, nedavno karakterizirana o željezu regulirana stanična smrt, predložena je kao mehanizam kroz koji neuroni izloženi hemoragijskom oštećenju umiru [8]. Mitohondrijska disfunkcija nedavno je povezana sa smrću stanica feroptoze [55]. Stoga bi inhibicija feroptoze, koja spašava funkciju mitohondrija od oštećenja željezom, također mogla biti vjerojatan mehanizam za neuroprotekciju protiv neuroloških poremećaja posredovanih željezom zaštićenih Gos-om, što bi zavrijedilo daljnju pozornost. Moraju se provesti dodatna istraživanja o pretpostavljenim korisnim učincima Gos-a na in vivo životinjskim modelima neurodegeneracije povezane sa željezom, kako bi se predložio ovaj flavonoid kao terapeutska intervencija protiv oštećenja moždanog tkiva izazvanog deregulacijom homeostaze željeza.