Taloženje amiloida P u serumu je osjetljiva i specifična značajka glomerulopatije nalik membrani s maskiranim IgG Kappa naslagama
Mar 04, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 i John M. Arthur2
KLJUČNE RIJEČI:glomerulonefritis; maskirane naslage; masovna spektrometrija; glomerulopatija slična membrani; subepitelne naslage
Cistanche može poboljšati rad bubrega
Membranozna glomerulopatija s maskiranim IgG kappa depozitima (MGMID) je nedavno opisani obrazac glomerulonefritisa s jedinstvenom histopatologijom. Uzorak je karakteriziran subepitelnim i/ili mezangijalnimimunnaslage koje su "zamaskirane", za bojenje imunoglobulina rutinskom imunofluorescencijom, ali snažno boje za IgG i kapa laki lanac nakon digestije proteazama. Bolesnici s ovim obrascem glomerulonefritisa najčešće su mlade žene s proteinurijom i nejasnom poviješću autoimune bolesti poput niskog titra antinuklearnih protutijela. Ovdje smo usporedili profil masene spektrometrije laserski snimljenih mikrodiseciranih glomerula iz devet MGMID biopsija bubrega s osam biopsija koje pokazuju druge obrasce membranske glomerulopatije. Protein koji je najznačajnije povećan u MGMID-u bio je serumski amiloid P. Imunobojenje je pokazalo serumski amiloid P kolokaliziran s IgG u glomerulima MGMID-a, ali ne i s membranskom glomerulopatijom povezanom s PLA2R. Serumski amiloid P bio je pozitivan u glomerulima svih 32 MGMID biopsije, ali negativan u biopsijama drugih tipova membranskih glomerulopatija kao što su one povezane s PLA2R i THSD7A. Među 173 biopsije bile su četiri biopsije s bojanjem glomerularnog seruma amiloida P koje nisu ispunile kriterije za MGMID ili amiloidozu. Sve četiri od ovih biopsija s pozitivnim bojanjem amiloida P u serumu imale su membranski obrazac glomerulopatije s IgG kappa naslagama koje su se od MGMID-a razlikovale samo nedostatkom "maskiranja". Dakle, pozitivno bojenje unutar glomerularnih naslaga za serumski amiloid identificira jedinstveni oblik glomerulonefritisa koji vjerojatno dijeli zajednički patofiziološki mehanizam bolesti.
Glomerulopatija slična membrani s maskiranim IgG kapa depozitima (MGMID) histopatološki je obrazac glomerulonefritisa opisan 2014., što je bio prvi opis onoga što je nazvano maskiranim glomerularnim depozitima.1 Karakteristična histopatologija ove bolesti uključuje prisutnost mezangijalnih i subepitelnih naslage s ograničenjem IgG kappa. Zanimljivo, iako je bojenje komponente komplementa 3 (C3) često vidljivo rutinskom imunofluorescencijom na smrznutom tkivu, Ig bojenje često maskira, što znači da pokazuje lažno negativno bojenje rutinskom imunofluorescencijom, ali pozitivno bojenje kada se ponavlja na tkivu ugrađenom u parafin nakon digestije proteazama. Dakle, osim ako patolog ne održava visok indeks sumnje za ovaj entitet, može se pogrešno dijagnosticirati kao C3 glomerulopatija. Ostali entiteti za koje je opisano da pokazuju ovaj fenomen maskiranja u glomerularnim naslagama uključuju membranoproliferativni glomerulonefritis s maskiranim monotipskim naslagama Ig i krioglobulinemijski glomerulonefritis.2,3
Pacijenti kod kojih je biopsijom otkriven MGMID najčešće su mlade žene<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 posto) bili su negativni na monoklonske Igs elektroforezom proteina u serumu, a nisu primijećeni slučajevi povezani s temeljnim hematološkim zloćudnim tumorom.4
Pretpostavlja se da zajednički kliničko-patološki nalazi među pacijentima s MGMID-om mogu biti indikativni za zajednički molekularni patofiziološki mehanizam koji pokreće njihovu bolest. Naša namjera pri prvom izvješćivanju o ovom entitetu bila je definirati kohortu za daljnju analizu.1 Ovdje opisujemo prisutnost proteinske serumske amiloidne p komponente (SAP) koja se nalazi jedinstveno u naslagama MGMID glomerula. Imunološko bojenje na SAP u glomerularnim naslagama osjetljiva je i specifična tehnika za dijagnozu MGMID-a koja također pruža uvid u patogenezu.
Slika 1|Serumska amiloidna P-komponenta (SAP) značajno je obogaćena u mikrodiseciranim glomerulima pacijenata s glomerulopatijom sličnom membrani s maskiranim IgG kappa naslagama. Za statističku analizu korištene su normalizirane apsolutne vrijednosti kvantifikacije temeljene na intenzitetu iz MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Njemačka). Isprekidane linije prikazuju heurističke granice za promjenu savijanja i P-vrijednost. (a) Dijagram vulkana koji uspoređuje 3 membranska slučaja s pozitivnim receptorom fosfolipaze A2 (PLA2R) s ostalima identificira 2 proteina koji su jasni odstupnici u gornjem desnom kvadrantu. (b) Dijagram vulkana koji uspoređuje 2 pozitivna membranska slučaja s domenom 7A (THSD7A) koja sadrži domenu trombospondina tipa 1 s ostalima identificira 2 proteina koji su jasni odstupnici s THSD7A koji pokazuje najveću promjenu puta. (c) Dijagram vulkana koji uspoređuje uzorke membranozne glomerulopatije s maskiranim IgG kappa naslagama sa svim drugim tipovima membranskih slučajeva identificira 6 proteina koji su jasni odstupnici u gornjem desnom kvadrantu. C6, komponenta komplementa 6; C7, komponenta komplementa 7; CFHR1, protein 1 povezan s faktorom komplementa H; HP1BP3, heterokromatin protein 1 vezujući protein 3; HPRT1, hipoksantin fosforiboziltransferaza 1; IGHG3, Ig teški konstantni gama 3.
REZULTATI
Masena spektrometrija mikrodiseciranih glomerula snimljenih laserom
Analiza masene spektrometrije mikrodiseciranih glomerula snimljenih laserom iz 9 slučajeva MGMID-a uspoređena je s 8 slučajeva membranske glomerulopatije (MG) uključujući 3 slučaja MG-a pozitivnog na receptor fosfolipaze A2 (PLA2R), 2 slučaja 7A domene trombospondina tipa 1 ( THSD7A)–pozitivna MG, i 3 slučaja lupus MG. U ovoj analizi identificirano je ukupno 1695 proteina. Provedena je analiza dokaza principa kako bi se testiralo mogu li se proteini uključeni u patogenezu bolesti MG otkriti spektrometrijom mase. Za svaki poznati membranski tip, razlika u obilju proteina uspoređena je s preostalim skupinama korištenjem normaliziranih vrijednosti apsolutne kvantifikacije temeljene na intenzitetu (iBAQ). Statistička analiza provedena je pomoću Welchovog t-testa, a rezultati su vizualizirani na dijagramu vulkana. PLA2R je bio znatno obilniji u slučajevima MG-a povezanog s PLA2R-om i pokazao je najjaču promjenu nabora (Slika 1a). THSD7A pokazao je najjače promjene puta u MG-u povezanom s THSD7A, iako s većom P-vrijednošću zbog male veličine uzorka u ovoj skupini (n=2; Slika 1b). Sveukupno, ova analiza dokaza principa pokazala je da spektrometrija mase mikrodiseciranih glomerula snimljenih laserom može identificirati proteine značajne za patogenezu bolesti kod membranske glomerulopatije.
Zatim smo ovim pristupom pokušali identificirati proteine potencijalno uključene u patogenezu MGMID-a. Ukupno 6 proteina bilo je znatno obilnije u uzorcima MGMID u odnosu na druge skupine (Tablica 1). Protein s najvećom promjenom puta bio je SAP (Slika 1c). Preostali proteini sastojali su se od IgG Kappa, 3 proteina komplementa i proteina heterokromatina 1–vezujućeg proteina 3 (HP1BP3). SAP je smatran najboljim kandidatom jer je otkriven u svim MGMID uzorcima i pokazao je najveću razliku u obilju u odnosu na uzorke koji nisu MGMID. Svi Ig identificirani masenom spektrometrijom u laserski snimljenim mikrodiseciranim glomerulima iz slučajeva membranozne glomerulopatije s IgG kappa naslagama prikazani su u Dodatnoj tablici S1. Spektralni brojevi uzorkovanja svih proteina koji su pokazali $1 log2 povećanu zastupljenost u MGMID uzorcima i P-vrijednost #0.1 prikazani su u Dodatnoj tablici S2.
Cistanchemože poboljšatibubregfunkcija
SAP bojenje u slučajevima membranozne glomerulopatije
Poliklonsko zečje protutijelo protiv SAP proteina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) pokazalo je snažno pozitivno bojenje duž glomerularnih bazalnih membrana slučajeva s MGMID-om koji je kolokaliziran s IgG konfokalnom analizom. SAP nije pokazao kolokalizaciju s IgG u glomerulima iz MG-a povezanog s PLA2R (Slika 2). Poliklonsko zečje protutijelo protiv HP1BP3 testirano je u 4 biopsije s MGMID-om i pokazalo je negativno bojenje u glomerularnim naslagama u sva 4 slučaja.
Bojanje SAP-om provedeno je na ukupno 211bubregbiopsijes glomerulonefritisom (Tablica 2). Ukupno 36 slučajeva s depozitima imunološkog tipa obojeno je pozitivno na SAP. Svi slučajevi koji su obojeni pozitivno dijelili su određene histopatološke značajke uključujući prisutnost mezangijalnih i subepitelnih naslaga s IgG kappa restrikcijom i bez endokapilarnih ili membranoproliferativnih promjena svjetlosnim mikroskopom. SAP je bio negativan u svim slučajevima, s maskiranim depozitima koji nisu bili MGMID, uključujući 3 slučaja krioglobulinemijskog glomerulonefritisa i 3 slučaja maskiranog membranoproliferativnog glomerulonefritisa. Također je bio negativan u svih 19 slučajeva proliferativnog glomerulonefritisa s depozitima monoklonskog Ig (PGNMID), uključujući slučajeve s IgG1 kapa (4 slučaja), IgG2 lambda (1 slučaj), IgG 3 kapa (8 slučajeva) i IgG3 lambda (6 slučajeva ). Svih 30 slučajeva poliklonske membranske glomerulopatije (PLA2R, THSD7A, lupus i segmentalna) bili su negativni na SAP. Dodatni oblici glomerulonefritisa također su proučavani i bili su negativni. Među glomerulonefritisom povezanim s infekcijom bilo je 7 pozitivnih na IgG bojenje i 6 s dokazima subepitelnih naslaga kvrge. Kao što se očekivalo, svih 6 slučajeva amiloidoze pokazalo je pozitivno bojenje amiloidnih naslaga. Međutim, mrljasti uzorak taloženja bio je u oštrom kontrastu sa granularnim mrljama prisutnim u slučajevima MGMID-a. Reprezentativne fotomikrografije glomerula na SAP mrlji za niz različitih bubrežnih bolesti prikazane su na Dodatnoj slici S1.
Sva 32 slučaja prethodno identificirana kao MGMID bila su pozitivna na SAP. Osim toga, bilo je pozitivno bojenje na SAP u glomerulima iz 4 od 25 slučajeva membranske glomerulopatije s monotipskim taloženjem IgG koji nije maskiran rutinom
imunofluorescencija, uključujući 4 od 13 slučajeva s IgG1 kapa, 0 od 2 slučaja s IgG1 lambda, 0 od 5 slučajeva s IgG2 kapa, 0 od 4 slučaja s IgG3 kapa i {{ 12}} od 1 slučaja s IgG4 kappa. Sveukupno, 32 od 36 (89 posto) SAP-pozitivnih glomerulopatija bile su maskirane i uklapale su se u kategoriju MGMID, dok su ostala 4 od 36 (11 posto) bila razotkrivena i dijagnosticirana kao MG s IgG1 kappa naslagama. Pacijenti s monotipskom membranskom glomerulopatijom koja se nije maskirala, ali su bili pozitivni na SAP, imali su prosječnu dob od 33 godine, s omjerom žena i muškaraca od 4:0. Slučajevi s monotipskom membranskom glomerulopatijom koja se nije maskirala, ali je bila negativna na SAP, imali su prosječnu dob od 59,3 godine s omjerom žena i muškaraca 15:4.
Tablica 1|Proteini su značajno povećani u glomerulima bolesnika sglomerulopatija slična membranis maskiranim IgG kappa naslagama, kao što pokazuje masena spektrometrija
Reaktivnost seruma na SAP
Serumi 22 pacijenta s MGMID-om, 12 s PLA2R-pozitivnom membranskom glomerulopatijom i 6 normalnih kontrola testirani su na IgG reaktivnost na SAP pomoću enzimski vezanog imunološkog testa (ELISA). Iako je postojala određena varijabilnost među pacijentima u svakoj skupini, nije bilo značajne razlike u reaktivnosti IgG prema SAP između skupina (dodatna slika S2).
Slika 2|Kolokalizacija IgG i serumske amiloidne P–komponente (SAP). (a–c) Eksperimenti imunofluorescencije provedeni na uzorku biopsije bubrega pacijenta s dijagnozom membranozne glomerulopatije s maskiranim IgG kappa naslagama pokazuju bojenje granularne bazalne membrane glomerula za (a) SAP i (b) IgG. (c) Postoji jaka kolokalizacija SAP-a i IgG-a u naslagama glomerularne bazalne membrane. (d–f) Eksperimenti imunofluorescencije izvedeni na uzorku biopsije bubrega pacijenta s membranskim glomerulopatijama pozitivnim na receptor 3 fosfolipaze A2 pokazuju (d) negativno bojenje bazalne membrane glomerula za SAP i (e) pozitivno bojenje bazalne membrane glomerula za IgG. (f) Postoji nedostatak kolokalizacije u ovog pacijenta s membranskim glomerulopatijama povezanim s receptorom 3 fosfolipaze A2. Kako biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte internetsku verziju ovog članka u tablici 2|Rezultati bojenja serumske amiloidne p komponente (SAP) u biopsijama bubrega
AA, amiloid A; AL, amiloidni laki lanac; C3, komponenta komplementa 3; GBM, glomerularna bazalna membrana; MG, membranozna glomerulopatija; MGMID, glomerulopatija slična membrani s maskiranim IgG kappa naslagama; MPGN, membranoproliferativni; glomerulonefritis; PGMNID, proliferativni glomerulonefritis s monoklonalnim IgG kapa depozitima; PLA2R, receptor fosfolipaze A2; THSD7A, domena trombospondina tipa 1 koja sadrži 7A.
RASPRAVA
MGMID je nedavno opisan i jedinstven obrazac glomerulopatije karakteriziran subepitelnim i mezangijskim naslagama koje se boje na IgG kappa parafinskim IF (Slika 3). Pacijenti s ovim obrascem glomerulopatije uglavnom su mlade žene (dob<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">
SAP je 25-kDa pentamerni protein unutar obitelji pentraksina koji je kodiran genom APCS i ima ga u izobilju u serumu i kao komponenta glomerularne bazalne membrane.5 Iako je točna funkcija SAP-a nejasna, poznato je za interakciju u plazmi s širokim spektrom proteina, uključujući komponente komplementa, apolipoproteine i regulatore koagulacije i proteolize.6 On stvara stabilne interakcije ovisne o kalciju sa svojim ligandima, uključujući proteine, lipoproteine i DNA, štiteći ih od razgradnje. SAP služi kao topiva molekula za prepoznavanje uzoraka uključena u urođeni imunološki odgovor, prepoznajući niz molekularnih uzoraka povezanih s patogenima i oštećenjima, uključujući mikrobne komponente i apoptotične stanične ostatke.7 Interakcija SAP-a s molekulama povezanim s patogenima ili oštećenjima obrazaca potiče komplementom posredovano čišćenje apoptotskih staničnih ostataka izravnim vezanjem na komponentu komplementa 1q (C1q) i aktivacijom klasičnog puta komplementa. Unatoč aktivaciji komplementa, poznato je da SAP daje imunoregulaciju, smanjujući neutrofilneupalaunutar tkiva kroz smanjenu endotelnu adheziju,8 smanjenu funkciju elastaze,9 i smanjeno vraćanje u tkiva.10 Također je poznato da je SAP glavni vezni protein za DNA i kromatin unutar plazme.11
Kod bolesti, SAP je najpoznatiji po tome što je dio naslaga amiloidoze. Iako je manje dobro proučavan, također postoje dokazi da bi mogao igrati ulogu u ljudskim i životinjskim modelima autoimunih bolesti. SAP protutijela identificirana su u bolesnika sautoimunibolesti, a smanjena ekspresija SAP-a dokazano potičeautoimunostiu mišjim modelima. Protutijela protiv SAP identificirana su u 44 posto bolesnika sa sistemskim eritemskim lupusom, s titrom protutijela u korelaciji s aktivnošću bolesti.12 Utvrđeno je da nedostatak SAP-a rezultira razvojem spontane autoimunosti kod C57BL/6 miševa sklonih autoimunim bolestima i kod neautoimunih skloni miševima 129/Sv kada se križaju s miševima C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13, ali ne samo u soju 129/Sv, što sugerira da bi možda bila potrebna temeljna genetska osjetljivost da bi nedostatak SAP-a inducirao autoimunost.14 miševi pokazuju proizvodnju antinuklearnih antitijela, anti-jednolančanih DNA, anti-dvolančanih DNA antitijela i reumatoidnih faktora. Razvijaju proliferativniimunglomerulonefritis posredovan kompleksom, češće u ženki.13 U mišjem modelu lupus nefritisa gdje je glomerulonefritis izazvan injekcijom aktivirane vlastite DNA u serumu, SAP genska terapija plazmidnim vektorom smanjila je proizvodnju protutijela protiv dvolančane DNA , taloženje imunoloških kompleksa i upalu bubrega te spriječio nastanak lupus nefritisa.15
Slika 3|Nalazi bubrežne biopsije kod membranozne glomerulopatije s maskiranim IgG kappa naslagama. Ovdje su prikazane mikrofotografije biopsije prikazane na slici 2. (a) Segmentni šiljci prisutni su duž glomerularnih bazalnih membrana, prema Jones metenamin srebrnom mrljanju (izvorno povećanje × 400). (b) Elektronska mikroskopija otkriva subepitelne naslage prisutne duž glomerularne bazalne membrane (izvorno povećanje × 12, 000). (c) Boja glomerula negativna na IgG rutinskom imunofluorescencijom na svježem tkivu (izravna imunofluorescencija; originalno povećanje × 400). (d) Glomeruli iz istog slučaja pozitivno se boje na tkivu ugrađenom u parafin nakon digestije proteazama (izravna imunofluorescencija; originalno povećanje × 400). (e) Glomeruli pokazuju bojenje za kappa i (f) ne za lambda na tkivu ugrađenom u parafin probavljenom proteazom (izravna imunofluorescencija; originalno povećanje × 400). Kako biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte online verziju ovog članka na www.bubreg-international.org.
Unatoč ograničenju lakog lanca uočenom na biopsiji, trenutno nema dokaza da je ovaj entitet povezan s osnovnim limfoproliferativnim poremećajima ili cirkulirajućim monoklonskim Ig.4 Stoga se MGMID ne bi trebao smatrati unutar spektra monoklonske gamapatije od bubrežnog značaja u ovom trenutku. vrijeme. Uloga SAP autoantitijela također je neizvjesna. Za razliku od drugih oblika membranske glomerulopatije s proteinom specifično prisutnim u imunološkim naslagama, kao što je bolest povezana s PLA2R,16 čini se da MGMID ne pokreću autoantitijela usmjerena protiv SAP-a, budući da nismo uspjeli otkriti reaktivnost serumskih antitijela protiv SAP-a u pacijenata s MGMID-om . Alternativno objašnjenje je da je IgG kappa prisutan kao rezultat normalne interakcije između ova 2 proteina, a ne autoimune interakcije antigen-antitijelo, budući da je poznato da je lanac Ig kapa dio normalnog interaktoma serumskog SAP-a.6 Stoga, iako je korisno za dijagnostiku tkiva ovog entiteta, testiranje na SAP antitijela u serumu u ovom trenutku ne služi kao neinvazivna dijagnostika, a temeljni pokretač ove bolesti ostaje misterij.
Klinički ishodi u MGMID-u iznimno su varijabilni, u rasponu od spontane remisije do progresije do krajnjeg stadijabubregbolests recidivom u transplantaciji. Retrospektivna analiza nije uspjela pokazati nikakvu povezanost između primijenjenog liječenja i kliničkog ishoda.4 Otkriće uključenosti SAP-a u ovu bolest potencijalno ima implikacije na terapiju. Tretmani koji su izravno usmjereni na SAP pokazali su se kao rani obećavajući u liječenju amiloidoze.17,18 Dodatno, rezultati masene spektrometrije pokazuju da bi terapije usmjerene na kaskadu komplementa mogle biti korisne u liječenju ovog oblika glomerulonefritisa, s obzirom na to da većina proteina koji su bili povećani u MGMID glomeruli su povezani s komplementom. Potrebne su dodatne studije kako bi se identificirali biomarkeri aktivnosti za ovu bolest, kao i terapije.
Razlog maskiranja imunoloških naslaga u MGMID biopsijama na rutinskoj imunofluorescenciji ostaje misterij. Prisutnost SAP-a u naslagama otvara nova moguća objašnjenja za ovaj fenomen u slučajevima MGMID-a. Na primjer, poznato je da interakcije proteina SAP uvelike ovise o Ca2þ,6 a mnogi transportni mediji i puferi korišteni u obradi tkiva bubrežne biopsije za imunofluorescenciju su lišeni Ca2þ. Ova in vitro odsutnost Ca2þ mogla bi rezultirati prekidom imunoloških naslaga tako da više nisu dostupni za otkrivanje imunofluorescencijom na smrznutom tkivu. Međutim, naslage imunološkog kompleksa ostale bi dostupne za detekciju u tkivu fiksiranom formalinom, kao rezultat formalinom induciranih kovalentnih kemijskih veza između proteina u tkivu.
Ovdje po prvi put opisujemo jedinstvenu prisutnost SAP-a u glomerularnim naslagama MGMID-a. Osim toga, pokazujemo da bojenje odbubregbiopsijeza SAP identificira slučajeve s kliničko-patološkim značajkama sličnim onima u MGMID-u, bez maskiranja, rutinskom imunofluorescencijom. S obzirom na ove rezultate, vjerujemo da pozitivno bojenje unutar glomerularnih naslaga za SAP identificira jedinstveni oblik glomerulonefritisa koji dijeli zajednički patofiziološki mehanizam bolesti. Do nedavnog opisa MGMID-a, ti su slučajevi dijagnosticirani u brojne različite kategorije u rasponu od C3 glomerulopatije preko glomerulonefritisa povezanog s infekcijom do atipične membranske glomerulopatije.1 Brza evolucija dijagnostičkih kriterija i naše razumijevanje ovog oblika glomerulonefritisa naglašavaju snagu mase spektrometrija za pružanje patofiziološkog uvida u imunološki posredovani glomerulonefritis.
METODE
Tehnike obrade biopsije bubrega
Korištene su standardne tehnike obrade biopsije bubrega, uključujući svjetlosnu, imunofluorescencijsku i elektronsku mikroskopiju.19,20 Svi uzorci svjetlosne mikroskopije obojeni su hematoksilinom i eozinom, Jonesovim metenamin srebrom, Massonovim trikromom i periodnom kiselinom–Schiffovim reagensom. Svi rezovi izravne imunofluorescencije izrezani su na 4 mm i reagirali su s fluoresceinom označenim poliklonalnim zečjim anti-humanim antitijelima na IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogen i k-, i l-lake lance (Dako, Carpenteria, CA) 1 sat, i isprati; naneseno je pokrovno stakalce korištenjem vodenog medija za montiranje. Odabrani slučajevi su obojeni na poliklonska mišja anti-humana antitijela označena fluoresceinom na IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Parafinska imunofluorescencija provedena je nakon digestije proteazom kao što je prethodno opisano.2,3 Ukupno 9 MGMID biopsija i 8 usporednih kontrolnih biopsija s membranskom glomerulopatijom drugih tipova odabrano je za analizu masenom spektrometrijom. Protokol studije odobrio je Solutions Institutional Review Board i on je u skladu s načelima Helsinške deklaracije.
Cistanche možetoniziratibubreg
Masena spektrometrija mikrodiseciranih glomerula snimljenih laserom
Tkivo bubrežne biopsije iz formalinom fiksiranog tkiva umetnutog u parafin izrezano je u debljini od 10 mm na Leica PET-membranskim stakalcima (Leica, Wetzlar, Njemačka). Ova stakalca su zatim obojena hematoksilinom. Glomeruli su mikrodisecirani u mikrocentrifugalne epruvete pomoću Leica DM60{{20}}0B mikroskopa. Mikrodisecirani glomeruli lizirani su u 2 postotnom natrijevom dodecil sulfatu i 0,1 M ditiotreitolu na 99 stupnjeva tijekom 1 sata i obrađeni pripremom uzorka potpomognutom filtrom (FASP).21 Pročišćeni lizat prenesen je u koncentratore Vivacon 500 (MWCO od 30 kDa; Sartorius , Göttingen, Njemačka). Natrijev dodecil sulfat uklonjen je ponovljenim ispiranjem s 8 M ureom u 0,1 M tris(hidroksimetil)-aminometanu/Cl, pH 8,5; uzorci su zatim alkilirani s 0,05 M jodoacetamidom. Jodoacetamid je uklonjen 3 ispiranja s 8 M urea/0,1 M tris(hidroksimetil)-aminometan/Cl, pH 8,5, nakon čega su uslijedila 3 ispiranja s 0,05 M amonijevim bikarbonatom. Proteini su digestirani s tripsinom (stupanj sekvenciranja, Promega, Madison, WI) u omjeru 40:1 w/w na 37 stupnjeva tijekom 16 sati. Peptidi su sakupljeni centrifugiranjem i odsoljeni na C18-Stage vrhovima (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Probavljeni peptidi analizirani su NanoLC-tandemom masene spektrometrije korištenjem Thermo Orbitrap Fusion Lumos masenog spektrometra (Thermo Scientific). Peptidi su naneseni na stupac zamke reverzne faze (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) koji je sadržavao 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) nabijenu površinsku hibridnu smolu spojenu na 150 mm X 0.075 mm analitička kolona koja sadrži istu smolu reverzne faze koja se koristi u odvajaču. Sustav tekućinske kromatografije ultraučinkovitosti nanoAcquity (Waters Corp.) zatim je korišten za generiranje 60-minutnog gradijenta od 98:2 do 60:40 omjera pufer A:B (pufer A=0,1 posto mravlja kiselina 0,5 posto acetonitrila; pufer B=0,1 posto mravlje kiseline, 99,9 posto acetonitrila).
Peptidi su eluirani iz kolone s integriranim vrhom za raspršivanje (Picofrit, New Objective) i ionizirani elektrosprejom (2.0 kV) nakon čega je uslijedila analiza tandemske masene spektrometrije korištenjem disocijacije izazvane sudarom veće energije (HCD). Pregledna skeniranja peptidnih prekursora izvedena su pri rezoluciji od 240K (pri 400 m/z) s ciljnim brojem iona 5×105. Tandemska masena spektrometrija provedena je izolacijom na 1,6 Th s kvadrupolom, HCD fragmentacijom s normaliziranom energijom sudara od 30 i analizom masene spektrometrije brzog skeniranja u ionskoj zamci. Dobiveni podaci tandemske masene spektrometrije pretraženi su prema najnovijoj Uniprot bazi podataka o ljudima koja sadrži i Swiss Prot i TREMBLE unose korištenjem
MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Njemačka). Vizualizacija podataka učinjena je korištenjem Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Stopa lažnih otkrića postavljena je na 1 posto za podudaranja peptida sa spektrom. Za kvantifikaciju su korištene normalizirane iBAQ vrijednosti iz MaxQuant-a. iBAQ distribucije za svaki uzorak prilagođene su medijanom radi kontrole razlika u opterećenju. Vrijednosti iBAQ jednake nuli uklonjene su iz skupa podataka. Za testiranje statističke hipoteze, 2-uzorak Welchovog t-testa izveden je za svaki protein korištenjem normaliziranih iBAQ vrijednosti za 2 skupine. Ako je protein detektiran samo u jednoj skupini, 1-uzorak Welchovog t-testa je izveden, koristeći najmanju otkrivenu vrijednost iBAQ kao nultu hipotezu.
SAP bojenje
Formalinom fiksirani parafinom ugrađeni rezovi, izrezani na 3 mm, deparafinizirani su, a pronalaženje antigena je izvedeno na 99 stupnjeva. Sekcije su reagirale sa zečjim poliklonskim anti-SAP poliklonskim antitijelom (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) nakon čega je slijedio kozji anti-zečji sekundar s Rhodamine red X konjugiranim koji je adsorbiran u čvrstoj fazi kako bi se osigurala minimalna križna reakcija s ljudskim IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Svaki slučaj je proveden s pozitivnim i negativnim kontrolama. Boja je procijenjena standardnom imunofluorescentnom mikroskopijom. Ocijenjeno je pozitivnim ako je u glomerulima bilo pozitivno bojenje granularne kapilarne petlje, a negativnim ako nije bilo kapilarne petlje
bojenje u glomerulima. Kolokalizacija IgG i SAP u glomerularnim bazalnim membranama ispitana je konfokalnom mikroskopijom pomoću Zeiss LSM 880 konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Zeiss Microscopy, Jena, Njemačka). Za ovu analizu, poliklonalni (flfluorescein izotiocijanat-konjugirani) zečji anti-ljudski IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) reagirao je s tkivom izvučenom toplinom nakon bojenja za SAP kako je gore opisano. Provedene su negativne kontrole kako bi se osigurala specifičnost protutijela izostavljanjem primarnih protutijela. Četiri slučaja MGMID testirana su na prisutnost HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) bojenjem imunoperoksidazom.
Testiranje serumskih antitijela na SAP
SAP protein (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) je razrijeđen do 3 ng/ml u karbonat-bikarbonatnom puferu (pH 9,6) i obložen na {{ 6}}jažica Immulon H2 ploča (Thermo Scientific) preko noći na 4 stupnja. Ploče su isprane x3 upotrebom 200 ml pufera za ispiranje (1 × fosfatno puferirana fiziološka otopina i 0,05 posto tween) i blokirane 2 sata s blokirajućim puferom (1 × fosfatno puferirana fiziološka otopina, 0,05 posto tween, 1 posto riblje želatine). Ploče su zatim isprane x 3 s 200 ml pufera za ispiranje. Dvadeset mikrolitara razrijeđenog seruma (1:100 u puferu za pranje) dodano je po jažici i inkubirano 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane x 7 s 200 ml pufera za ispiranje, a zatim je dodano antitijelo za detekciju, anti-humani IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Ploče su isprane x 7 s 200 ml pufera za ispiranje. Zatim, supstrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin peroksidaze i supstrat peroksidaze Sol B pomiješani su u omjeru 1:1 i 100 ml je dodano na ploču. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 ml 2M H2SO4, ostavljena na stolu 20 minuta prije očitavanja na 450 nm. Za kontrolu kako bismo osigurali da je SAP protein vezan za ploču, upotrijebili smo zečji anti-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) u serijskom razrjeđenju nakon čega je slijedio anti-zečji IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Kontrola je pokazala dobru korelaciju između razrjeđenja protutijela i apsorbancije, sa srednjom vrijednošću R-kvadrata od 0,95.
Cistanche za poboljšanjebubregfunkcija
RAZOTKRIVANJE
Svi autori izjavili su da nema suprotstavljenih interesa.
DOPUNSKI
MATERIJAL Dopunska datoteka (PDF)
Slika S1. Reprezentativne slike bojenja glomerularnog SAP-a za razne bubrežne bolesti.
Slika S2. Studije anti-SAP seroreaktivnosti enzimskim imunotestom.
Tablica S1. Svi Ig identificirani masenom spektrometrijom u laserski snimljenim mikrodiseciranim glomerulima iz slučajeva membranozne glomerulopatije s IgG kappa naslagama.
Tablica S2. Spektralno brojanje uzorkovanjem svih proteina pokazalo je povećanje količine za $1 log2 u MGMID uzorcima i P-vrijednost # 0.1.
REFERENCE
1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et al. Glomerulopatija slična membrani s maskiranim IgG kappa naslagama.BubregInt. 2014; 86: 154–161.
2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Parafinska imunofluorescencija u laboratoriju za bubrežnu patologiju: više od tehnike spašavanja. Mod Pathol. 2015;28:854–860.
3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, et al. Membranoproliferativni glomerulonefritis s maskiranim monotipskim depozitima imunoglobulina. Kidney Int. 2015;88:867–873.
4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, et al. Kliničko-patološka obilježja membranozne glomerulopatije s maskiranim IgG kappa depozitima. Kidney Int Rep. 2016;1:299–305.
5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. Struktura pentamerne P komponente amiloida ljudskog seruma. Priroda. 1994;367:338-345.
6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et al. Komponenta serumskog amiloida P (SAP) interaktomira u ljudskoj plazmi koja sadrži fiziološke razine kalcija. Biokemija. 2017;56:896-902.
7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, et al. Prepoznavanje uzoraka pentraksinima. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98-116.
8. Bottazzi B, Informato A, Messa M, et al. Pentraksini PTX3 i SAP u urođenom imunitetu, regulaciji upale i remodeliranju tkiva. J Hepatol. 2016;64:1416-1427.
9. Li JJ, McAdam KP. Humani amiloid P komponenta: inhibitor elastaze. Scand J Immunol. 1984;20:219-226.
10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Serumski amiloid P: sistemski regulator urođenog imunološkog odgovora. J Leukoc Biol. 2014;96:739-743.
11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Zaštitne molekule—C-reaktivni protein (CRP), serumski amiloid P (SAP), pentraksin3 (PTX3), lektin koji veže manozu (MBL) i apolipoprotein A1 (Apo A1), i njihova autoantitijela: prevalencija i klinički značaj u autoimunosti. J Clin Immunol. 2005;25:582-591.
12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. Anti-serumska amiloidna komponenta P protutijela u bolesnika sa sistemskim eritemskim lupusom koreliraju s aktivnošću bolesti. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698-1702.
13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et al. Komponenta amiloida P u serumu kontrolira degradaciju kromatina i sprječava antinuklearnu autoimunost. Nat Med. 1999;5:694-697.
14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et al. Autoimunost i glomerulonefritis u miševa s ciljanom delecijom gena za komponentu amiloida P u serumu: nedostatak SAP-a ili kombinacija sojeva? Imunologija. 2004;112:255-264.
15. Zhang W, Wu J, Qiao B, et al. Ublažavanje lupusnog nefritisa genskom terapijom komponente amiloida P u serumu s različitim mehanizmima koji su varirali od različitih stadija bolesti. PloS jedan. 2011;6:e22659.
16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et al. Receptor fosfolipaze A2 tipa M kao ciljni antigen u idiopatskoj membranskoj nefropatiji. N Engl J Med. 2009;361:11-21.
17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et al. Terapeutski klirens amiloida protutijelima na komponentu P amiloida u serumu. N Engl J Med. 2015;373:1106-1114.
18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, et al. Ponovljene doze protutijela na komponentu amiloida P u serumu uklanjaju amiloidne naslage u bolesnika sa sistemskom amiloidozom. Sci Transl Med. 2018;10.
19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Praktične smjernice za biopsiju bubrega. Mod Pathol. 2004;17:1555-1563.
20. Walker PD. Biopsija bubrega. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181-188.
21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Univerzalna metoda pripreme uzoraka za analizu proteoma. Nat metode. 2009;6: 359–362.
