Funkcionalni odgovor memorijskih T-stanica pacijenata s COVID{0}}

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Ece Tavukcuoglua,, Utku Horzum1 a,, Ahmet Cagkan Inkaya1 , Serhat Unal ,bb Gunes Esendaglia, *

Odjel za osnovnu onkologiju, Institut za rak Sveučilišta Hacettepe, Ankara, Turska

b Odjel za zarazne bolesti, Medicinski fakultet, Sveučilište Hacettepe, Ankara, Turska

Ključne riječi: SARS-CoV-2 CentralmemorijaT stanice, efektormemorijaT stanice, Spike S1 glikoprotein Dendritičke stanice Pomoćne T stanice Citotoksični T limfociti

SAŽETAK: PrisutnostmemorijaT stanice u pacijenata s COVID-19 su priznate, međutim funkcionalna moćmemorijaodgovori su ključni za zaštitu. U ovoj studiji, naivna, efektorska, efektorska memorija i centralnamemorijaCD4 plus i CD8 plus T stanice dobivene od osoba koje su preživjele COVID-19 bile su ponovno izložene autolognim DC-ovima izvedenim iz monocita koji su bili napunjeni šiljastim glikoproteinom S1 SARS-CoV-2. Kapacitet proliferacije, CD25, 4-1BB i PD-1

ekspresija, a izlučivanje IFN-a, IL-6, granzima, granulizina i FasL pojačano je u CD4 plus i CD8 plus efektorumemorijai središnjimemorijaT stanice. Iako je na heterogenim razinama,memorijaT-stanice osoba s poviješću bolesti COVID{0}} posjeduju funkcionalne kapacitete za ponovno jačanje antivirusnog imuniteta protiv SARS-CoV-2.

Kliknite zaCistanche deserticola ma za poboljšanje pamćenja

1. Uvod

Unatoč novim podacima o koronavirusnoj bolesti 2019. (COVID{1}}), imunološki odgovor na teški akutni respiratorni sindrom koronavirus 2 (SARS-CoV-2) tek treba bolje definirati. Snaga i trajanje humoralnih i staničnih odgovora protiv SARS-CoV-2 povezani su s neutralizirajućim protutijelima imemorijaT stanice [1,2]. Posebice, šiljasti glikoprotein-S1 ima značajnu imunodominaciju budući da neutralizirajuća protutijela blokiraju njegovo vezanje na angiotenzin-konvertirajući enzim 2 (ACE2) i sprječavaju ulazak virusa [3]. Osim toga, približno 50 posto pacijenata pokazalo je S1-specifične T-stanične odgovore [4,5].

Unatoč tome, heterogenost uočena među slučajevima COVID-19 ima zbunjujući učinak. Dok većina pacijenata razvije antivirusnu imunost, čak i rekonvalescenti možda neće biti zaštićeni od ponovne infekcije što je potencijalno posljedica nedovoljne veličine i/ili stabilnosti proizvodnje T stanica i antitijela [6-8]. Intrigantno, kod teških infekcija SARS-CoV-2, interakcija između CD4 plus pomoćnih T (Th) stanica i B stanica je prigušena u germinativnom centru, što potencijalno smanjuje dugotrajnost odgovora antitijela [9]. Zajedno s Th aktivnostima, otpornost CD8 plus citotoksičnih T stanica također je ključna za uspješnu antivirusnu imunost [10]. Prethodno, prisutnost CD4 plus ili CD8 plusmemorijaT-stanice su prijavljene u COVID-u-19, međutim, potrebno je temeljito razmotriti funkcionalne kapacitete tih stanica [11-13]. U ovoj studiji, funkcionalna osjetljivost naivnog, efektorskog, središnjegmemorija, i efektorskih memorijskih CD4 plus ili CD8 plus T stanica, koje su dobivene od pacijenata s poviješću COVID-19, protiv dendritičnih stanica (DC) izvedenih iz monocita koje nose antigen SARS-CoV-2 S1.

2. Materijal i metode

2.1. Pacijenti i prikupljanje uzoraka

U dvije različite vremenske točke, uzorci periferne krvi svježe su prikupljeni od pacijenata koji su se oporavili od COVID-a-19 (Tablica 1) i mononuklearne stanice periferne krvi su odvojene gradijentom gustoće Ficoll od 1,077 g/mL (Sigma-Aldrich). Sve su protokole odobrila lokalna etička povjerenstva i Ministarstvo zdravstva Republike Turske. od pacijenata je dobiven informirani pristanak. U studiju su uključeni pacijenti s pozitivnim RT-PCR testom i/ili seropozitivnošću. Klinički simptomi su kategorizirani kao blagi (nehospitalizirani pacijenti), umjereni (pacijenti koji su imali umjerenu upalu pluća) i teški (pacijenti koji su imali tešku upalu pluća i bili su hospitalizirani dulje od 5 dana). Kao kontrola korišteni su uzorci krvi zdravih darivatelja [n=10 (6 žena, 4 muškarca), prosječne dobi 33 godine (min. 28–max. 55)] bez povijesti SARS-CoV-2 i seropozitivnosti.

2.2. Uspostavljanje kokultura DC i T stanica izvedenih iz monocita

DC su generirani iz monocita (CD14 MACS, Miltenyi) prema prethodno objavljenom protokolu [14]. Punjenje antigenom s rekombinantnim S1 proteinom (S1; 10 µg/mL, Abcam) ili HIV Gag antigenom (10 µg/mL, TUBITAK Marmara Research Center) [15] ili toksoidom tetanusa (TT; 10 µg/mL, Turk Ilac) ) započeto je istodobno sa sazrijevanjem DC-a izvedenih iz monocita s LPS-om (1 µg/mL, Sigma-Aldrich). Zreli DC-ovi izvedeni iz monocita stvoreni u odsutnosti a

specifični antigen korišten je kao kontrola. Na kraju 7-dnevne inkubacije, DC-ovi izvedeni iz monocita karakterizirani su kao CD11bhiCD14loCD1a plus CD83 plus populacija.

Od istog COVID{0}} pacijenta, autologni naivni T (TN), terminalno diferencirani efektor T (TEMRA), središnjimemorijaT (TCM), i efektormemorijaT (TEM) stanice su pročišćene (više ili jednako 96 posto) pomoću FACS (FACSAria II; Becton Dickinson) kao CD3-nedirnute, CD19- i CD56- negativni limfociti prema na diferencijalnu ekspresiju markera CD45RA, CD45RO i CCR7 (slika 1A).

DC-ovi izvedeni iz monocita (5x104) su kultivirani s pročišćenim podtipovima T stanica (10 )5 tijekom 96 h u jažici 96-pločice s okruglim dnom koja sadrži 200 µL RPMI 1640 medija s 10 posto FBS-a , 1 posto penicilina/streptomicina (Biological Industries), 5 ng/mL IL-2 (Bio-

Legenda). Prije zajedničkog uzgoja, podtipovi T stanica obilježeni su s 5 µM CFSE (BioLegend). Kao pozitivna kontrola, u kokulture je dodano anti-CD3 antitijelo (HIT3a, 25 ng/mL; BioLegend). Eksperimentalna postavka sažeta je na slici 1A.

2.3. Imunofenotipizacija i testovi povezani s funkcijom protočnom citometrijom

Imunofenotipizacija je provedena s monoklonskim protutijelima anti-humani-CD4 (OKT4), -CD8 (RPA-T8), -CD56 (MEM-188), -CD19 (SJ25C1), -CD45RA (HI100), -CD45RO (UCHL1) ), -CCR7 (G043H7), -CD25 (M-A251), -CD38 (HIT2), -4-1BB (4B4-1), -PD-1 (NAT105), -CD14 (M5E2), -CD11b (ICRF44) (BioLegend); -CD1a (REA736), -CD83 (REA714) (Miltenyi). Srednje vrijednosti intenziteta fluorescencije (MFI) određene su na CD4 plus i CD8 plus T stanicama, te prema CFSE razrjeđenju.

Promjena u MFI izračunata je usporedbom podataka iz kokultura s DC-ima napunjenim antigenom i kontrolnim DC-ovima.

Postotak T stanica s CFSE razrjeđenjem procijenjen je na proliferaciju. Kapacitet proliferacije T-stanica specifičan za antigen izračunat je kao promjena u proliferaciji pri čemu su podaci iz kokultura s kontrolnim DC-ima izvedenim iz monocita korišteni kao normalizatori. Prikupljeni supernatanti korišteni su u multipleks ELISA (LEGENDplex, BioLegend). Sve protočne citometrijske analize provedene su na FACSAria II sorteru.

2.4. Statistička analiza

Rezultati su prikazani kao medijan ± SEM. Za statističku analizu korišteni su Kruskal-Wallisov test i Bonferronijeva korekcija. AP vrijednost<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultati

Nakon inkubacije sa S{{0}}DC, identificiran je mali postotak proliferirajućih T stanica (raspon postotaka, CD4 plus, TN {{10}}).49–6.8, TEMRA 3,29–7,7, TCM 0.38–20.2, TEM 0,2– 16,7; postotak raspona, CD8 plus, TN 0,64–5,6, TEMRA 2,16– 10,3, TCM0,8– 15, TEM 1.6 – 19.4). I CD4 plus i CD8 plus TCM i TEM stanice pokazale su znatno povećanu učestalost proliferacije nego naivne ili efektorske populacije T stanica (slika 1B). CD4 plus TCM stanice i CD8 plus TEM stanice pokazale su najveću proliferativnu aktivnost. CD4 plusmemorijaProliferacija T stanica mogla bi se inducirati u ~90 posto pacijenata s COVID-19, međutim, CD8 plusmemorijaProliferacija T stanica zabilježena je samo u ~60 posto pacijenata (slika 1B). DC-ovi izvedeni iz monocita također su bili napunjeni irelevantnim virusnim antigenom, HIV Gag; očekivano, nije dobiven značajan odgovor u T stanicama osoba koje su preživjele COVID-19 (slika 1C). Slično, T stanice zdravih pojedinaca nisu reagirale na S1-DC. S druge strane, DC izveden iz monocita koji predstavlja TT antigen služio je kao pozitivna kontrola za T stanicememorijaodgovori (slika 1C). Osim toga, površinska ekspresija određenih markera povezanih s aktivacijom, posebno CD25, PD-1 i 4-1BB, bila je značajno pojačana na T-stanicama koje reagiraju na S1- (Slika 1D). S1-DC-stimulirane TEM stanice izlučuju najviše razine IFN-a i IL-6, koje uglavnom proizvode CD4 plus T stanice tipa 1 i CD8 plus citotoksične T stanice. Markeri citotoksičnog odgovora, granzim A, granulizin, Fas ligand (FasL), a posebno granzim B također su bili povišeni u kokulturama koje sadrže TEM stanice pacijenata s COVID-19 (Slika 1E). Supernatanti kokulture iz kojih su izmjereni topivi faktori sadržavali su medijatore koje izlučuju T stanice i DC; stoga, kao što je navedeno u literaturi, DC može proizvesti i umjerene količine citokina kao što su TNF-, IL-6, IL-4 i IFN- [16,17]. U nekim slučajevima, nememorijske T-stanice reagirale su na S1-DC, pojačale ekspresiju CD38 i 4-1BB, te izlučivanje IL-4 i TNF- (Slika 1) . Također je primijećena heterogenost između ispitivanih parametara T stanica i vremena uzimanja uzorka krvi nakon oporavka, ozbiljnosti kliničkih simptoma ili razine anti-S1 protutijela (podaci nisu prikazani).

4. Rasprava

Kod preživjelih od COVID{0}}, cirkulirajuće S1-specifične TEM i TCM stanice zadržale su funkcionalnu osjetljivost i pokazale povećane efektorske kapacitete kao što su aktivacija, proliferacija i lučenje imunoloških medijatora. Iako je proliferativni odgovor umemorijaCD8 plus T stanice nisu bile tako moćne kao u CD4 plusmemorijaT stanica, naši podaci sugeriraju da te stanice mogu brzo prijeći u efektorsko stanje kada su izložene SARS-CoV-2 S1 antigenu. TEM stanice su kritični vratari budući da imaju tendenciju lociranja u tkivima sklona invaziji patogenih mikroorganizama, dok se TCM stanice regrutiraju u sekundarne limfne organe za ubrzavanje imunoloških reakcija koje inauguriraju DC-ovi koji predstavljaju antigen [18]. Iako pokriva ograničen broj slučajeva COVID-19, u našoj studiji većina pacijenata je imala TEM i TCM stanice koje su funkcionalno odgovorile na protein S1 u smislu najmanje jednog testiranog parametra. Ovi preliminarni nalazi mogu ukazivati ​​na vjerojatni nesrazmjer između funkcionalne kompetencije T stanica i težine COVID-19. Prethodno istraživanje pokazalo je veću učestalost S1-specifičnih T stanica od T stanica specifičnih za N i M proteine ​​[8]. U skladu s tim, funkcionalni odgovor T stanica na druge antigene SARS-CoV-2 tek treba bolje razjasniti. Nedavno objavljeni temeljni rad pokazao je prisutnost dugoročnogmemorijau T stanicama pacijenata s COVID-19 [19,20]. Korištenjem posebnog eksperimentalnog pristupa u kojem su autologni DC-ovi izvedeni iz monocita korišteni kao izvediv element za testiranje T-staničnog odgovora, naša je studija potvrdila funkciju i karakter T-stanica prethodno spomenutih kod osoba s COVID-19 poviješću. Prikupljanje dokaza o imunitetu uspostavljenom kod osoba koje su preživjele COVID-19 omogućilo bi bolje razumijevanje patogeneze bolesti, terapijskih pristupa i razvoja cjepiva.

Slika 1. Procjena funkcionalnih odgovora u T stanicama osoba koje su preživjele COVID-19. A) Prikazan je grafički prikaz eksperimentalne postavke. Dendritičke stanice izvedene iz monocita stvorene su od osoba s poviješću COVID-19 i napunjene SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-S1 (S1-DC); zatim, autologni naivni T (TN), terminalno diferencirani efektor T (TEMRA), središnjimemorijaT (TCM), i efektormemorijaT (TEM) stanice su pročišćene i kokultivirane s tim DC-ima. Proliferacija T stanica, ekspresija aktivacijskih markera i izlučivanje citokina mjereni su nakon 96 h inkubacije. B) Promjena u proliferaciji CD4 plus i CD8 plus T stanica nacrtana je za svakog pacijenta u usporedbi s onom dobivenom s kontrolnim ko-kulturama s DC-ima izvedenim iz monocita bez specifičnog punjenja antigenom. Reprezentativni histogrami protočne citometrije dani su na desnoj strani. Kokulture stimulirane s anti-CD3 monoklonskim protutijelom služile su kao tehnička pozitivna kontrola za proliferaciju T stanica. C) Proliferacijski odgovor TCM i TEM stanica na S{{1{{20}}}DC uspoređen je s onima dobivenim s HIV Gag ili s antigenom toksoida tetanusa (TT) -opterećeni DC-ovi. T stanice i S1-DC dobivene od zdravih pojedinaca (S1(hd)) također su korištene kao kontrole. D) Promjene u razinama markera za aktivaciju CD4 plus i CD8 plus T stanica prikazane su u usporedbi s onima dobivenim s kontrolnim kokulturama s DC-ima izvedenim iz monocita bez specifičnog punjenja antigenom. E) Procijenjena je količina citokina povezanih s T stanicama izlučenih u supernatante kokulture. (*p < 0,05,="" **p=""><>

Izjava o autorskom doprinosu CrediT-a

Ece Tavukcuoglu: istraživanje, vizualizacija, formalna analiza, pisanje - pregled i uređivanje. Utku Horzum: istraživanje, vizualizacija, formalna analiza, pisanje - pregled i uređivanje. Ahmet Cagkan Inkaya: Konceptualizacija, resursi. Serhat Unal: Konceptualizacija, Resursi. Gunes Esendagli: Konceptualizacija, Pisanje - pregled i uređivanje, Nadzor.

Izjava o konkurentskom interesu

Autori izjavljuju da nemaju poznatih suprotstavljenih financijskih interesa ili osobnih odnosa koji bi mogli utjecati na rad o kojem se izvještava u ovom radu.

Reference

[1] A. Mazzoni, L. Maggi, M. Capone, M. Spinicci, L. Salvati, MG Colao, A. Vanni, ST Kiros, J. Mencarini, L. Zammarchi, E. Mantengoli, L. Menicacci, E Caldini, S. Romagnani, F. Liotta, A. Morettini, GM Rossolini, A. Bartoloni, L. Cosmi, F. Annunziato, Stanično posredovani i humoralni adaptivni imunološki odgovori na SARS-CoV-2 niži su u asimptomatski nego simptomatski COVID-19 pacijenti, Eur. J. Immunol. 50 (2020) 2013–2024.

[2] Y. Tan, F. Liu, X. Xu, Y. Ling, W. Huang, Z. Zhu, M. Guo, Y. Lin, Z. Fu, D. Liang, T. Zhang, J. Fan, M. Xu, H. Lu, S. Chen, Trajnost neutralizirajućih protutijela i odgovor T-stanica nakon infekcije SARS-CoV-2, Front. Med. 14 (2020.) 746–751.

[3] C. Conte, F. Sogni, P. Affanni, L. Veronesi, A. Argentiero, S. Esposito, Vaccines against coronaviruses: The State of Art, Vaccines (Basel) 8 (2020).

[4] CK Li, H. Wu, H. Yan, S. Ma, L. Wang, M. Zhang, X. Tang, NJ Temperton, RA Weiss, JM Brenchley, DC Douek, J. Mongkolsapaya, BH Tran, CL Lin, GR Screaton, JL Hou, AJ McMichael, XN Xu, T-stanični odgovori na cijeli SARS koronavirus kod ljudi, J. Immunol. 181 (2008) 5490-5500.

[5] M. Koblischke, MT Traugott, I. Medits, FS Spitzer, A. Zoufaly, L. Weseslindtner, C. Simonitsch, T. Seitz, W. Hoepler, E. Puchhammer-Stockl, SW Aberle, M. Fodinger, A. Bergthaler, M. Kundi, FX Heinz, K. Stiasny, JH Aberle, Dinamika odgovora CD4 T stanica i antitijela u COVID-19 pacijenti s različitom težinom bolesti, naprijed. Med. (Lausanne) 7 (2020), 592629.

[6] GA Poljska, IG Ovsyannikova, RB Kennedy, SARS-CoV-2 imunitet: pregled i primjene na kandidate za cjepivo faze 3, Lancet 396 (2020) 1595–1606.

[7] R. Zhou, KK To, YC Wong, L. Liu, B. Zhou, X. Li, H. Huang, Y. Mo, TY Luk, TT Lau, P. Yeung, WM Chan, AK Wu, KC Lung, OT Tsang, WS Leung, IF Hung, KY Yuen, Z. Chen, Akutna infekcija SARS-CoV-2 narušava odgovore dendritičnih stanica i T stanica, Immunity 53 (2020) 864–877 e{ {7}}.

[8] A. Grifoni, D. Weiskopf, SI Ramirez, J. Mateus, JM Dan, CR Moderbacher, SARawlings, A. Sutherland, L. Premkumar, RS Jadi, D. Marrama, AM de Silva, A. Frazier, AF Carlin, JA Greenbaum, B. Peters, F. Krammer, DM Smith, S. Crotty, A. Sette, Ciljevi odgovora T stanica na SARS-CoV-2 Coronavirus kod ljudi s COVID-19 bolešću i Unexposed Individuals, Cell, 181 (2020) 1489-1501 e1415.

[9] PF Canete, CG Vinuesa, COVID-19 čini da B stanice zaborave, ali T stanice pamte, Cell 183 (2020) 13–15.

[10] I. Schulien, J. Kemming, V. Oberhardt, K. Wild, LM Seidel, S. Killmer, F. Sagar, MS Daul, A. Lago, H. Decker, B. Luxenburger, D. Binder, O Bettinger, S. Sogukpinar, M. Rieg, D. Panning, M. Huzly, G. Schwemmle, CF Kochs, A. Waller, D. Nieters, F. Duerschmied, HE Emmerich, AR Mei, S. Schulz, DA Llewellyn -Lacey, T. Price, B. Boettler, R. Bengsch, M. Thimme, C.-H. Hofmann, Karakterizacija već postojećih i induciranih SARS-CoV-2-specifičnih CD8(plus) T stanica, Nat. Med. 27 (2021) 78–85.

[11] I. Odak, J. Barros-Martins, B. Bošnjak, K. Stahl, S. David, O. Wiesner, M. Busch, M.

M. Hoeper, I. Pink, T. Welte, M. Cornberg, M. Stoll, L. Goudeva, R. Blasczyk, A. Ganser, I. Prinz, R. Forster, C. Koenecke, CR Schultze-Florey, Ponovno pojavljivanje efektorskih T stanica povezana je s oporavkom od COVID-19, EBioMedicine 57 (2020), 102885.

[12] AE Oja, A. Saris, CA Ghandour, NAM Kragten, BM Hogema, EJ Nossent, LMA Heunks, S. Cuvalay, E. Slot, F. Linty, FH Swaneveld, H. Vrielink, G. Vidarsson, T. Rispens, E. van der Schoot, RAW van Lier, A. Ten Brinke, P. Hombrink, Divergentni SARS-CoV-2-specifični odgovori T- i B-stanica kod pacijenata s teškim, ali ne i blagim COVID-om-19 , Eur. J. Immunol. 50 (2020) 1998–2012.

[13] B. Kratzer, D. Trapin, P. Ettel, U. Kormoczi, A. Rottal, F. Tuppy, M. Feichter, P. Gattinger, K. Borochova, Y. Dorofeeva, I. Tulaeva, M. Weber, K. Grabmeier-Pfistershammer, PA Tauber, M. Gerdov, B. Muhl, T. Perkmann, I. Fae, S. Wenda, H. Fuhrer , R. Henning, R. Valenta, WF Pickl, Imunološki otisak COVID-19 na populaciji leukocita periferne krvi u ljudi, Alergija (2020.).

[14] AM Bruger, C. Vanhaver, K. Bruderek, G. Amodio, E. Tavukcuoglu, G. Esendagli, S. Gregori, S. Brandau, P. van der Bruggen, Protokol za procjenu supresije proliferacije T-stanica ljudskim MDSC, Methods Enzymol. 632 (2020) 155–192.

[15] SA Younes, B. Yassine-Diab, AR Dumont, MR Boulassel, Z. Grossman, JP Routy, RP Sekaly, HIV-1 viremija sprječava uspostavljanje interleukina 2- koji proizvodi HIV-specifičanmemorijaCD4 plus T stanice obdarene proliferativnim kapacitetom, J. Exp. Med. 198 (2003) 1909–1922.

[16] DM Frucht, T. Fukao, C. Bogdan, H. Schindler, JJ O'Shea, S. Koyasu, IFN-gama proizvodnja stanicama koje predstavljaju antigen: pojavljuju se mehanizmi, Trends Immunol. 22 (2001) 556–560.

[17] EO Gubernatorova, EA Gorshkova, OA Namakanova, RV Zvartsev, J. Hidalgo, MS Drutskaya, AV Tumanov, SA Nedospasov, Nesuvišne funkcije IL-6 koje proizvode makrofagi i dendritične stanice u alergijskoj upali dišnih putova, Ispred. Immunol. 9 (2018) 2718.

[18] YD Mahnke, TM Brodie, F. Sallusto, M. Roederer, E. Lugli, Tko je tko u diferencijaciji T-stanica: ljudskimemorijaPodskupine T-stanica, Eur. J. Immunol. 43 (2013) 2797–2809.

[19] JM Dan, J. Mateus, Y. Kato, KM Hastie, ED Yu, CE Faliti, A. Grifoni, SI Ramirez, S. Haupt, A. Frazier, C. Nakao, V. Rayaprolu, SA Rawlings, B Peters, F. Krammer, V. Simon, EO Saphire, DM Smith, D. Weiskopf, A. Sette, S. Crotty, Imunološkimemorijana SARS-CoV-2 procijenjeno do 8 mjeseci nakon infekcije, Science 371 (2021).

[20] LB Rodda, J. Netland, L. Shehata, KB Pruner, PA Morawski, CD Thouvenel, KK Takehara, J. Eggenberger, EA Hemann, HR Waterman, ML Fahning, Y. Chen, M. Hale, J. Rathe, C. Stokes, S. Wrenn, B. Fiala, L. Carter, JA Hamerman, NP King, M. Gale, Jr., DJ Campbell, DJ Rawlings, M. Pepper, Functional SARS-CoV{ {2}}specifični imunimemorijatraje nakon blage bolesti COVID-19, Cell, 184 (2021.) 169-183 e117.