Rak želuca (GC) bio je prva vodeća pojava i druga vodeća smrtnost od raka probavnog sustava

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak

Liječenje platinastim lijekovima jedna je od najdominantnijih kemoterapijskih strategija za bolesnike s rakom želuca (GC). Međutim, terapijski učinak nije zadovoljavajući, uglavnom zbog stečene rezistencije na lijekove platine. Stoga, bolje razumijevanje temeljnih mehanizama može uvelike poboljšati terapijsku učinkovitost GC-a. U ovoj studiji, cilj nam je bio istražiti funkcije/mehanizme povezane s kemorezistencijom i klinički značaj proteina 75 (GRP75) reguliranog glukozom u GC-u. Ovdje su naši podaci pokazali da je u usporedbi sa stanicama SGC7901 ekspresija GRP75 bila znatno veća u rezistenciji na cisplatinu (stanice (SGC7901 *). Nokdaun GRP75 ukinuo je održavanje potencijala mitohondrijske membrane (MP) i inhibirao nuklearni faktor eritroid{{ 10}}srodni faktor 2 (NRF2), fosfatidilinozitol 3 kinaza/protein kinaza B (Pl3K/AKT), faktor 1a inducibilan hipoksijom (HIF-1a) i c-myc, što je rezultiralo blokiranjem aktivacije njihove nizvodne mete. Ovi su procesi oslabili sposobnosti antioksidacije/apoptoze i promijenili metaboličko reprogramiranje u stanicama SGC7901 ", što je dovelo do ponovne osjetljivosti tih stanica na cisplatin. Međutim, prekomjerna ekspresija GRP75 u stanicama SGC7901 uzrokovala je suprotne učinke. Model ksenografta potvrdio je gore navedene rezultate. U bolesnika s GC-om koji su primali kemoterapiju platinom i meta-analiza, visoka razina GRP75 bila je pozitivno povezana s agresivnim karakteristikama i lošom prognozom uključujući, ali ne ograničavajući se na gastr intestinalnog karcinoma, i bio je neovisni prediktor ukupnog preživljenja. Zajedno, naša je studija pokazala da je GRP75 uključen u rezistenciju GC-a na cisplatinu i da bi GRP75 mogao biti potencijalna terapijska meta za obnavljanje odgovora na lijekove u stanicama otpornim na platinu i koristan aditivni prognostički alat u vođenju kliničkog liječenja pacijenata s GC-om.

Kliknite ovdje da saznate više

Uvod

Rak želuca (GC) bio je prva vodeća pojavnost i druga vodeća smrtnost od raka probavnog sustava u Kini. Trenutačno liječenje uznapredovalog GC-a bila je kirurška operacija u kombinaciji sa sistemskom kemoterapijom, ali dugotrajna stopa preživljavanja bila je manje nego zadovoljavajuća zbog visokog postoperurškog recidiva2. U kliničkoj praksi, lijekovi s platinom bili su jedan od lijekova prve linije za uznapredovali GC. GC kemoterapija3. Međutim, stečena rezistencija na lijekove uvijek se javlja nakon višestrukih ciklusa liječenja na bazi platine i ukazuje na lošu prognozu.cistanchStoga je rasvjetljavanje potencijalnih mehanizama i identificiranje novih terapijskih strategija za prevladavanje rezistencije na lijekove platine kod pacijenata s GC-om bilo hitno neophodno.

Cistanche može spriječiti starenje

Protein 75 reguliran glukozom (GRP75) bio je molekularni pratilac koji je induciran stresom i pripadao je obitelji proteina toplinskog šoka4. Prekomjerna ekspresija GRP75 bila je usko povezana s progresijom tumora u različitim vrstama raka kod ljudi5-7. Ovdje smo istraživanjem meta-analize otkrili da visoka razina GRP75 ukazuje na značajno lošu prognozu kod nekoliko karcinoma probavnog sustava (kolorektalni rak, kolangiokarcinom i rak gušterače). Za rezistenciju na lijekove, inhibicija GRP75 preokrenula je rezistenciju na cisplatin i doksorubicin u hepatocelularnom karcinomu i raku jajnika. GRP75 je klasično odvojio p53 u citoplazmi, što je dovelo do inaktivacije funkcije p53 i potiskivanja ap-toze10. Prethodna studija je objavila da GRP75 pozitivni tumori imali su lošiju prognozu u usporedbi s GRP75 negativnim tumorima u GC s normalnom funkcijom p53. Međutim, p53 je bio jedan od najčešće mutiranih gena u GC (pogađa više od 50 posto pacijenata)l2-15. Stoga smo pretpostavili da bi uz klasičnu represiju aktivnosti p53, GRP75 mogao biti uključen u induciranje/održavanje rezistencije na lijekove platine u GC korištenjem ap53-neovisnog načina.

U ovoj studiji, veća ekspresija GRP75 pridonijela je otpornosti na cisplatinu u stanicama SGC7901 i u modelu ksenografta. Mehanički gledano, GRP75 je inducirao/održavao otpornost na cisplatin putem regulacije antioksidacijskih/apoptotskih sposobnosti i svojstava metaboličkog reprogramiranja.cistanche AustralijaU bolesnika s GC-om, prekomjerna ekspresija GRP75 pridonijela je agresivnim karakteristikama i lošoj prognozi. Naši rezultati su pokazali da GRP75 potiče otpornost na cisplatinu kod GC-a i može biti biomarker za predviđanje odgovora na liječenje lijekom platine.cistanche koristiCiljanje na GRP75 moglo bi pružiti novo razumijevanje GC sistemske kemoterapije.

Rezultati

Učinci GRP75 na rezistenciju na cisplatinu u GC Testovima vijabilnosti stanica korišteni su za provjeru rezistencije stanica SGC7901~, Ipsos (uM) cisplatine za stanice SGC7901 i SGC7901CR bio je: 5,518 naspram 72,46 (Slika 1A). Na temelju baze podataka KM-Plotter, povećana ekspresija GRP75 ukazuje na lošu prognozu (Slika 1B). Štoviše, izrazito povećana ekspresija GRP75 u stanicama SGC7901CR u usporedbi s njegovim roditeljskim stanicama SGC7901 (Slika 1C), sugerirajući da bi GRP75 mogao doprinijeti rezistenciji na cisplatin. Da bi se potvrdila ova hipoteza, stanice SGC7901~ transficirane su scramble- ili GRP75 siRNA, a IC50 (uM) cisplatina za kodirane ili GRP75 siRNA transficirane SGC7901CK stanice bile su: 50,83 naspram 20.86, respektivno (Slika 1D). U kontrastu,

prekomjerna ekspresija GRP75 transfekcijom plazmida GRP75 u stanice SGC7901 pokazala je da su IC50 cisplatina za stanice SGC7901 transficirane scramble ili GRP75 plazmidima 3,825 naspram 6,98 (Slika 1E). Zajedno, ovi su rezultati otkrili da je GRP75 igrao ključnu ulogu u održavanju/induciranju rezistencije na cisplatin kod GC-a, ali mehanizmi ostaju predmet daljnjeg istraživanja.

Potencijalni mehanizmi na kojima se temelji GRP75 uzrokovali su rezistenciju na cisplatin

Preuzeli smo skupove podataka mikronizova GSE122130 (SGC7901CR naspram SGC7901) i GSE14209 (tkiva, otporna na cisplatinu naspram osjetljiva na cisplatinu) s GEO-a, zatim smo izveli analizu obogaćivanja GO-Biological procesa i KEGG-Pathwaya na temelju DAVID-a i prvih 10 rezultati su prikazani na sl. 2A-D. Bitne razlike bioloških procesa između stanica SGC7901C* i stanica SGC7901 uključivale su redukciju oksidacije, apoptotski proces (Slika 2A), analiza obogaćivanja KEGG-puta pokazala je da su skupovi DEG-a usko povezani s metaboličkim putovima i fosfatidilinozitol 3 kinaza/protein kinaza B (PI3K/AKT) put (Sl. 2B). Odgovor na lijek uključen je u bitne razlike bioloških procesa između tumorskih tkiva otpornih na cisplatin i osjetljivih na cisplatin, a metabolički put je također bio ključna poveznica u analizi obogaćenja KEGG-puta (Slika 2C, D). Osim toga, mreža od 60 proteina koji su značajno komunicirali s GRP75 konstruirana je korištenjem baze podataka String, zatim je analiza KEGG-puta pokazala da metabolički putovi igraju važnu ulogu između GRP75 i njegovih interaktora (Slika 2E). Na temelju ovih rezultata, pretpostavili smo da bi antioksidacija/apoptoza i metaboličko reprogramiranje mogli pospješiti preživljavanje i rast GC-a što dovodi do rezistencije na cisplatin. Međutim, mehanizmi sudjelovanja GRP75 u regulaciji zahtijevaju daljnja istraživanja (slika 2F).

Učinci GRP75 na antioksidaciju i anti-apoptozu Ovdje je unutarstanična razina ROS-a bila povišena u stanicama SGC7901CR u usporedbi s njihovim roditeljskim kopijama (Slika 3A), što sugerira da su stanice SGC7901Ck bile izložene relativno višim uvjetima oksidativnog stresa. Prethodna studija otkrila je da je GRP75 uključen u stabilizaciju MMP-a, važnog izvora stvaranja ROS-a. Ovdje je nokdaun GRP75 ukinuo održavanje MMP-a u stanicama SGC7901CK izazvano cisplatinom, a prekomjerna ekspresija GRP75 imala je suprotan učinak u stanicama SGC7901 (Slika 3B).cistanche kolesterolZatim smo potvrdili odnos između GRP75 i antioksidacije i anti-apoptoze. Kao što je prikazano na slici 3C, nokdaun GRP75 smanjio je razinu nuklearnog faktora eritroid-2-srodnog faktora 2 (NRF2) i njegovih nizvodno ciljnih gena (HO-1 i NQO-1) u SGC7901 ~ stanicama, a prekomjerna ekspresija GRP75 pokazala je suprotan učinak u stanicama SGC7901. Štoviše, obaranje GRP75 ili NRF2 u stanicama SGC7901CR dodatno je poboljšalo unutarstanične generacije ROS-a, apoptozu (Slika 3D) i aktivnosti kaspaze-3 (Dopunska slika S1) inducirane cisplatinom. Nasuprot tome, prekomjerna ekspresija GRP75 u stanicama SGC7901 značajno je oslabila generacije ROS-a izazvane cisplatinom, staničnu apoptozu (Slika 3E) i aktivnosti kaspaze-3 (Dopunska slika S1). Ovi rezultati su otkrili da GRP75 održava/inducira otpornost na cisplatin može biti induciranjem antioksidacije i antiapoptoze u GC stanicama.

Učinci GRP75 na metaboličko reprogramiranje Zatim smo dodatno istražili na koji način GRP75 inducira promjenu metaboličkog reprogramiranja. Sve je više dokaza pokazalo da metabolizam tumorskih stanica nije abnormalna promjena u jednom metaboličkom putu, već reprogramiranje cijele stanične metaboličke mrežel7. Mnogi klasični onkogeni ili signalni putovi bili su izravno ili neizravno uključeni u metaboličko reprogramiranje, kao što je PI3K/AKT, faktor la (HIF-la), c-myc, i tako dalje"'819. Stoga smo provjerili je li GRP75 uključeni u metaboličko reprogramiranje GC stanica. Kao što je prikazano na slici 4A, primijetili smo povišene razine p-AKT, HIF-la i c-myc u stanicama SGC7901CR u usporedbi s njegovim roditeljskim stanicama SGC7901. Štoviše, u stanicama SGC7901CR, obaranje GRP75 smanjio je razine proteina p-AKT, HIF-la i c-Myc izazvane cisplatinom i njihove nizvodne ciljeve povezane s glikolizom (HK2: heksokinaza 2; PDK1: piruvat dehidrogenaza kinaza 1; i LDHA: lanac laktat dehidrogenaze A). Naprotiv, prekomjerna ekspresija GRP75 u stanicama SGC7901 pokazala je suprotan učinak (Slika 4B, C). Nadalje, obaranje GRP75 ili AKT u stanicama SGC7901CR pokazalo je značajno smanjenje unosa glukoze i stanične vitalnosti/rasta induciranog cisplatinom; međutim, prekomjerna ekspresija GRP75 u stanicama SGC7901 izrazito povećana sposobnost unosa glukoze i održivost/rast stanica uzrokovan cisplatinom (Sl. 4D-F). Zajedno, ovi podaci pokazuju da GRP75 održava/inducira otpornost na cisplatin u GC stanicama može biti putem sudjelovanja u p-AKT, HIF-la i c-myc posredovanom metaboličkom reprogramiranju.

Potvrda in vitro podataka u modelu ksenografta Zatim smo istražili potencijalnu kliničku važnost GRP75 in vivo. Podaci o ksenotransplantatu pokazali su da liječenje samim cisplatinom ili samo obaranje GRP75 može inhibirati rast tumora; međutim, liječenje cisplatinom u kombinaciji s nokdaunom GRP75 značajno je olakšalo cisplatinom induciranu inhibiciju rasta tumora (slika 5A). Štoviše, IHC i qPCR testovi pokazali su da cisplatin plus GRP75 siRNA značajno smanjuje ekspresiju Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT i nizvodnih ciljeva u usporedbi sa samim liječenjem cisplatinom, ali povećava apoptozu (što je utvrđeno TUNEL bojanjem, slika 5B , C). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je, putem regulacije sposobnosti antioksidacije/antiapoptoze i metaboličkog reprogramiranja, GRP75 stimulirao in vivo preživljavanje i rast što je zauzvrat dovelo do rezistencije GC-a na cisplatin.

Identifikacija GRP75 kao karakterističnog faktora koji potiče rak i klinički značaj GRP75 u GC-u

Zatim smo procijenili ekspresiju GRP75 u uzastopnim dijelovima GC uzoraka. Kao što je prikazano na slici 6A, u usporedbi sa susjednim netumorskim želučanim tkivima, uočeno je značajno povećanje ekspresije GRP75 u GC tkivima. Prekomjerna ekspresija GRP75 dokazana je u GC tkivima pomoću IHC-intenziteta (slika 6B). Jače bojenje za GRP75 također je primijećeno s povećanjem TNM klasifikacije stadija malignih tumora (Slika 6C, D). Zatim smo podijelili ovih 116 GC uzoraka u dvije skupine ("GRP75 niski" vs." GRP75 visoki", prema IHC-intenzitetu, slika 6E). Transverzalni promjeri tumora u skupini "GRP75 high" bili su znatno veći od onih u skupini "GRP75 low" (slika 6F). Nadalje smo potvrdili kliničku prognozu GRP75 u GC-u. Kaplan-Meierova analiza preživljenja također je pokazala da su GC pacijenti u skupini "GRP75 high" imali lošije ukupno preživljenje od onih u skupini "GRP75 low" (Slika 6G).

Multivarijantnom analizom utvrđeno je da je GRP75 neovisni prediktor ukupnog preživljenja (Tablica 1).nuspojave cistanche deserticola,Ukratko, ovi rezultati sugeriraju da je GRP75 imao karakterističnu ulogu u vođenju progresije GC-a, otpornosti na cisplatin i lošoj prognozi. Meta-analiza visoke razine GRP75 s prognozom Dijagram toka pretraživanja i odabira literature i meta-analiza prikazani su na Dodatnoj slici S2. Model slučajnog učinka i model fiksnog učinka korišteni su za izračun i analizu vrijednosti srčanog ritma, a oba su pokazala da su visoke razine GRP75 značajno povezane s lošim ishodima pacijenata. Skupni HR bio je 1,91 (95 posto CI 1,62 do 2,25), s heterogenošću (I'=0.0 posto, p =0.559) (Slika 7A). Zatim smo napravili analizu podskupina, koja je pokazala da razina ekspresije GRP75 kod raka probavnog sustava (ukupni HR je bio 1,99,95 posto CI 1,64 do 2,43), ima značajan odnos s lošom prognozom preživljavanja. Svakako, slični rezultati su također pronađeni u drugim tumorima (ukupni HR bio je 1,74,95 posto CI 1,29 do 2,33) (Slika 7B). Oba

Beggov dijagram lijevka i Eggerov test korišteni su za procjenu moguće pristranosti objavljivanja uključenih studija. U analizi povezanosti između GRP75 i OS, p-vrijednost Beggovog testa i Eggerovog testa bile su 0.076 odnosno 0,024 (Slika 7C i D). Međutim, Eggerov test ima veću osjetljivost u procjeni pristranosti objavljivanja. Stoga je korištena metoda trim and fill kako bi naši rezultati bili vjerodostojniji. Kao što je prikazano na slici 7E, prilagođeni HR u modelu s fiksnim učinkom bio je 1,785 (95 posto CI 1,530 do 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Rasprava

U ovoj studiji koristili smo jedan od kemoterapijskih lijekova prve linije za bolesnike s GC-om, lijekove platine. Klasično, lijekovi s platinom mogu se kovalentno vezati za gvanin na lancu DNA i tako blokirati replikaciju i transkripciju DNA2. Međutim, zbog rezistencije na lijekove i neželjenih nuspojava, identificiranje novih terapijskih strategija za poništavanje rezistencije kod GC pacijenata bilo je hitno neophodno. Osim toga, GC pacijenti su razvili rezistenciju na lijekove nakon što su primili nekoliko ciklusa cisplatine, a naši rezultati su pokazali da su SGC7901~stanice pokazale značajnu otpornost na cisplatin u usporedbi sa SGC7901 stanicama.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) igrao je ključnu ulogu u reguliranju početka i napredovanja raka kod ljudi-7. Nedavno je postalo jasno da GRP75 također ima ključnu ulogu u rezistenciji na kemoterapiju. "Pored GRP75, drugi proteini toplinskog šoka odigrali su ključnu ulogu u rezistenciji na cisplatinu kroz PI3K/AKT/NF-KB i druge putove21-24 . Međutim, molekularni mehanizam GRP75 i rezistencije na cisplatinu rijetko je prijavljivan. Ovdje je naša studija otkrila da GRP75 potiče sposobnosti antioksidacije/apoptoze i mijenja metaboličko reprogramiranje, što dovodi do rezistencije na cisplatinu u GC stanicama. Također smo otkrili da je GRP75 pojačan u SGC7901~ stanica i u uzorcima tkiva pacijenata, te je bio u korelaciji s rezistencijom na lijekove, pro-preživljavanjem, rastom i lošim ishodima. U međuvremenu, multivarijantna analiza je identificirala da je GRP75 neovisni prediktor za sveukupno preživljenje. Osim toga, meta-analiza je pokazala da visoka razina GRP75 pokazala je lošu prognozu uključujući, ali ne ograničavajući se na GC, što je bilo u velikoj mjeri u skladu s našim istraživanjem. Svi gore navedeni rezultati potvrdili su da bi ciljanje GRP75 moglo Očekuje se da će postati novi pristup preokretu rezistencije na cisplatin i poboljšanju prognoze pacijenata s GC-om.

Pod fiziološkim uvjetima, stanice su neizbježno bile izložene ROS-u od vanjskih čimbenika i unutarstaničnog aerobnog metabolizma. Kao dvosjekli mač, odgovarajuće ROS bile su važne signalne molekule koje reguliraju normalnu funkciju stanica, dok su prekomjerne ROS dovele do apoptoze. Stoga je u tijelu postojao precizan regulacijski sustav antioksidansa za održavanje redoks ravnoteže i apoptotskih postupaka 20. Međutim, za razliku od fizioloških stanja, razine ROS tumora općenito su bile znatno više od normalnih kontrola istog podrijetla tkiva, što je odredilo postojanje posebnog antioksidacijski sustav u tumorskim stanicama, posebno za tumorske stanice otporne na lijekove27-29. Naši rezultati potvrdili su da su stanice SGC7901CR pokazale relativno višu razinu ROS-a u usporedbi sa stanicama SGC7901 te da je GRP75 povećao kapacitete antioksidacije/apoptoze. Tumorske stanice imale su dugu povijest metaboličkih abnormalnosti. Otto Warburg je još 1930-ih otkrio da tumorske stanice preferiraju glikolizu. Čak i pod uvjetima s dovoljno kisika, tumorske stanice su i dalje održavale visoke stope glikolize za stvaranje ATP-a. Ovaj abnormalni metabolički obrazac nazvan je "Warburg efekt"3031. Metaboličke promjene uzrokovane Warburgovim učinkom nedavno su se nazivale metaboličkim reprogramiranjem, a studije ovih promjena pružile su dublje razumijevanje metabolizma GC stanica. Dokazano je da GC stanice i normalne stanice pokazuju metaboličke razlike ne samo u metabolizmu glukoze, već i u metabolizmu lipida i aminokiselina³2-35. U ovom smo istraživanju otkrili da su promjene u metabolizmu glukoze jedna od ključnih veze održavajući rast stanica, što na kraju dovodi do rezistencije na GC cisplatin.

Kao što smo spomenuli, klasični onkogeni i signalni putovi poput PI3K/AKT, HIF-la i c-myc bili su izravno ili neizravno uključeni u metaboličko reprogramiranje. Aktivacija puta PI3K/AKT u tumorskim stanicama pojačala je mnoge metaboličke aktivnosti. Prvo, dopustio je stanicama unos glukoze, aminokiselina i drugih hranjivih tvari. Drugo, AKT je povećao glikolizu i proizvodnju laktata putem svojih učinaka na ekspresiju gena i aktivnost enzima i bio je dovoljan da inducira War-burg učinak u stanicama raka. Treće, aktivacija ovog puta pojačala je biosintezu makromolekula i stimulirala ekspresiju lipogenih gena i sintezu lipida'7. Nadalje, GRP75-aktivirani AKT i protein kinaze 1 i 2 regulirane izvanstaničnim signalom inhibirale su Bax konformacijske promjene i apoptozu 8. Tumorske stanice prilagođene su hipoksiji koja uključuje metaboličko reprogramiranje preko regulacije ciljnih gena HIF-la za stimulaciju unosa glukoze, glikolize, proizvodnja i izlučivanje mliječne kiseline, pohranjivanje glikogena, glutaminski cat-abolizam³ i promicanje nakupljanja triglicerida u kapljicama lipida³. Nedavno je postalo jasno da se GRP75 može specifično vezati na HIF-la i ciljati na vanjsku mitohondrijsku membranu, povezanu s VDAC1 i HK2, koji su spriječili apoptozu'. C-myc je mogao posredovati u metaboličkom reprogramiranju na brojne načine, a metaboličko reprogramiranje posredovano c-myc-om uvelike je postignuto utjecajem na mitohondrije. S jedne strane, c-myc također potiče glikolizu izravnim reguliranjem ekspresije enzima povezanih s glikolitikom, uključujući LDHA, HK2 i PDK11938. S druge strane, c-myc aktivirani enzimi uključeni u metabolizam glutamina putem transkripcije potiču korištenje glutamin mitohondrijima u tumorskim stanicama. Taj se učinak naziva "glutaminoliza". Štoviše, prekomjerna ekspresija GRP75-smanjila je ciklin-B1 i regulira ciklin-D1 i c-myc kako bi se potaknuo rast stanica raka jajnika*. Na temelju naših sadašnjih rezultata, pružili smo novo razumijevanje otpornosti na GC cisplatin kroz GRP75 kao potencijalno važnu kariku u regulaciji mreža metaboličkog reprogramiranja tumora.

Zaključci

Zaključno, pokazali smo da prekomjerna ekspresija GRP75 može pospješiti preživljavanje/rast u GC stanicama reguliranjem antioksidacije/apoptoze i metaboličkih mreža za reprogramiranje, čime inducira otpornost na cisplatin

Materijali i metode

Stanice, reagensi i uvjeti kulture

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 posto čistoće), kupljen je od Sigma-Aldrich (Šangaj, Kina). Stanice su uzgajane u mediju RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, SAD), dopunjenom s 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 100 U/ml penicilina, 100 ug/ml streptomicina (Gibco) i inkubirane u 5 posto CO2 na 37 stupnjeva. Za održavanje fenotipa otpornosti na cisplatinu, stanice SGC7901CR inkubirane su u mediju koji je sadržavao cisplatin （5 μM）.

Ksenografti i tretmani

Ovu studiju odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Medicinskog sveučilišta Nanjing, a prema životinjama se postupalo humano i s obzirom na ublažavanje patnje. BALB/c goli miševi dobiveni su iz SLRC Laboratory Animal Center (Šangaj, Kina) i konvencionalno držani kako smo prethodno opisali*l. Za ispitivanje ksenotransplantata, 2×10 stupnjeva SGC7901CK stanice u 100 ul matrigela ubrizgane su supkutano u bokove miševa tijekom 5 tjedana. Kako bismo odredili učinke GRP75 na rezistenciju GC-a na cisplatin, proveli smo test intratumorske i intraperitonealne injekcije. Ukratko, miševi su nasumično podijeljeni u 4 skupine (5 miševa po skupini): (1)MOCK, (2)GRP75KD, (3)MOCK＋cisplatin, i （4） GRP75 KD＋cisplatin. 100 ul siRNA （si-Con ili si-GRP75, 100 nM) bile su intratumorske injekcije svaka 3 dana. Skupine koje su podvrgnute terapiji cisplatinom (5 mg/kg) primale su intraperitonealne injekcije 3 puta tjedno, a ostale skupine su perfundirane jednakim volumenom fiziološke otopine. Tumori su mjereni svaki tjedan i njihovi volumeni izračunavani su pomoću formule: V=Y (širina2 duljina). Nakon 5 tjedana, miševi su žrtvovani, a tkiva tumora su uklonjena za daljnje istraživanje.

Bolesnici i uzorci tkiva

Ovu studiju odobrilo je Povjerenstvo za medicinsku etiku Druge pridružene bolnice, Medicinskog sveučilišta u Nanjingu i pridružene bolnice br. 2 Changzhou Medicinskog sveučilišta u Nanjingu, a od svakog pacijenta dobiven je pismeni informirani pristanak sudionika. Kliničko-patološki podaci navedeni su u Dodatnoj tablici S1. Mikroniz tkiva konstruirao je Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Šangaj, Kina) kao što smo prethodno opisali*

Transfekcija stanica

Za transfekciju, kodiranu i pcDNA-3.1-GRP75-Flag sintetizirao je General Biotech (Šangaj, Kina); dok su siRNA navedene u dodatnoj tablici S2. Stanice su prolazno transficirane reagensom lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, SAD), prema protokolu proizvođača. Ukratko, stanice su nanesene na 6-ploče s jažicama pri gustoći stanica od 1×10 stupnjeva u mediju RPMI 1640 koji sadrži 10 posto FBS-a bez antibiotika. Nakon inkubacije od 24 sata, stanice su prolazno transficirane s 5 ng/ml kodirane ili GRP75-Flag, ili 20 nM si-Con ili si-GRP75 tijekom 12 sati. Nakon transfekcije, stanice su uzgojene u svježem mediju s dodatkom 10 posto FBS-a još 24 sata prije nego što su korištene za druge pokuse.

Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qPCR) Korišteni početnici navedeni su u Dodatnoj tablici S3. Izolacija ukupne RNA, transkripcija RNA u cDNA i izvedba qRT-PCR-a sa strojem Applied Biosystems 7300HT bili su u skladu s našom prethodnom studijom 2. -aktin je pojačan kako bi se osigurao cDNA integritet i normalizirala ekspresija. Višestruke promjene u ekspresiji svakog gena izračunate su metodom komparativnog praga ciklusa (Ct) pomoću formule 2-(4ACt)

Ovaj je članak izdvojen iz Dai et al. Otkriće smrti stanice (2021.) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w