Gomisin N inhibira melanogenezu kroz reguliranje signalnih putova PI3K/Akt i MAPK/ERK u melanocitima

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sažetak: Gomisin N, jedan od lignanskih spojeva pronađenih u Schisandri Chinensis je u raznim studijama pokazao da posjeduje antioksidativno, antitumorogeno i protuupalno djelovanje. Ovdje po prvi put izvještavamo o antimelanogenoj učinkovitosti Gomisina N kod sisavaca stanicama kao i u embrijima zebrica. Gomisin N značajno je smanjio sadržaj melanina bez stanične toksičnosti. Iako nije bio sposoban modulirati katalitičku aktivnost gljivatirozinazain vitro,Gomisin Nsmanjio razinu ekspresije ključnih proteina koji djeluju umelanogeneza. Receptor melanokortina 1 (MC1R) sniženo reguliran gomisinom N, adenilil ciklaza 2, transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF), tirozinaza,tirozinaza-protein-1(TRP-1) i protein povezan s tirozinazom-2 (TRP-2). Osim toga, stanice Melan-A tretirane Gomisinom N pokazale su povećane razine p-Akt i p-ERK, što implicira da aktivacija puteva PI3K/Akt i MAPK/ERK može funkcionirati tako da inhibiramelanogeneza. Također smo potvrdili da Gomisin N smanjuje proizvodnju melanina potiskivanjem ekspresije MITF-a,tirozinaza, TRP-1 i TRP-2u mišjim i ljudskim stanicama kao i u embrijima zebrica u razvoju. Zajedno, zaključujemo daGomisin Ninhibira sintezu melanina potiskivanjem ekspresije MITF-a i melanogenih enzima, vjerojatno kroz moduliranje putova PI3K/Akt i MAPK/ERK.

Ključne riječi:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogeneza; izbjeljivanje kože

cistanche imaju funkciju izbjeljivanja kože

1. Uvod

Melanin je pigment koji se nalazi u većini životinjskih organa uključujući kožu, kosu, oči, unutarnje uho, kosti, srce i mozak [1,2].Melanogenezaje složen proces u koji je uključeno više signalnih putova. Receptor melanokortina 1 (MC1R) je ključni regulator umelanogeneza, signalizirajući preko svojih liganda kao što su hormon koji stimulira melanocite (MSH) i adrenokortikotropni hormon (ACTH) [3]. Melanin kože biosintetiziraju melanociti u epidermisu, a zatim ga prenose u keratinocite, gdje imaju važnu ulogu u zaštiti kože apsorbirajući UV zračenje sunčevog svjetla i hvatajući reaktivne slobodne radikale [4,5]. Sinteza i prijenos melanina u koži i folikulima dlake regulirani su dostupnošću njegovih prekursora [6]. L-tirozin i L-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), glavni supstrati melanogenih enzima, također djeluju kao regulatori slični hormonima u melanogenezi [7]. S druge strane, prekomjerna proizvodnja melanina rezultira nepoželjnim kožnim problemima kao što su pjege i melazma [8,9]. Melanogeneza može utjecati na ponašanje normalnih i malignih melanocita moduliranjem elastičnih svojstava stanica [10]. Iako receptori za serotonin i melatonin izraženi u kožnim stanicama imaju ključnu ulogu u održavanju stanične homeostaze, prekomjerna proizvodnja melanina putem nekontroliranih hormonalnih promjena može uzrokovati patološka stanja u koži [11].

Stoga su uloženi veliki napori da se razjasne molekularni mehanizmi koji kontroliraju melanogenezu kao primarni korak u liječenju hiperpigmentiranih poremećaja kože. Osim toga, razne vrsteizbjeljivanje kožesredstva koja inhibiraju sintezu melanina identificirana su iz biljnih i nebiljnih ekstrakata i komercijalno se koriste u kozmeceutici [12,13]. Najčešće korištena sredstva za izbjeljivanje uključuju hidrokinon, mekinol, arbutin, kojičnu kiselinu, askorbinsku kiselinu i retinoičnu kiselinu [12,14]. Međutim, postoje različita ograničenja njihove uporabe u liječenju akutnih ili kroničnih simptoma hiperpigmentacije kod ljudi. Na primjer, hidrokinon, iako se dugo koristio za depigmentaciju od 1960-ih, može izazvati iritaciju kože i kontaktni dermatitis [15,16]. Također dovodi do oštećenja DNA povećanjem proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta i razvoja egzogene okronoze u stanicama sisavaca [17,18]. Drugi poznatitirozinazainhibitori poput kojiinske kiseline i askorbinske kiseline ne samo da imaju slabu penetraciju u kožu, stabilnost i učinkovitost u izbjeljivanju, već također mogu uzrokovati citotoksičnost, dermatitis i eritem zbog dugotrajne uporabe [19,20]. U tom smislu, postoji sve veća potreba za razvojem sigurnijih i učinkovitijih sredstava za izbjeljivanje za liječenje hiperpigmentacije ljudske kože. Prirodne biljke koje se koriste u tradicionalnoj medicini mogu pružiti alternativne izvore za prepoznavanje novih sredstava za izbjeljivanje koja kontroliraju ključne korake umelanogenezas manje ili bez nuspojava [21].

Schisandra chinensis, također poznata kao sjeverna bobica finog okusa, prirodno se nalazi u sjeveroistočnoj Kini, dalekoistočnoj Rusiji, Japanu i Koreji [22]. Ova se biljka dugo koristila za liječenje noćnog sljepila, opeklina kože, aseptičkih upala i bolesti jetre u tradicionalnoj istočnjačkoj medicini [23,24]. Pokazalo se da ekstrakt ploda S. chinensis i njegovi lignanski spojevi imaju različite farmakološke učinke u staničnim linijama miševa. Na primjer, šisandra A i C imaju antioksidativne učinke, dok šisandra B ima antifibrotičko, protuupalno, antioksidativno i antiapoptotičko djelovanje [25]. Još jedan spoj lignanaGomisin N(Slika 1A) zabilježeno je da suzbija apoptozu izazvanu oksidativnim stresom inhibicijom otpuštanja citokroma C iz mitohondrija u citoplazmu, cijepanjem kaspaze 3 i PARP-a i prijelazom mitohondrijske propusnosti izazvan Ca2 plus u H9c2 kardiomiocitima štakora [7,8]. Zanimljivo je da je nekoliko studija u kojima su korišteni mišji modeli i stanične linije ljudske kože otkrilo terapeutski potencijal S. chinensis za liječenje kožnih poremećaja. Lee et al. izvijestio je da metanolni ekstrakt ploda S. chinensis ublažava simptome kontaktnog dermatitisa smanjujući proizvodnju proupalnih citokina kao što su TNF- i IFN- kada se lokalno primjenjuje [8,24]. Kang i sur. pokazalo je da vodeni ekstrakt Schisandra Fructus inhibira aktivaciju IκB, potiskujući tako proizvodnju TNF-, IL-6 i GM-CSF u liniji ljudskih mastocita HMC-1 [26]. Ovi su nas nalazi doveli do pretpostavke da lignani S. chinensis mogu šire utjecati na funkcije stanica kože. U ovoj studiji nastojali smo istražiti navodne ulogeGomisin N, jedan od glavnih lignanskih spojeva u S. Chinensis, u regulacijimelanogeneza, čime se procjenjuje njegova potencijalna upotreba kao kozmeceutskog sredstva. Evo, javljamo toGomisin Ninhibira biosintezu melanina bez stanične toksičnosti u ljudskim i mišjim stanicama, kao i u embrijima zebrica.

2. Rezultati

2.1. Učinci Gomisina N na stvaranje melanina i vitalnost stanica

Kako bi se potvrdili učinci Gomisina N namelanogeneza, tretirali smo mišje melanocite s različitim koncentracijamaGomisin N72 h, a zatim procijenjene promjene u sadržaju melanina. Liječenje Gomisinom N smanjilo je sadržaj melanina i u normalnoj staničnoj liniji melanocita Melan-A i u stanicama melanoma B16F10 na način ovisan o dozi bez stanične toksičnosti (Slika 1B, C). Uočili smo da Gomisin N inhibira -MSH-induciranu proizvodnju melanina u stanicama B16F10, što je usporedivo s rezultatima dobivenim tretmanom PTU [27] (Slika 1C). Kako bi se procijenilo je li smanjenje melanina naGomisin Nliječenje je zbog smanjene aktivnosti tirozinaze, proveli smo L-DOPA test bojenja u normalnim ljudskim epidermalnim melanocitnim (NHEM) stanicama. Kao što je prikazano na slici 1E, NHEM stanice tretirane s Gomisinom N pokazale su smanjene razine L-DOPA u usporedbi s netretiranim stanicama. Međutim, inhibitorni učinak Gomisina N na proizvodnju melanina nije bio značajan u stanicama humanog melanoma MNT-1 (Slika 1D) .

2.2. Učinci gomisina N na aktivnost tirozinaze

Da se ispita da liGomisin Ninhibiratirozinazaaktivnost in vitro, koristili smo tirozinazu gljive i lizate stanica melanoma B16. Kojična kiselina, dobro poznati inhibitor tirozinaze, korištena je kao pozitivna kontrola. Kada je tretiran tirozinazom gljiva, dok je kojična kiselina značajno smanjila enzimsku aktivnost, Gomisin N nije izazvao nikakvu promjenu u pretvorbi L-DOPA u dopakrom (Slika 2A). Međutim, kada je tretiran stanicama melanoma B16, Gomisin N je rezultirao smanjenjem utirozinazaaktivnost staničnog lizata na način ovisan o dozi (Slika 2B). Štoviše, kada se zajedno tretira s -MSH u B16 stanicama,Gomisin Npreokrenuo je povećanje stvaranja dopakroma stimuliranog -MSH (Slika 3C). Posebno se čini da je Gomisin N učinkovitiji od Kojične kiseline u inhibiciji staničnihaktivnost tirozinazeB16 stanica na -MSH podražaj. Ova otkrića upućuju na to da inhibicijski učinak GomisinaN na proizvodnju melanina uočen u mišjim i ljudskim stanicama (Slika 1) nije posljedica njegove funkcije izravne inhibicije katalitičke aktivnosti tirozinaze. Međutim, još uvijek je moguće da Gomisin N regulira ekspresiju tirozinaze ili drugih proteina koji imaju ključnu ulogu umelanogeneza.

2.3. Učinci Gomisina N na inaktivaciju signalnog puta MC1R

Nastojali smo razjasniti temeljni mehanizam odgovoran za inhibitorni učinak Gomisina na proizvodnju melanina. To smo obrazložiliGomisin Nmogu regulirati signalne proteine ​​koji su uključeni umelanogenezai time inhibiraju sintezu melanina. Melanokortin 1 receptor (MC1R) je amelanocitni G protein spregnuti receptor koji funkcionira kao ključni regulator u sintezi melanina. Aktivacija MC1R njegovim ligandom -MSH ili adrenokortikotropnim hormonom (ACTH) dovodi do porasta adenilil ciklaze, što zauzvrat regulira unutarstanične razine cAMP [2,3]. Posljedično, transkripcijska razina MITF-a je povećana preko puta protein kinaze-C (PKA)/responzivnog element-veznog proteina (CREB) [2,28]. Kako bismo procijenili regulatorni učinak Gomisina N na signalni put MC1R, provjerili smo razine ekspresije MC1R i njegovih nizvodnih signalnih molekula nakon tretiranja stanica Melan-A s Gomisinom N. Primijetili smo da je Gomisin N značajno smanjio razinu proteina i MC1R i adenil ciklaze 2. na način ovisan o dozi (Slika 3A–C). Kao što se očekivalo,Gomisin N-tretirane stanice također su pokazale smanjene razine proteina MITF-a i njegovih poznatih ciljeva tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 (Slika 3A, D–G). Ova otkrića sugeriraju da Gomisin N inhibira enzime koji proizvode melanin inaktivacijom MITF-a putem signalnog puta MC1R.

2.4. Učinci gomisina N na fosforilaciju Akt i ERK1/2 u stanicama Melan-A

Poznato je da su putevi PI3K/Akt i MAPK/ERK uključeni u melanogenezu transkripcijskom ili posttranskripcijskom regulacijom MITF [29,30]. Kako bismo procijenili utječe li GomisinN na ove signalne putove, procijenili smo status fosforilacije Akt i ERK1/2 pomoću Western blot analize. Kao što je prikazano na slici 3H–J, liječenje visokom dozom (30 µM) odGomisin Nznačajno pojačao fosforilaciju i Akt i ERK. Ovi podaci pokazuju da je inhibitorni učinak gomisina N namelanogenezavjerojatno je povezan s putevima P13K/Akt i MAPK/ERK.

2.5. Gomisin N inhibira melanogenezu u embrijima zebrica

Zatim smo željeli ispitati je li Gomisin N učinkovit u inhibicijimelanogenezain vivo. U tu smo svrhu tretirali embrije zebrice s Gomisinom N tijekom 72 sata u koncentracijama od 1, 10, 20 i 30 µM, a zatim smo izmjerili razinu ekspresije melanogenih proteina. Uočili smo da liječenje Gomisinom N inhibira stvaranje melanina u razvoju embrija zebrice.Gomisin N-tretirani embriji pokazali su smanjenje sadržaja melanina na način ovisan o koncentraciji u usporedbi s netretiranom kontrolom (Slika 4). Također smo otkrili da su razine proteinatirozinaza, MITF, TRP-1 i TRP-2 bili su smanjeni tretmanom Gomisinom N (Slika 5). Ovi rezultati pokazuju da Gomisin N inhibira melanogenezu in vivo reguliranjem transkripcijskog faktora MITF i njegovih ciljevatirozinaza, TRP-1 i TRP-2.

2.6. Gomisin N poništio je melanogenezu izazvanu rapamicinom u ljudskom MNT-1

Iako je Gomisin N značajno inhibiraomelanogenezau stanicama Melan-A i B16, kao i u embrijima ribica inzebrica, nismo uočili njegov učinak na stanice melanoma ljudskog MNT-1. Očekivali smo da bi se učinak Gomisina N mogao otkriti u MNT-1 stanicama pod uvjetom da je melanogeneza pojačano regulirana odgovarajućim podražajem. Pokazalo se da rapamicin inducira melanogenezu povećanjem aktivnosti tirozinaze i razine proteina MITF, tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 [31], djelomično kroz aktivaciju autofagije [32]. Pratili smo razinetirozinaza, MITF,TRP-1 i TRP-2 u MNT-1 stanicama Western blot analizom, nakon kotretmana s Gomisin N andrapamicinom. Liječenje rapamicinom značajno je induciralo razine MITF, TRP-1 i TRP-2, ali nije imalo učinka natirozinazarazine (slika 6). Međutim, liječenje Gomisinom N značajno je poništilo učinke rapamicina na MITF, TRP-1 i TRP-2 na način ovisan o koncentraciji. Obrnuti učinak odGomisin Nprotiv rapamicina više obećava u koncentraciji od 20 i 30 µM nego 10 µM. Ovi rezultati sugeriraju da Gomisin N inhibiramelanogenezau ljudskim stanicama melanoma MNT-1 reguliranjem faktora transkripcije MITF i njegovih ciljeva TRP-1 i TRP-2.

3. Rasprava

Glavna funkcija melanina je zaštita stanica kože od UV zračenja [33-35]. Hiperpigmentacija, rezultat prekomjerne proizvodnje melanina u koži, uzrokuje neželjene kozmetičke probleme i povezana je s dermatitisom i rakom kože. Nekoliko je izvješća sugeriralomelanogenezakao važan cilj za liječenje metastatskog melanoma [36,37]. Stoga postoji sve veća potreba za razvojem antimelanogenih sredstava koja reguliraju melanogenezu bez stanične toksičnosti [38]. Nekoliko je putova uključenih u melanogenezu kože [39,40]. Nakon vezanja liganda, MC1R pojačava aktivnost adenilil ciklaze, što zatim povećava unutarstanične razine cAMP [41,42]. Za aktivaciju PKA/CREB puta ovisnu o cAMP-u naširoko se izvješćuje da povećava transkripcijske razine MITF-a, čime se pojačava sinteza melanina [43]. MITF djeluje kao glavni regulator triju glavnih melanogenih enzima tirozinaze, TRP-1 i TRP-2u kralješnjaka [3,21,44]. Ovi enzimi su transmembranski proteini smješteni u melanosomalnoj membrani melanocita. Tirozinaza regulira korak koji ograničava brzinumelanogenezapretvaranjem L-tirozinaze u L-DOPA [23]. TRP-1 i TRP-2 također igraju važnu ulogu u sintezi melanina, iako njihove funkcije nisu u potpunosti shvaćene.

U ovoj studiji, Gomisin N, lignanski spoj S. chinensis pokazao je aktivnost depigmentacije bez stanične toksičnosti. Gomisin N je inhibirao sintezu melanina u uzgojenim staničnim linijama sisavaca kao i u embrijima zebrica. Čini se da je Gomisin N učinkovitiji od pozitivne kontrole PTU u inhibiciji proizvodnje melanina u Melan-A stanicama (Slika 1B). Gomisin N smanjio je sadržaj melanina na način ovisan o koncentraciji. U usporedbi s netretiranom kontrolnom skupinom, 10 µM odGomisin Nsmanjio sadržaj melanina za oko 40 posto, bez stanične toksičnosti. Antimelanogena aktivnost 10-µM Gomisina N bila je usporediva s onom 100-µM PTU u stanicama Melan-A. Slično tome, čini se da je Gomisin snažniji od PTU u -MSH-aktiviranim B16F10 stanicama, gdje su učinci 5- i 10-µM Gomisina N usporedivi s onima od 10- i {{12 }}µM PTU (Slika 1C). NHEM stanice tretirane Gomisinom N pokazale su smanjene razine L-DOPA, što sugerira da GomisinN inhibiratirozinazaaktivnost u uzgojenim stanicama (Slika 1E). Ova su nas otkrića dovela do daljnjeg istraživanja temeljnog mehanizma kojim Gomisin N inhibira melanogenezu.

Ispitali smo je liGomisin Nizravno modulira katalitičku aktivnosttirozinazain vitro. Za razliku od Kojic kiseline, Gomisin N nije pokazao inhibitorne učinke na aktivnost tirozinaze gljiva (Slika 2A). Međutim, aktivnost stanične tirozinaze u lizatima stanica melanoma B16 značajno je smanjena Gomisinom N i sa i bez tretmana -MSH (Slika 2B,C). Utvrđeno je da je inhibicija aktivnosti stanične tirozinaze Gomisina N na podražaj -MSH značajnija od one kod pozitivne kontrole Kojične kiseline (Slika 2C).

Pretpostavili smo da bi se antimelanogena funkcija Gomisina N mogla dogoditi putem transkripcijske ili posttranskripcijske regulacije tirozinaze i proteina povezanih s tirozinazom (TRPs). Da bismo to potvrdili, izmjerili smo razine ekspresije signalnih molekula u putu MC1R, glavnoj odrednici za količina i kvaliteta proizvodnje melanina u melanocitima. Očekivano, primijetili smo da Gomisin N smanjuje razine MC1R i adenilil ciklaze 2 u stanicama Melan-A (Slika 3A–C). Nadalje,Gomisin Nsmanjio je ekspresiju MITF-a i njegovih ciljnih proteina uključujući tirozinazu, TRP-1 i TRP-2 (Slika 3A,D–G). Ovi rezultati sugeriraju da su smanjene razine sadržaja melanina nakon liječenja Gomisinom N rezultat deaktivacije puta MC1R.

S druge strane, putevi PI3K/Akt i MAPK/ERK mogu fosforilirati MITF i time mogu posttranskripcijski modulirati njegovu aktivnost [45]. Međutim, ukupni učinak aktivacije puteva PI3K/Akt i MAPK/ERK umelanogenezaje kontroverzan. I PI3K/Akt i MAPK/ERK putevi su konstitutivno aktivirani u ljudskim melanomima zbog akumuliranih mutacija [46]. Poznato je da depigmentacija u Mel-Ab stanicama posredovana C2-ceramidom nastaje smanjenjem razina p-Akt [47]. Postoji nekoliko prirodnih spojeva koji aktiviraju melanogenezu povećanjem razine p-ERK u stanicama melanoma B16 [28]. Nasuprot tome, također postoje dokazi da povišene razine p-ERK i p-Akt inhibiraju sintezu melanina [28,48]. Složenost u regulaciji melanogeneze može se djelomično objasniti činjenicom da fosforilacija pojačava transkripcijsku aktivnost MITF-a, ali istovremeno inducira razgradnju MITF-a ovisnu o sveprisutnosti proteosoma [26,49-51]. Naši su podaci pokazali da su i razine p-Akt i p-ERK bile regulirane naviše u stanicama Melan-A tretiranim Gomisinom N (Slika 3H–J). To implicira da putevi PI3K/Akt i MAPK/ERK mogu doprinijeti inhibiciji proizvodnje melanina.

Nadalje smo potvrdili antimelanogenu aktivnost Gomisina N u modelu zebrice in vivo. Embriji zebrice tretirani Gomisinom N pokazali su značajno smanjenje pigmentacije melanina (Slika 4). Osim toga, Gomisin N značajno je smanjio razinetirozinaza, MITF, TRP-1 i TRP-2 u razvoju embrija zebrice. Ovi nalazi zajedno sugeriraju daGomisin Ninducira depigmentaciju regulacijom ekspresije MITF-a i melanogenih enzima in vivo. Antimelanogena aktivnost Gomisina N dodatno je potvrđena u stanicama ljudskog melanoma MNT-1 stimuliranim rapamicinom. Iako je Gomisin N rezultirao samo malim promjenama u sadržaju melanina u MNT-1 stanicama (Slika 1D), bio je učinkovit u preokretu regulacije MITF-a, TRP-1 i TRP-2 izazvane rapamicinom u način ovisan o koncentraciji (Slika 6A,C–E). Uzeti zajedno, regulatorni učinakGomisin Nna MITF i melanogenim enzimima ponovljivo je pronađen u mišjim i ljudskim stanicama kao i u embrijima ribica zebrica.

Ukratko, ovo djelo sugerira da bi Gomisin N mogao imati veliki potencijal kao romanizbjeljivanje kožeagent. Čini se da gomisin N inhibiramelanogenezapotiskivanjem ekspresije MITF-a putem MC1R puta, umjesto izravne modulacije katalitičke aktivnostitirozinazaiTRPs. Iako detaljne mehanizme tek treba razjasniti, depigmentacija izazvana Gomisinom N vjerojatno je povezana s aktivacijom puteva PI3K/Akt i MAPK/ERK (Slika 7).

4. Materijali i metode

4.1. Materijali

RPMI1640 je kupljen od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, SAD). Dulbeccov modificirani Eagleov medij (DMEM), fetalni goveđi serum (FBS) i penicilin-streptomicin (PS) nabavljeni su od Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Medij za rast melanocita kupljen je od PromoCell (Heidelberg, Njemačka). Fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetat (TPA), Kojična kiselina, 1-fenil-2-tiourea (PTU), tirozinaza gljiva, 3,{{ 9}}dihidroksi-l-fenilalanin (L-DOPA), -MSH, dimetil sulfoksid (DMSO) i paraformaldehid nabavljeni su od SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, SAD).Gomisin Nspoj je osigurao Chul Young Kim (Sveučilište Hanyang, Ansan, Koreja). Rapamicin je nabavljen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD).

4.2. Kultura stanica

Mišja stanična linija melanoma B16F10 osigurana je od Korean Cell Line Bank (Seul, Koreja). Mišje melanocitne stanice Melan-A [52] bile su velikodušan dar dr. Byeong Gon Lee (SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin -si, Koreja). Ljudske stanice melanoma MNT-1 velikodušno je osigurao Aeyeong Lee (Kolaž medicine na Sveučilištu Dongguk, Goyang-si, Koreja). Primarni normalni ljudski epidermalni melanociti (NHEM) kupljeni su od PromoCell (Heidelberg, Njemačka). Stanice Melan-A uzgajane su u mediju RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, SAD) dopunjenom s 10 posto FBS, 1 posto PS i 200 nM TPA. DMEM dopunjen s 10 posto FBS i 1 posto PS korišten je za održavanje stanica Melan-A i NHEM stanica. Sve su stanice inkubirane na 37 ◦C u inkubatoru s 5 posto CO2.

4.3. Mjerenje sadržaja melanina

Stanice Melan-A nasađene su u 24-pločicu s jažicom (1 × 105 stanica/jažici), tretirane sGomisin N, a zatim inkubirana 72 h. Nakon 72 h, sadržaj melanina je izmjeren kao što je prethodno opisano [53]. Ukratko, nakon uklanjanja medija kulture, stanice su isprane tri puta s PBS. Nakon toga je u svaku jažicu dodana otopina natrijevog hidroksida (1 mL, 1 N) kako bi se otopio melanin. Apsorbancija na 405 nm izmjerena je pomoću čitača mikropločica. Ovaj je test ponovljen sa stanicama B16F10 (2 × 104 stanica/jažici) i MNT-1 stanicama prema istoj metodi.

4.4. Western Blot analiza

Stanice Melan-A nasađene su u zdjelice od 100 mm (1 × 106 stanica/posudici) i tretirane s 1, 5 ili 10 µMGomisin Ntri dana na 37 ◦C. Stanice su isprane s PBS-om i zatim sakupljene strugačem. Odvojene stanice su stavljene u 1 ml PBS-a i centrifugirane na 7500 okretaja u minuti tijekom 5 minuta. Nakon uklanjanja gornje otopine, stanične pelete su lizirane puferom za lizu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 posto SDS, 150 mM NaCl, 1 posto NP-40, 0,02 posto natrijevog azida, 0,5 postotnog natrijevog deoksikolata, 100 µg/mL PMSF-a, 1 g/mL aprotinina) tijekom 24 sata na 4 ◦C. Ukupni proteini ekstrahirani su pomoću ultracentrifuge na 12,000 okretaja u minuti tijekom 30 minuta na 4°C. Sadržaj proteina mjeren je Bradfordovim testom. Proteini (30 µg) su odvojeni pomoću 10 postotnog natrijevog dodecil sulfat-poliakrilamidnog gel elektroforeze (SDS-PAGE) gela i prebačeni na anitroceluloznu membranu. Membrana je blokirana 1 h s 5 posto obranog mlijeka u tris-puferiranoj fiziološkoj otopini s Tweenom-20 (TBST), a zatim je inkubirana 12 h na 4 ◦C s primarnim protutijelima koja ciljaju -tubulin (Santa Cruz, CA, SAD ), MITF (stanična signalizacija, Danvers, MA, SAD), tirozinaza (stanična signalizacija), ERK (stanična signalizacija), fosfo-ERK (stanična signalizacija), AKT (stanična signalizacija), fosfo-AKT (stanična signalizacija), MC1R ( Santa Cruz), adenilil ciklaze 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) i TRP-2 (Santa Cruz). Nakon uklanjanja primarnih antitijela, membrane su isprane tri puta s TBST i inkubirane sa sekundarnim antitijela (zečji anti-kozji IgG-HRP; mišji anti-zečji HRP, Santa Cruz) tijekom 1 sata. Membrane su tretirane pojačanim kemiluminiscencijskim reagensom pomoću ChemiDoc XRS plus sustava za oslikavanje (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). Denzitometrijska analiza traka provedena je korištenjem softvera Image MasterTM 2D Elite (verzija 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, SAD).

4.5. Određivanje aktivnosti tirozinaze

Procijeniti inhibitorni učinak Gomisina N na gljivetirozinazaaktivnosti, tirozinaza je inkubirana s 1, 5 ili 10 µMGomisin Nili pozitivnu kontrolu kojičnu kiselinu. Svaki uzorak je otopljen u metanolu. L-DOPA (8,3 mM) i tirozinaza gljive (125 U) razrijeđene su u 80 mM fosfatnog pufera (pH 6,8). 40 µL svakog uzorka i 120 µL L-DOPA pomiješano je u 96-ploči s jažicama, nakon čega je dodano 40 µL razrijeđene tirozinaze gljive. Ploče su zatim inkubirane 15 minuta, a apsorbancija je izmjerena na 490 nm pomoću čitača mikropločica.

Tirozinazaaktivnost u lizatima stanica melanoma B16 mjerena je sa ili bez tretmana -MSH, kao što su prethodno opisali Ohguchi et al. [54], s malim izmjenama. Stanični lizat je pripremljen kao što je gore opisano u dijelu Western Blot analize. Ukupni proteini u supernatantu izmjereni su Bradfordovim testom korištenjem goveđeg serumskog albumina kao standarda [55]. Jednaka količina proteina je razrijeđena i korištena za analizu aktivnosti tirozinaze.

inhibiraju aktivnost tirozinaze

4.6. L-DOPA bojanje u NHEM stanicama

NHEM stanice su nasađene u {{0}}ploču s jažicama i inkubirane 72 h s Gomisinom N. Stanice su fiksirane s 4 posto paraformaldehida 40 minute, nakon čega je uslijedio tretman s 0,1 posto Triton X{ {6}} 2 min. L-DOPA (0,1 posto) je dodan u svaku jažicu, nakon čega je uslijedila inkubacija 2 h. Nakon uklanjanja otopine, stanice su isprane dva puta s PBS-om. Slike su fotografirane mikroskopom.

4.7. Eksperimenti sa zebricama

Embriji zebrice dobiveni su iz Zebrafish Resource Bank (Daegu, Koreja). Embriji su tretirani Gomisinom N 72 sata. Učinak depigmentacijeGomisin Nna embrijima ribica zebra promatrana je pod stereomikroskopom. Za Western blot analizu, embriji tretirani Gomisinom N su lizirani pomoću pufera za lizu, iz kojeg su pripremljeni ukupni proteini kao što je gore spomenuto.

5. Zaključci

Naš rezultat podupire mišljenje da Gomisin N ima veliki potencijal za upotrebu kao funkcionalna hranaizbjeljivanje kožeagent.Gomisin Nje jedan od glavnih spojeva lignana u S. Chinensis. Zapravo, S. Chinensis je biljni lijek koji se koristi za liječenje mnogih ljudskih bolesti. Međutim, potrebna su daljnja epidemiološka ispitivanja kako bi se dokazala sigurnost Gomisina N na koži. Posljedično, in vivo studije i klinička ispitivanja moći će jasnije pokazati učinkovitost GomisinaN. Zaključno, ova studija sugerira daGomisin Nmože biti potencijalno hipopigmentno sredstvo i prirodnoizbjeljivanje kožekandidat za kozmetičku industriju.

cistanche poboljšavaju izbjeljivanje

Reference

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Utjecaj epidermalnog melanina na objektivna mjerenja boje ljudske kože. Pigment Cell Res. 2002., 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signalni putovi u melanogenezi. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentacija melanina u koži sisavaca i njezina hormonska regulacija. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Uloga melanina kao zaštitnika protiv slobodnih radikala u koži i njegova uloga kao pokazatelja slobodnih radikala u kosi. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008., 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Sadržaj melanina u melanomametastazama utječe na ishod radioterapije. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentacija folikula dlake.J. Istražite. Dermatol. 2005., 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

8. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirozin i L-dihidroksifenilalanin kao hormonski slični regulatori funkcija melanocita. Melanoma pigmentnih stanica Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Nedavni napredak u patogenezi melazme. Melanoma pigmentnih stanica Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. Biologija hiperpigmentacijskih sindroma. Melanoma pigmentnih stanica Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT Uloga pigmenta melanina u melanomu. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Kožni serotoninergički/melatoninergički sustav: Osiguravanje mjesta pod suncem. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Šarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Kozmeceutika za hiperpigmentaciju: Što je dostupno? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.; Passeron, T.; Choi, W.; et al. Regulacija pigmentacije ljudske kože i odgovora na ultraljubičasto zračenje.Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Postupalna hiperpigmentacija: pregled epidemiologije, kliničkih značajki i mogućnosti liječenja u boji kože. J. Clin. Estet. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR Pregled modulacijskih učinaka oleinske kiseline u zdravlju i bolesti. Mini. Rev. Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

17. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Pregled i mehanizam sredstava za depigmentaciju i posvjetljivanje kože. fitoter. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Genotoksičnost izazvana hidrokinonom i oksidativno oštećenje DNA u HepG2 stanicama. Chem. Biol. Interakcija. 2008., 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hidrokinon: Onečišćenje okoliša, toksičnost i odgovori na mikrobe. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Pripravci za posvjetljivanje kože i kontroverza oko hidrokinona. Dermatol. Ther. 2007, 20, 308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Saponificirano ulje noćurka smanjuje melanogenezu u stanicama melanoma B16 i smanjuje UV-induciranu pigmentaciju kože kod ljudi. Lipidi 2010,45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Prirodni proizvodi i tradicionalna medicina: Okretanje paradigme. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

23. Panossian, A.; Wikman, G. Farmakologija Schisandra Chinensis Bail: Pregled ruskih istraživanja i upotrebe u medicini. J. Ethnopharmacol. 2008., 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Blagotvorni učinci Schisandrina B na srčanu funkciju u mišjem modelu infarkta miokarda. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Učinci SchisandraChinensis Turcz. voće na kontaktni dermatitis izazvan dinitrofluorobenzenom kod miševa. Mol. Med. Izvješće 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Pa ja.; Jeon, JH Zaštitni učinci ekstrakta ploda Schisandra Chinensis i njegovih lignana protiv kardiovaskularnih bolesti: pregled molekularnih mehanizama. Fitoterapia 2014, 97, 224-233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Dakle, HY; Choo, YK; Kweon, OH; et al. Učinci vodenog ekstrakta Schisandra Fructus na oslobađanje citokina iz linije ljudskih mastocita. J. Med. Hrana 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

28. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Inhibicija proizvodnje mikronukleusa izazvane L-tirozinom feniltioureom u stanicama ljudskog melanoma. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Učinak cirsimaritina na induciranje melanogeneze putem povećanja transkripcijskog faktora povezanog s mikroftalmijom i ekspresije tirozinaze. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

30. Bušća, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasposreduje cAMP-ovisnu aktivaciju kinaza reguliranih izvanstaničnim signalom (ERK) u melanocitima. EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Bušća, R.; Ballotti, R. Cyclic AMP ključni glasnik u regulaciji pigmentacije kože. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Indukcija melanogeneze rapamicinom u ljudskim MNT-1 stanicama melanoma. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Laki proteinski lanac 3 povezan s mikrotubulama uključen je u melanogenezu putem regulacije MITF ekspresije u melanocitima. Sci. Izvješće.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Sluh, VJ, ml. Genetski poremećaji pigmentacije. Adv. Pjevušiti. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

35. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swope, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -hormon koji stimulira melanocite suzbija oksidativni stres preko ap53-posredovanog signalnog puta u ljudskim melanocitima. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomi na prvi pogled. J. Cell Sci. 2008, 121, 3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

37. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogeneza utječe na sveukupno preživljenje i preživljenje bez bolesti kod pacijenata sa stadijem III i IV melanoma. Pjevušiti. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

38. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetović, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.; Seagroves, TN Uloga melanogeneze u regulaciji ponašanja melanoma: Melanogeneza dovodi do stimulacije ekspresije HIF-1 i popratnih puteva ovisnih o HIF-u. Arh. Biochem. Biophys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Inhibitorni učinak melanogeneze ekstrakcije Gastrodia elata u stanicama melanoma HM3KO. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Cijena, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kinaza povezuje transkripcijski faktorMicrophthalmia s c-Kit signalizacijom u melanocitima. Nature 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Price, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DELineage-specifična signalizacija u melanocitima. C-kit stimulacija regrutira p300/CBP na mikroftalmiju.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983-17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene product as a signal transducer in cAMP-induced diferencijacija melanocita. J. Cell Biol. 1998, 142, 827–835. [CrossRef] [PubMed]

43. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.; Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Ograničena dimerizacija leucinskog zatvarača i specifičnost prepoznavanja DNA glavnog regulatora melanocita MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Od gena do lijekova: ciljane strategije za melanom. Nat. Rev. Cancer 2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Inhibicijski učinci resveratrola na sintezu melanina u pigmentaciji izazvanoj ultraljubičastim zračenjem B u koži zamorca. Biomol. Ther. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibicija melanogeneze galnom kiselinom: Moguća uključenost PI3K/Akt, MEK/ERK i Wnt/-katenin signalnih putova u stanicama B16F10. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. RAS/RAF/MEK/ERK i PI3K/PTEN/AKT signalizacija u progresiji i terapiji malignog melanoma. Dermatol. Res. Vježbajte. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, DS; Kim, SY; Mjesec, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide inhibira proliferaciju stanica putem inaktivacije AKT/PKB i smanjuje sintezu melanina u Mel-Ab stanicama. Pigment Cell Res. 2001., 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CH. Donja regulacija sinteze melanina pomoću A i njegova primjena na in vivo model munje. J.Investig. Dermatol. 2008., 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF kod melanoma: Mehanizmi iza njegove ekspresije i aktivnosti. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC Sphingosin-1-fosfat smanjuje sintezu melanina putem kontinuirane aktivacije ERK i kasnije degradacije MITF-a. J. Cell Sci. 2003, 116, 1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Da, ET; Medrano, EE Regulacija razine proteina faktora transkripcije MITF povezanog s mikroftalmijom povezivanjem s enzimom hUBC9 koji konjugira teubikvitin. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Linija netumorogenih mišjih melanocita, singenetika s B16 melanomom i zahtijevaju promotor tumora za rast. Int. J. Rak 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogeneza inhibira disanje u stanicama melanoma B16-F10 dok povećava sadržaj mitohondrijskih stanica. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Ilija, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol kao potentni inhibitor tirozinaze iz roda Gnetum. Biosci. biotehnologija. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Inhibicija aktivnosti tirozinaze i pigmentacije melanina pomoću2-hidroksitirozola. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]