Genetika osteopontina u bolesnika s kroničnom bubrežnom bolešću: Njemačka studija o kroničnoj bubrežnoj bolesti Ⅱ

Analiza rijetkih varijanti

Na temelju 4879 GCKD sudionika s dostupnim podacima o čipu egzoma, dodatno smo proveli agregirano testiranje rijetkih varijanti (Sl. S1). Varijante s MAF-om<1% and having a major effect on the gene product (nonsynonymous, stop gain/loss, splicing; "qualifying variants") as annotated by dbNSFP v.2.0 were aggregated (Material and methods, [24,25]). While there was no significant association result when the burden test was used, we found a significant association using the sequence kernel association test (SKAT) for the SPP1 gene (Table 3, p-value = 2.5E-08), which remained significant after adjustment for the two replicated SNPs from the initial GWAS (p-value = 9.4E-08). Seven variants were aggregated for the analysis of the SPP1 gene. In the single variant analysis, effect estimates of the seven variants ranged from -1.20 to 0.24 with rs139555315 (4,88901197), a splice-site variant (CADD score: 23.7) showing the most significant association (effect estimate = -1.20, SE = 0.19, p-value = 2.5E-10) and thus likely driving the association. This is supported by the non-significant result (p-valueSKAT = 3.5E-01) when rs139555315 was excluded from the variant set. Other genes implicated by GWAS of common variants reached only nominal statistical significance (p<0.05; MEPE: p-valueSKAT = 4.6E-03; KLKB1: p-valueBurden = 5.6E-04, p-valueSKAT = 2.8E-03; F12: p-valueBurden = 3.4E-02, p-valueSKAT = 3.0E-02).

ORGANSKO BILJE ZA BUBREŽNE BOLESTI

Rasprava

U ovoj smo se studiji usredotočili na karakterizaciju genetike OPN-a unutar kohorte CKD-a, jer je poznato da su razine OPN-a povezane s nepovoljnim ishodima bubrega, ali genetska podloga ovog proteina poboljšanog bubrezima nije u potpunosti shvaćena. Korištenje skupine bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti može predstavljati povoljnu postavku u kojoj se transkripcija gena specifičnih za bubrege može promijeniti u usporedbi s općom populacijom, čineći identifikaciju specifičnih SNP-ova možda lakšom. Identificirali smo tri lokusa, dva na kromosomu 4 (rs10011284, rs4253311), koji se mogu replicirati u kohorti temeljenoj na vanjskoj populaciji, i rs2731673 na kromosomu 5, koji se ne može replicirati. Prilikom združivanja rijetkih varijanti otkriven je gen SPP1 koji kodira OPN.

Koliko znamo, ovo je prvi GWAS razina OPN u serumu kvantificiranih putem ELISA-e. Druge studije poput Suna i sur. proveden GWAS proteina plazme (pGWAS) uključujući OPN. Ovdje su proteini kvantificirani drugačije putem tehnologije temeljene na aptameru (SOMAscan, [22]). Iako je ova studija vjerojatno bila premala (N=3,301) za otkrivanje bilo kakvih genetskih signala za OPN, studija Pietznera i sur. (N do 10,708) daju signale na kromosomima 3, 4 i 10 povezane s OPN-om izmjerenim SOMAscan-om [26]. Otkriveni signal na kromosomu 4 (rs5860110, 4:88897106, MAF=0.30) uobičajeni je, intronički indel smješten unutar SPP1 koji nije u neravnoteži povezivanja (LD) s uobičajenim varijantama identificiranim u našem projektu. U sljedećem koraku, Pietzner i sur. izvijestio o statistici povezivanja za SOMAscan otkrivene lokuse koristeći različite tehnike za mjerenje proteina (Olink, paneli proteina temeljeni na antitijelima). Olink mjerenja su, međutim, bila dostupna samo za mali dio ispitivane populacije i nijedan od tri SOMAscan mjerena OPN signala nije mogao biti potvrđen. Sustavna usporedba razina proteina kvantificiranih ovim dvjema tehnikama otkrila je različite korelacije (medijan 0,38, IQR: 0,08–0,64). Za OPN je prijavljen koeficijent korelacije od 0,51. Slična usporedba još više proteomičkih platformi također je izvijestila o širokom rasponu korelacija među mjerenjima [27]. Razlike u detekciji genetskih signala stoga ne mogu biti samo zbog razlika u snazi, već i zbog tehničkih, proteinskih i varijantnih karakteristika. Na svim platformama, rezultati usporedbe stoga su teški, a meta-analize mogu dovesti do pogrešnih zaključaka.

rs10011284; 4:88833389 (SPP1/MEPE međugenski)

Indeks SNP rs10011284 (MAF=0.43) prvog lokusa na kromosomu 4 preslikava između gena SPP1 i MEPE. Ostaje nejasno je li ova ili neka druga varijanta uzročna varijanta u pozadini promatrane povezanosti jer rezultati statističkog preciznog mapiranja nisu uvjerljivi. Usprkos tome, pri združivanju rijetkih varijanti, SPP1, gen koji kodira protein OPN, pokazao je značajnu povezanost potaknutu varijantom mjesta spajanja. Sve pogreške koje se dogode tijekom procesa spajanja mogu dovesti do lažnog uklanjanja introna uzrokujući promjene na otvorenom okviru za čitanje. Zauzvrat, to može dovesti ili do stvaranja preuranjenog stop kodona i skraćenog proteina ili vjerojatnije do brže degradacije mRNA koja se naziva besmislenim raspadom [28]. Za varijantu koja pokreće ovu povezanost kod SPP1, varijantu mjesta spajanja (rs139555315, 4:88901197, MAF=1.54E- 03), prijavljeno je da je povezana s pedijatrijskim sistemskim eritemskim lupusom [29].

SPP1 is made up of 7 exons containing 942 transcribed nucleotides from the start codon in exon 2 to the stop codon (within exon 7, [30]). OPN belongs to the SIBLING glycoprotein family of secreted phosphoproteins; other members of this family comprise dentin matrix protein 1, dentin-sialophosphoprotein, Catherine, bone sialoprotein, and matrix extracellular phospho-glycoprotein (MEPE). Results from our colocalization analysis using GeneAtlas are pointing toward a connection of SPP1 with bone disorders. Fitting with these results, one of OPN's main physiological functions in the body is the regulation of the biomineralization processes [31]. Conflicting results have been reported on OPN as well as SPP1 polymorphisms and susceptibility to nephrolithiasis in the past [32–36]. From in vitro studies it may be inferred, that OPN inhibits nucleation, growth, and aggregation of calcium oxalate crystals [37], but clinical studies draw a more unclear picture. Some researchers report on the protective role of OPN, whereas others do not [38,39]. Nonetheless, a recent study from South Asia found a significant association of the SPP1 rs2853744:G>T polimorfizam s urolitijazom [40].

OPN se uglavnom izlučuje, no zabilježen je i intracelularni oblik [41]. Korištenjem PCR-a s reverznom transkripcijom utvrđeno je da se OPN eksprimira u normalnim bubrezima odraslih ljudi, daljnje imunohistokemijske analize i in situ hibridizacija otkrile su da je ekspresija OPN-a ograničena na distalne zavojite i ravne tubule u korteksu bubrega i meduli u bubrezima majmuna [42]. Gledajući podatke ekspresije tkiva GTEx, otkrivena je pozitivna kolokalizacija signala asocijacije OPN na SPP1 s tkivom gušterače. To je u skladu s nalazima u literaturi gdje se sugerira da OPN ima ulogu u dijabetesu tipa 2. Jedna studija koju su proveli Cai i sur. istraživali su model dijabetičkog miša SUR1-E1506K+/+ i otočiće ljudskih donora i uspjeli dokazati da je u otočićima ljudskih donora ekspresija OPN gena bila povišena u dijabetičkim otočićima, a vanjski dodan OPN značajno je povećao glukozom stimuliranu izlučivanje inzulina iz donora dijabetičara, ali ne i normalne glikemije [43]. Mnoge druge studije također su istraživale ulogu OPN-a u raku gušterače, ovdje je utvrđeno da je OPN prognostički marker koji povezuje više razine s lošom ukupnom prognozom u bolesnika [44].

MEPE (Matric Extracellular PhosphoglycoprotEin) je gen koji kodira izlučeni fosfoprotein MEPE koji veže kalcij. Zajednička značajka SIBLING proteina je motiv povezan s MEPE-om bogatim kiselim serinom aspartatom (ASARM), koji je uključen u regulaciju mineralizacije, izmjene kostiju, mehanotransdukcije, fosfata i metabolizma energije [45]. Motiv ASARM također je povezujuća veza između SIBLING-a i FGF23, čime je dio fiziološke veze kost-bubreg [45]. MEPE je uključen u regulaciju homeostaze fosfata u bubrezima i crijevima [46,47]. Kolokalizacija signala povezivanja OPN-a na MEPE dovodi do otkrivanja povezanosti s plućnim tkivom. Do sada je prijavljena povezanost između nekoliko članova obitelji SIBLING s rakom pluća, ali definitivna veza između MEPE i pluća još nije utvrđena [48]. Budući da je poznato više varijanti prijepisa zbog alternativnog spajanja, ne može se isključiti veza između MEPE i pluća i mogla bi ponuditi moguća područja istraživanja u budućnosti. Rezultati naše analize kolokalizacije pomoću GeneAtlasa ukazuju na povezanost MEPE s poremećajem kostiju. Bolesti povezane s MEPE-om su osteomalacija i autosomno-dominantni hipofosfatemijski rahitis koji podupiru ovu vezu između MEPE-a i poremećaja kostiju [49]. Drugi fenotip koji je naizgled povezan s rs10011284 je giht. Ovu povezanost najvjerojatnije pokreće ABCG2, koji se nalazi blizu SPP1 i MEPE i jedan je od najbolje opisanih gena za prijenos mokraćne kiseline do danas [19,50].