FOXO regulira ekspresiju antimikrobnih peptida i potiče fagocitozu hemocita u škampima Antibakterijski imunitet
Aug 31, 2023
Sažetak
Beskralješnjaci se oslanjaju na urođeni imunitet, uključujući humoralni i stanični imunitet, kako bi se oduprli patogenoj infekciji. Prethodne studije pokazale su da transkripcijski faktor O (FOXO) sudjeluje u mukoznim imunološkim odgovorima sisavaca i crijevnoj humoralnoj imunološkoj regulaciji beskralješnjaka. Međutim, ostaje nepoznato je li FOXO uključen u sustavnu i staničnu regulaciju imuniteta beskralješnjaka. U ovoj smo studiji identificirali FOXO iz račića (Marsupenaeus japonicus) i otkrili da je eksprimiran na relativno bazalnim razinama u normalnim račićima, ali je bio značajno pojačan u račićima zaraženim Vibrio anguillarum. FOXO je odigrao ključnu ulogu u održavanju hemolimfe i homeostaze crijevne mikrobiote promicanjem ekspresije Relisha, faktora transkripcije puta imunološke deficijencije (IMD) za ekspresiju antimikrobnih peptida (AMP) u račićima. Također smo otkrili da infekcija patogenom aktivira FOXO i inducira njegovu nuklearnu translokaciju smanjenjem aktivnosti serin/treonin kinaze AKT. U jezgri je aktivirani FOXO izravno regulirao ekspresiju svojih ciljnih gena Amp i Relish protiv bakterijske infekcije. Nadalje, identificirano je da je FOXO uključen u staničnu imunost promicanjem fagocitoze hemocita pojačanom ekspresijom fagocitoznog receptora čistača C (Src) i dvije male GTPaze, Rab5 i Rab7, koje su povezane s prometom fagosoma u lizosom. u citoplazmi. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da FOXO djeluje na homeostazu hemolimfe i crijevnu mikrobiotu aktiviranjem IMD puta u normalnim račićima, te izravno ili neizravno promičući ekspresiju AMP-a i pojačavajući fagocitozu hemocita protiv patogena u račića zaraženih bakterijama. Ova studija otkrila je različite funkcije FOXO-a u mukoznoj (lokalnoj) i sustavnoj antibakterijskoj imunosti beskralješnjaka.
dobrobiti dodatka cistanche-kako ojačati imunološki sustav
Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta
【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Uvod
Proteini obitelji transkripcijskih faktora O (FOXO) uključeni su u različite kritične biološke procese organizama, uključujući regulaciju staničnog ciklusa, popravak oštećene DNK, imunitet protiv raka i regulaciju životnog vijeka [1,2]. Sisavci imaju četiri različita FOXO proteina (FOXO1, FOXO3, FOXO4 i FOXO6); međutim, beskralješnjaci imaju samo jedan FOXO, koji je također poznat kao Daf-16 u Caenorhabditis elegans [3]. Transkripcijska aktivnost FOXO regulirana je s nekoliko vrsta post-translacijskih modifikacija, kao što su fosforilacija, acetilacija, metilacija i ubikvitinacija [4]. Ove modifikacije utječu na nuklearnu translokaciju ili izlazak FOXO iz jezgre i njegovu interakciju s korepresorima i koaktivatorima, koji mogu pospješiti ili smanjiti aktivnost FOXO i posredovati u njegovim različitim biološkim funkcijama [5,6]. Nakon aktivacije, FOXO sudjeluje u mnogim fiziološkim funkcijama reguliranjem transkripcije različitih ciljnih gena [7]. FOXO se aktiviraju različitim izvanstaničnim podražajima, uključujući faktore rasta, citokine i hormone [8]. Signali rasta, kao što je inzulin ili faktor rasta sličan inzulinu 1 (IGF-1), stupaju u interakciju s receptorima inzulinskog puta i aktiviraju signaliziranje fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K), što dovodi do fosforilacije FOXO-a putem serin/treonin kinaza, protein kinaza B (AKT) [9]. Fosforilirani FOXO translocira se iz jezgre u citosol ili sprječava njegovu translokaciju iz citosola u jezgru, gdje postaje ubikvitiniran, što dovodi do njegove razgradnje od strane proteasoma [10]. Nasuprot tome, u nedostatku vanjskih signala rasta, signalni put PI3K-AKT je neaktivan, a nefosforilirani FOXO translocira u jezgru kako bi pospješio transkripciju ciljnog gena [11]. FOXO također sudjeluje u antibakterijskim i antivirusnim urođenim imunološkim odgovorima beskralješnjaka [12,13]. Kronična aktivacija FOXO u starim crijevima Drosophile potiskuje ekspresiju proteina za prepoznavanje peptidoglikana SC2 (negativni regulator puta imunološke deficijencije (IMD)) i narušava intestinalnu imunološku homeostazu [14]. FOXO izravno regulira gene za antimikrobne peptide (AMP) u epitelnim tkivima neinficirane Drosophile kao odgovor na stres gladovanja, koji je neovisan o putovima urođenog imuniteta koji reagiraju na patogene [15]. Međutim, infekcija patogenom također može potaknuti enterocitni FOXO da uđe u jezgru iz citoplazme izravno u crijevima Drosophile [12]. Regulacija AMP-a ovisna o FOXO također se javlja u epitelnim tkivima sisavaca, što sugerira da je to evolucijski očuvano u životinja [16]. Nekoliko je studija pokazalo da se FOXO aktiviraju uz pomoć patogena ili stimulacije citokina u mukoznim imunološkim odgovorima [17]. Njihovo premještanje u jezgru i vezanje na promotore njihovih ciljnih gena stimulirano je putem mitogen-aktivirane proteinske (MAP) kinaze, a inhibirano putem PI3K/AKT. Ciljni geni FOXO uključuju proupalne signalne molekule, adhezijske molekule i kemokinske receptore [17]. Ostaje nejasno jesu li FOXO uključeni u sustavne imunološke odgovore protiv patogena. Poticanje ekspresije AMP-a protiv patogena važan je mehanizam humoralne urođene imunosti u beskralješnjaka [18]. U urođenom imunitetu Drosophile, putovi Toll i IMD uključeni su u regulaciju ekspresije AMP, a AMP igraju važnu ulogu u eliminaciji invazivnih patogena [19-21]. Slično imunitetu insekata, putevi Toll, IMD i Janus kinaza (JAK)/pretvornik signala i aktivator transkripcije (STAT) uključeni su u regulaciju ekspresije AMP u rakova [22,23]. Može li FOXO regulirati ekspresiju AMP neovisno o putevima Toll, IMD i JAK/STAT protiv infekcije patogenima kod rakova, zahtijeva pojašnjenje. Osim humoralne imunosti, beskralješnjaci se također oslanjaju na staničnu imunost za obavljanje funkcija urođene imunosti protiv patogene infekcije. Fagocitoza hemocita jedan je od važnih mehanizama staničnog imuniteta protiv patogene infekcije [24]. Prethodne studije su otkrile da je autofagija posredovana FOXO1-potrebna za razvoj stanica prirodnih ubojica (NK) [25]. Štoviše, FOXO je uključen u promicanje bakterijske fagocitoze neutrofila [26]. Iako u rakova ne postoje specijalizirane imunološke stanice, kao što su NK stanice ili neutrofili, hemociti račića mogu ispoljiti sistemski urođeni imunitet protiv infekcije patogenim bakterijama putem fagocitoze [27]. Međutim, nije jasno sudjeluje li FOXO u patogenoj fagocitozi hemocita u račićima. Akvakultura račića jedna je od najbrže rastućih svjetskih industrija za proizvodnju životinjskih bjelančevina i dala je značajan doprinos zadovoljavanju povećane svjetske potražnje za životinjskim bjelančevinama. Trenutačno je globalna proizvodnja škampa približno 4,88 milijuna tona s vrijednošću od oko 39 milijardi USD [28]. Međutim, zajednički uzgoj velikog broja životinja dovodi do značajnog stresa kod životinja, što olakšava razmnožavanje patogena, uključujući bakterije i viruse, i kliničke bolesti, što rezultira velikim ekonomskim gubicima za industriju [29]. Studije imunoloških mehanizama račića mogle bi pružiti nove strategije za prevenciju i kontrolu bolesti [30]. U ovoj studiji identificirali smo FOXO u kuruma račićima (Marsupenaeus japonicus). Nakon obaranja Foxo ekspresije, nakon izazivanja Vibrio anguillarum, otkrili smo da se sposobnost čišćenja bakterija i stopa preživljavanja račića značajno smanjila. Daljnje studije su pokazale da FOXO izravno ili neizravno potiče ekspresiju AMP-ova i pojačava fagocitozu bakterija u račićima. Analizirani su mogući mehanizmi djelovanja FOXO-a na infekciju patogenima u račićima.
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
Rezultati
FOXO se eksprimira na bazalnim razinama u nezaraženim račićima i pojačava se u račićima zaraženim V. anguillarumom
Iz sekvenciranja transkriptoma hemocita M. japonicus, dobili smo cDNA sekvencu pune duljine Foxo (GenBank pristupni broj: MW080526). Usporedba domena pokazala je da predviđeni FOXO protein ima Forkhead (FH) domenu, koja je slična Homosapiens FOXOs uključujući FOXO1, FOXO3, FOXO4 i FOXO6, i nosi sličnu AKT fosforilaciju (S1A Slika). Rezultati filogenetske analize pokazali su da su FOXO podijeljeni u dva klastera uključujući FOXO kralješnjaka i beskralješnjaka, a FOXO račića je grupiran u grani beskralješnjaka u filogenetskom stablu (S1B Slika). Slično ljudskim FOXO [31], FOXO račića ima mjesta modifikacije fosforilacije izvanstanične regulirane kinaze (ERK) i mjesta modifikacije acetilacije CREB vezujućeg proteina (CBP), ali nema mjesta modifikacije deacetilacije sir tuina 1 (SIRT1) i c-JUN N-terminal mjesta modifikacije fosforilacije kinaze (JNK) (S2 Slika). Poliklonska protutijela koja prepoznaju FOXO račića pripremljena su pomoću rekombinantne FH domene FOXO eksprimirane u Escherichia coli (Slika 1A). Analiza distribucije FOXO u tkivima na razini mRNA i proteina otkrila je da je eksprimiran u svim testiranim tkivima (Slika 1B). Vremenski tijek ekspresije FOXO u hemocitima i crijevima račića zaraženih V. anguillarumom analiziran je pomoću qPCR i Western blottinga. Rezultati su pokazali da je FOXO pojačano reguliran u hemocitima i crijevima na razini mRNA (Slika 1C i 1D) i na razini proteina (Slika 1E i 1F). Ovi rezultati sugeriraju da je FOXO uključen u odgovor na infekciju V. anguillarumom i potaknuli su nas da istražimo funkciju FOXO-a u imunitetu račića.
FOXO sudjeluje u regulaciji homeostaze hemolimfe i crijevne mikroflore zdravih račića
Kako bi se istražila funkcija FOXO u hemolimfi i homeostazi crijevne mikroflore u račića, provedena je interferencija RNA i analizirano je bakterijsko opterećenje. Rezultati su pokazali da se ekspresija Foxo značajno smanjila u Foxo-RNAi račića (Slika 2A i 2B). Neciljani učinci Foxo RNAi također su analizirani otkrivanjem ekspresije drugih gena obitelji Fox (uključujući Foxk2 i Foxn3). Rezultati su pokazali da nokdaun Foxo nije smanjio razinu ekspresije Foxk2 ili Foxn3 (S3A-S3C Slika). Koristeći Western blotting i fluorescentne imunocitokemijske testove, dalje smo promatrali subcelularnu distribuciju FOXO-a u crijevima i hemocitima račića izazvanih bakterijama nakon utišavanja Foxo-a. Rezultati su pokazali da se u usporedbi sa skupinom koja je primala dsGfp, razina FOXO u jezgri značajno smanjila u Foxo-RNAi račića, čak i ako su račići bili zaraženi V. anguillarum (S3D–S4E' Slike). Svi gornji rezultati sugeriraju da bi naš Foxo RNAi test mogao specifično utišati Foxo u hemocitima i crijevima (uključujući u citoplazmi i jezgri). Zatim smo analizirali bakterijsko opterećenje u hemolimfi i crijevima nakon nokdauna Foxo u račićima u normalnim uvjetima (bez izazivanja bakterija). Rezultati su pokazali da se broj bakterija u hemolimfi i crijevima značajno povećao nakon što je Foxo ekspresija uspješno oborena (Slika 2C i 2D). Nadalje smo analizirali stopu preživljavanja Foxo-RNAi račića bez bakterijskog izazivanja, a rezultati su pokazali da se stopa preživljavanja Foxo-knockdown račića značajno smanjila u usporedbi s kontrolom (Slika 2E). Kako bismo dodatno potvrdili ove rezultate, analizirali smo stopu preživljavanja Foxo-RNAi račića liječenih antibioticima i rezultati su pokazali da u usporedbi sa skupinom dsGfp, stopa preživljavanja račića bez klica nije značajno smanjena (Slika 2F). Svi rezultati sugeriraju da FOXO igra ulogu u homeostazi in vivo mikrobiote (uključujući hemolimfu i crijevnu mikrobiotu) u račića u normalnim uvjetima.
koristi dodatka cistanche-povećavaju imunitet
FOXO sudjeluje u regulaciji hemolimfe i homeostaze crijevne mikroflore potičući ekspresiju Relish i Amp kod zdravih račića
Prethodne studije pokazuju da zdravi škampi sadrže nizak, ali stabilan broj bakterija u cirkulirajućoj hemolimfi, i visoke, iako konstantne količine bakterija u gastrointestinalnom traktu, i imunološke efektore, kao što su antimikrobni peptidi (AMP) regulirani nuklearnim faktorom kappa B (NF -κB) put i reaktivne kisikove vrste (ROS) regulirani putem dualne oksidaze (DUOX), igraju ključnu ulogu u homeostazi hemolimfe i crijevnoj mikrobioti [32-34]. Kako bismo istražili mehanizam uključenosti FOXO-a u regulaciju hemolimfe i homeostaze crijevne mikroflore u normalnim uvjetima, prvo smo otkrili subcelularnu distribuciju FOXO-a u hemocitima i crijevima u normalnim uvjetima. Rezultati su pokazali slab signal FOXO-a u jezgrama hemocita račića i crijevnih stanica u normalnim uvjetima (Slike 3A i 3B), što sugerira da se malo FOXO-a aktiviralo in vivo mikrobiotom u račićima u normalnim uvjetima. Ekspresiju AMP regulira IMD put u crijevima Drosophile [35]. Stoga smo pretpostavili da bi faktor transkripcije Relish mogao biti ciljni gen FOXO. Otkrili smo ekspresiju mRNA Relisha, faktora transkripcije puta IMD, u hemocitima i crijevima račića nakon nokdauna Foxoa. Rezultati su pokazali da se ekspresija Relisha značajno smanjila u Foxo-knockdown škampi (Slika 3C i 3D), a slični su rezultati dobiveni na razini proteina (Slika 3E i 3E'). Rezultati su sugerirali da bi FOXO mogao potaknuti izražavanje Relisha i aktivirati IMD put. Kako bi se potvrdilo da FOXO sudjeluje u hemolimfi i homeostazi gastrointestinalnog trakta putem IMD signalizacije, dobiveni su račići bez klica (Slika 3F) i otkrivena je aktivacija RELISH-a i ekspresija AMP-a. U usporedbi s kontrolom, količina FOXO i RELISH u jezgrama crijevnih stanica i hemocita značajno se smanjila (Slika 3G i 3H). U međuvremenu, ekspresija AMP-ova, uključujući Crustine (CrusI-2 do 5) i antilipopolisaharidne faktore (Alf A1, B1, C1, D1 i E1), vjerojatno regulirane FOXO-om i/ili RELISH-om, pretražena je u klici -free račića, a rezultati su pokazali da se ekspresija CrusI-3, Alf-B1 i Alf-C1 značajno smanjila u hemocitima i crijevima račića (Slika 3I i 3J). S obzirom na to da je ekspresija Alf-B1 i Alf C1 bila regulirana putem IMD [36], ovi rezultati upućuju na to da FOXO sudjeluje u regulaciji homeostaze hemolimfe i gastrointestinalnog trakta u normalnim uvjetima kroz IMD put za promicanje ekspresije AMP-ovi.
Slika 1. FOXO je pojačano reguliran u račićima zaraženim V. anguillarumom. (A) Rekombinantna ekspresija FH domene FOXO u E. coli i Western blotting za otkrivanje FOXO korištenjem poliklonalnih protutijela protiv FOXO pripremljenih u kunićima. Traka 1, ukupni proteini E. coli s Foxo-pGEX4T-1. Traka 2, ukupni proteini bakterija nakon indukcije IPTG. Traka 3, pročišćeni rekombinantni FOXO. Traka 4, FOXO u crijevima netretiranih račića detektiran je korištenjem Western blottinga. M, Oznake molekulske mase proteina. (B) Distribucija Foxoa u tkivu na razini mRNA (gornja ploča) i proteina (donja ploča) otkrivena je pomoću RT-PCR odnosno Western blottinga. ACTB je skraćenica od -actin. (C, D) Obrasci ekspresije mRNA za Foxo u hemocitima (C) i crijevima (D) analizirani su qPCR-om korištenjem geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (E, F) Obrasci ekspresije proteina FOXO u hemocitima (E) i crijevima (F) otkriveni su Western blotingom. Rezultati statističke analize triju ponavljanja prikazani su na donjim pločama. Trake na western blotu digitalizirane su pomoću softvera ImageJ skeniranjem traka iz tri neovisna ponavljanja. Relativne razine ekspresije FOXO/-aktina izražene su kao srednja vrijednost ± SD, a vrijednost kontrolnog račića postavljena je kao jedan. Trake pogrešaka na slici označavaju SD (tri ponavljanja).
FOXO se aktivira u račićima izazvanom V. anguillarum i sudjeluje u uklanjanju patogena iz hemolimfe i crijeva
Zabilježeno je da se FOXO može aktivirati bakterijskom ili citokinskom stimulacijom te da se translocira u jezgru kako bi regulirao ekspresiju određenih ciljnih gena u sisavaca [17]. Kako bi se otkrilo je li FOXO aktiviran u račićima zaraženim bakterijama, subcelularna distribucija FOXO u crijevima račića analizirana je pomoću Western blottinga. Rezultati su pokazali da se količina FOXO u citoplazmi crijevnih stanica postupno smanjivala od 2 do 4 sata nakon izlaganja V. anguillarum (Slika 4A). Nasuprot tome, količina FOXO u jezgri crijevnih stanica značajno se povećala nakon infekcije s V. anguillarum (Slika 4B). Kako bi se analizirala uloga FOXO u sustavnom imunitetu, korišten je fluorescentni imunocitokemijski test za promatranje nuklearne translokacije FOXO u hemocitima račića 2 sata nakon V. godišnje stimulacije larumom. Otkrili smo da se translokacija FOXO izazvana bakterijskim izazovom u jezgru značajno povećala, ali nije bilo očite promjene u račićima izazvanim PBS-om (Slika 4C i 4C'). Kako bismo istražili je li nuklearni translocirani FOXO uključen u uklanjanje patogena, analizirali smo bakterijsko opterećenje u hemolimfi i crijevima u Foxo-nockdown škampima 6 sati nakon bakterijskog izlaganja. Otkrili smo da se nakon nokdauna Foxo-a, opterećenje bakterijama u hemolimfi i crijevima značajno povećalo u usporedbi s onim u kontrolnim skupinama (Slika 4D). Štoviše, stopa preživljavanja Foxo-knockdown račića zaraženih s V. anguillarum značajno se smanjila u usporedbi s kontrolom (Slika 4E). Ovi rezultati su pokazali da se FOXO aktivirao u crijevnim stanicama i hemocitima, te sugerirali da FOXO sudjeluje u lokalnom i sustavnom imunološkom odgovoru protiv bakterijske infekcije.
Slika 2. FOXO sudjeluje u intestinalnim (lokalnim) i sistemskim antibakterijskim imunološkim odgovorima. (A, B) Učinkovitost Foxo-RNAi u hemocitima (A) i crijevima (B) račića, kako je utvrđeno pomoću qPCR (A) i Western blottinga (B). Analiza datuma qPCR korištenjem geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. Trake pogrešaka prikazuju SD. (C) Detekcija hemolimfnih bakterija Foxo-knockdown škampi čvrstom LB kulturom (tri ponavljanja); Injekcija dsGfp korištena je kao kontrola. Omjer razrjeđivanja bio je 1:10. (D). Broj bakterija u hemolimfi i crijevima u Foxo škampima s nokdaunom i dsGfp-injection škampima bez izazivanja bakterija. (E). Stopa preživljavanja Foxo-RNAi račića bez izazivanja bakterija. Injekcija dsGfp korištena je kao kontrola. (F). Stopa preživljavanja Foxo-RNAi račića liječenih antibioticima. Injekcija dsGfp korištena je kao kontrola. Normalno: divlji škampi koji nisu tretirani antibioticima.
Slika 3. Bazalna količina FOXO-a translocira se u jezgre hemocita i crijevnih stanica, potiče ekspresiju Relisha i nakon toga aktivira IMD put za regulaciju hemolimfe i homeostaze crijevne mikrobiote u normalnim uvjetima. (A) Imunocitokemija je korištena za otkrivanje substanične distribucije FOXO u hemocitima normalnih račića. Mjerna traka=20 μm. Cy: citoplazma; Nu: Nukleus. (B) Western blotting korišten je za otkrivanje subcelularne distribucije FOXO u stanicama crijeva normalnih račića i račića zaraženih V. anguillarumom. (C) Ekspresija Relisha na razini mRNA otkrivena je u hemocitima račića nakon nokdauna Foxo pomoću qPCR-a korištenjem geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (D) Ekspresija Relisha na razini mRNA u crijevima račića nakon nokdauna Foxo detektirana je qPCR-om pomoću geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (E) Razina RELISH otkrivena je western blotingom u škampima nakon nokdauna Foxoa. (E') Tri replika panela E digitalizirana su pomoću softvera ImageJ. (F) Bakterijska količina hemolimfe i crijeva u račićima 24 sata nakon liječenja antibioticima. (G) FOXO u jezgri otkriven je korištenjem Western blottinga u hemocitima i crijevima račića 24 sata nakon tretmana antibioticima. (H) RELISH u jezgri otkriven je korištenjem Western blottinga u hemocitima i crijevima račića 24 sata nakon tretmana antibioticima. (I, J) Ekspresija Amps u hemocitima (I) i crijevima (J) račića bez klica određena je qPCR-om pomoću -aktina i Ef-1 kao internih referentnih gena. Normalni škampi (injekcija H2O) korišteni su kao kontrola.
Prethodne studije pokazale su da je transkripcijska aktivnost FOXO regulirana modifikacijom fosforilacije i da serin/treonin kinaza AKT regulira aktivnost Forkheadovih transkripcijskih faktora tako što ih fosforilira i inhibira njihovu nejasnu translokaciju [9,37]. Kako bismo istražili utječe li AKT na porast FOXO u jezgri nakon infekcije patogenim bakterijama, prvo smo detektirali sadržaj FOXO u citoplazmi i jezgri Western blotom nakon obaranja Akt račića. Rezultati su pokazali da se količina FOXO u jezgri hemocita i crijevnih stanica značajno povećala nakon obaranja ekspresije Akt (Slika 5A i 5B) u račića 2 sata nakon infekcije s V. anguillarum (Slika 5C i 5C'). Kako bismo potvrdili eksperimentalne rezultate, također smo upotrijebili imunocitokemijski test za promatranje subcelularne distribucije FOXO u hemocitima račića nakon nokdauna Akt. Rezultati su pokazali da je FOXO značajno povećan u jezgri hemocita kada je Akt oborio 2 sata nakon infekcije s V. anguillarum (Slika 5D i 5D'). Kako bismo istražili utječe li infekcija patogenom na aktivnost AKT-a, otkrili smo promjenu fosforilacije AKT-a nakon infekcije patogenom pomoću humanog p-AKT (Ser473) protutijela (mjesto fosforilacije AKT-a račića je Ser486) i otkrili da se razina fosforiliranog AKT-a značajno smanjila u hemocita i crijeva račića nakon 30 minuta infekcije V. anguillarum (Slika 5E i 5F). Ovi rezultati sugeriraju da infekcija patogenom može smanjiti razinu fosforiliranog AKT-a, koji inhibira aktivnost enzima i smanjuje sposobnost AKT-a da fosforilira FOXO. Nefosforilirani FOXO ulazi u jezgru i inducira ekspresiju svojih ciljnih gena. brojka označava SD.
ekstrakt cistanke
Infekcija patogenom smanjuje aktivnost AKT i inducira translokaciju jezgre FOXO
FOXO vrši imunološku obranu od napadačkih bakterija reguliranjem ekspresije antimikrobnih peptida u račićima zaraženim bakterijama
Kako bismo istražili mehanizam kojim FOXO utječe na odgovor protiv bakterijske infekcije u škampima, prvo smo identificirali imunološke efektorske gene koje regulira FOXO. Nakon uspješnog nokdauna Foxo u hemocitima i crijevima račića sa ili bez izazivanja V. anguillarumom, razine ekspresije CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 i Alf-E1 značajno su se smanjile u utišanim račićima u usporedbi s onima u kontrolnoj skupini (Slika 6A i 6B). Kako bismo dodatno potvrdili rezultate, također smo detektirali ekspresiju četiri AMP-a nakon nokdauna Akt. Rezultati su pokazali da se ekspresija četiri AMP-a značajno povećala 6 sati nakon infekcije V. anguil larum u usporedbi s onom u kontrolnoj skupini (Slika 6C i 6D). U usporedbi s reguliranim AMP-ovima (uključujući Alf-B1 i Alf-C1) u normalnim uvjetima (Slika 3I i 3J), dodatni gen AMP-ova (CrusI-3, Alf-E1) također je reguliran naviše u račićima zaraženim V anguillarum (Slika 6A i 6B). Naša prethodna studija pokazala je da RELISH potiče ekspresiju Alf-B1 i Alf-C1 u škampima [36]. Ovi rezultati pokazuju da FOXO može izravno regulirati ekspresiju AMP-a, kao što su CrusI-3 i Alf-E1, neovisno o IMD signalnom putu. Kako bi se potvrdila hipoteza, proveden je ChIP test kako bi se otkrilo može li se FOXO vezati na promotor Alf-E1. Dobivena je promotorska sekvenca Alf-E1 (S4 Slika) i predviđena su vezna mjesta FOXO (Slika 6E). Rezultat ChIP-a pokazao je da se FOXO može vezati na promotor Alf-E1 (Slika 6F). Ovi rezultati sugeriraju da FOXO također sudjeluje u antibakterijskom imunitetu izravnim reguliranjem ekspresije AMP-a u račićima.
Slika 4. FOXO translociran u jezgru račića zaraženih V. anguillarumom. (A, B) Obrasci distribucije FOXO u citoplazmi (A) i jezgri (B) crijevnih stanica račića izazvanih bakterijama, kako je analizirano korištenjem Western blottinga (donje ploče A i B). Western blotting trake su digitalizirane korištenjem ImageJ softvera skeniranjem traka iz tri ponavljanja. Relativne razine ekspresije FOXO/-aktina ili FOXO/Histona 3 izražene su kao srednja vrijednost ± SD, a vrijednost kontrolnog račića postavljena je kao jedan. (C) Nuklearna translokacija FOXO u hemocitima račića 2 sata nakon V. anguillarum izazov je otkriven korištenjem fluorescentnih imunocitokemijskih testova. PBS injekcija korištena je kao kontrola. Mjerna traka=20 μm. (C') Statistička analiza panela C Kolokalizacija FOXO i DAPI-obojenih jezgri u hemocitima analizirana je softverom WCIF ImageJ. (D) Broj bakterija u hemolimfi i crijevima Foxo-knockdown račića nakon injekcije V. anguillarum; Kao kontrola korištena je dsGfp-injekcija u račiće nakon bakterijske injekcije. (E) Stopa preživljavanja Foxo-RNAi račića zaraženih V. anguillarumom. Injekcija dsGfp korištena je kao kontrola.
FOXO potiče fagocitozu hemocita protiv bakterija promicanjem ekspresije SRC-a
Prethodne studije su izvijestile da FOXO izravno komunicira s promotorskim regijama CXCR2 i CD11b kako bi regulirao fagocitozu neutrofila u sisavaca [26]. Kako bismo ispitali je li FOXO povezan s fagocitozom hemocita u antibakterijskom imunitetu račića, ispitali smo brzinu fagocita nakon interferencije s Foxom koristeći različite metode. Nakon nokdauna Foxo-a, stopa fagocita i fagocitni indeks skupine s Foxo-nokdaunom bili su značajno niži od onih u kontrolnoj skupini (dsGfp) (Slika 7A i 7A'). Također smo koristili protočnu citometriju za kvantificiranje stope fagocita hemocita nakon utišavanja Foxo-a. Rezultati su pokazali da se stopa citoze faga skupine Foxo-RNAi također značajno smanjila u usporedbi s onom skupine dsGfp (Slika 7B i 7B'). Kako bismo dodatno potvrdili ove rezultate, također smo ispitali stopu fagocita nakon obaranja Akt. Rezultati su pokazali da su se u usporedbi s onima kontrolne skupine, stopa fagocita i fagocitni indeks značajno povećali (Slika 7C i 7C'). Ovi rezultati sugeriraju da FOXO potiče fagocitozu hemocita u račića. Kako bismo istražili kako FOXO pojačava fagocitozu hemocita u račića, otkrili smo ekspresiju prethodno prijavljenih gena uključenih u fagocitozu račića. Zabilježeno je da su receptori čistači klase B (SRB) i klase C (SRC) uključeni u fagocitozu hemocita [38,39]. Otkrili smo da se razina ekspresije mRNA Src, a ne Srb, značajno smanjila nakon utišavanja Foxo u hemocitima i crijevima (Slika 7D i 7E), dok je ekspresija Src značajno porasla nakon nokdauna Akt u račićima (Slika 7F). Slični rezultati dobiveni su na razini proteina (Slika 7G i 7G'). Ovi rezultati sugeriraju da FOXO potiče fagocitozu hemocita patogena u račićima promicanjem ekspresije SRC-a.
FOXO potiče ekspresiju RAB5 i RAB7 tijekom fagocitoze u račića
Prethodne studije pokazale su da su male GTPaze, RAB5 i RAB7, ključni regulatori transporta novoendocitoziranih vezikula do ranih i kasnih endosoma [40]. RAB5 je ključni regulator početnih događaja fuzije i marker je ranih endosoma [41,42]. RAB7 je potreban za kasnu fuziju fagosoma i lizosoma i marker je kasnih endosoma [43]. Kako bismo istražili jesu li RAB5 i RAB7 uključeni u uklanjanje patogena u račićima, prvo smo analizirali obrasce ekspresije Rab5 i Rab7 i otkrili da su dvije male GTPaze bile regulirane na gore u račićima izazvanim bakterijama (S5A-S5D Slika). Dalje smo analizirali stopu preživljavanja Rab5-RNAi i Rab7-RNAi račića nakon izlaganja bakterijama, a rezultati su pokazali da se stopa preživljavanja Rab5 i Rab7 nokdaun račića značajno smanjila u usporedbi s kontrolom ( S5E i S5F sl.). Ovi rezultati sugeriraju da RAB5 i RAB7 igraju važne funkcije u otpornosti na bakterijske patogene. Kako bismo istražili jesu li RAB5 i RAB7 uključeni u fagocitozu posredovanu FOXO, ispitali smo razine ekspresije mRNA Rab5 i Rab7 nakon interferencije s ekspresijom Foxo u račićima. Rezultati su pokazali da su se razine ekspresije Rab5 i Rab7 značajno smanjile u hemocitima i crijevima (Slike 8A i S6A). dok se ekspresija Rab5 i Rab7 značajno povećala nakon nokdauna Akt u račićima (Slika 8B). Da bi se dodatno potvrdili gornji rezultati, također su otkrivene razine proteina RAB5 i RAB7 u Foxo ili Akt nokdown škampima. U usporedbi sa skupinom koja je primila injekciju dsGfp, razine RAB5 i RAB7 također su se značajno smanjile u hemocitima i crijevima kod Foxo-knockdown račića, ali su značajno porasle u Akt-knockdown račića 2 sata nakon stimulacije V. anguillarumom (Slike 8C–8D'; S6B i S6B'). Ovi rezultati sugeriraju da RAB5 i RAB7 sudjeluju u FOXO-posredovanoj fagnoj citozi hemocita u račićima. Nadalje smo otkrili da su RAB5 i RAB7 lokalizirani zajedno s V. anguillarum u hemocitima račića (Slika 9). Uzeti zajedno, rezultati sugeriraju da su RAB5 i RAB7 uključeni u fagocitozu škampa posredovanu FOXO.
Slika 5. Infekcija patogenom smanjila je aktivnost AKT, što je pospješilo nuklearnu translokaciju FOXO u hemocitima i crijevnim stanicama račića. (A, B) Učinkovitost Akt-RNAi u hemocitima i crijevima račića, kako je određeno pomoću qPCR-a korištenjem geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena (A) i Western blottinga (B). (C) Količina FOXO u citoplazmi i jezgri crijeva iz Akt-knockdown škampi analizirana je Western blotingom. dsGfp je korišten kao kontrola. (C') Statistička analiza panela (C). Softver ImageJ korišten je za digitalizaciju vrpci skeniranjem slika s tri ponavljanja. (D) Nuklearna translokacija FOXO u hemocitima Akt-nockdown račića otkrivena je 2 h nakon izlaganja V. anguillarum fluorescentnim imunocitokemijskim testom. dsGfp je korišten kao kontrola. Mjerna traka=20 μm. (D') Statistička analiza (D). Softver WCIF ImageJ korišten je za analizu ko-lokalizacije omjerom intenziteta fluorescencije anti-FOXO (zeleno) i DAPI-obojene jezgre (plavo) u hemocitima nakon fiksiranja vrijednosti izloženosti. (E, F) Promjena sadržaja fosforiliranog AKT (p-AKT) u hemocitima (E) i crijevima (F) račića zaraženih V. anguillarumom. Donje ploče su digitalizirane brojke (E) i (F) temeljene na trakama Western blottinga i statističke analize.
Cistanche čaj
Rasprava
FOXO, kao vrlo važan čimbenik transkripcije, sudjeluje u mnogim fiziološkim i metaboličkim funkcijama [44,45]. U ovoj studiji identificirali smo FOXO iz račića (M. japonicus) i otkrili da sudjeluje u regulaciji homeostaze hemolimfe i crijevne mikrobiote reguliranjem ekspresije AMP-a u normalnim uvjetima. FOXO se može aktivirati bakterijskom infekcijom u račićima i premjestiti u jezgru, gdje izravno i neizravno (putem IMD) regulira ekspresiju AMP-a. FOXO je unaprijed regulirao ekspresiju gena povezanih s fagocitozom, kao što su SRC i male GTPaze, RAB5 i RAB7, kako bi pospješio fagocitozu hemocita protiv patogena. Stoga FOXO račića igra različite uloge u sustavnom i lokalnom (enteričnom) imunološkom odgovoru protiv patogena (Slika 10). U usporedbi s ljudskim FOXO, FOXO račića ima relativno očuvanu sekvencu aminokiselina i AKT fosforilacijska mjesta; međutim, drugo mjesto fosforilacije AKT FOXO račića je treonin umjesto serina. AKT fosforilacija FOXO kontrolira nuklearni i citoplazmatski transport FOXO [9]. U ovoj studiji otkrili smo da je AKT povezan s kontrolom ulaska FOXO-a u jezgru. Nakon infekcije V. anguillarumom, razina fosforiliranog AKT-a bila je značajno smanjena, što ukazuje da je aktivnost AKT-a smanjena u račića zaraženih patogenom, čime se povećava nuklearna retencija ili nuklearna translokacija FOXO-a, a zatim inducira ekspresija ciljnih gena, kao što su Relish i Amp, za otpornost na infekciju patogenima. Prethodne studije su otkrile da FOXO sudjeluje u homeostazi crijevne mikroflore Drosophile potiskivanjem ekspresije proteina SC2 za prepoznavanje peptidoglikana (negativni regulator puta IMD) kako bi se aktivirao put za ekspresiju AMP [14]. RELISH je zabilježen kao ključni ciljni gen FOXO u kontroli tolerancije na hipoksiju u Drosophile [46]. Kao i kod drugih životinja, gastrointestinalni trakt račića sadrži relativno visoku i konstantnu mikrobiotu. Sve više dokaza također otkriva da hemolimfa nekih zdravih vodenih beskralješnjaka, uključujući račiće, također sadrži stabilne količine bakterija [47]. Naša prethodna studija otkrila je da lektin C-tipa sudjeluje u regulaciji homeostaze mikrobiote hemolimfe održavajući ekspresiju AMP [34], ali ne znamo koji su signalni putovi uključeni u regulaciju ekspresije AMP. Ovdje su naši rezultati sugerirali da je FOXO uključen u regulaciju hemolimfe i homeostaze crijevne mikroflore putem IMD signalizacije u normalnim uvjetima. Kod nezaraženih račića, nokdaun Foxo-a rezultirao je značajno smanjenom ekspresijom Relisha, a stopa preživljavanja račića značajno se smanjila, čak i bez bakterijske infekcije. Također smo pronašli malu količinu FOXO u jezgri normalnih stanica račića. Stoga mislimo da FOXO sudjeluje u regulaciji homeostaze hemolimfe i crijevne flore u normalnim uvjetima promicanjem ekspresije Relish i nakon toga pojačavanjem ekspresije AMP putem IMD puta. Ovi rezultati sugeriraju da FOXO sudjeluje u lokalnom i sustavnom imunitetu za promicanje homeostaze mikrobiote hemolimfe i gastrointestinalnog trakta u račića. Humoralni imunitet igra ključnu ulogu u otpornosti na infekciju patogenom obrnutim stopama putem proizvodnje baterije AMP-a [21,48]. Humoralni odgovor uključuje inducibilnu sintezu i sekreciju AMP-a, koji se otpuštaju u hemolimfu kao sustavni odgovor ili se oslobađaju na epidermalnu površinu ili šupljinu gastrointestinalnog trakta kao lokalni odgovor [19]. Ekspresiju AMP uglavnom reguliraju signalni putovi Toll/Dif i IMD/Relish kod vinskih mušica [49]. Trenutno je nekoliko obitelji AMP-ova identificirano u račićima, uključujući crustins, anti-lipopolisaharidne faktore (Alfs) i penaeidine [50]. Ova studija je pokazala da FOXO može izravno ili neizravno (putem IMD/Relish signalizacije) regulirati ekspresiju AMP-ova, uključujući CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 i Alf-E1. Mislili smo da bi niska aktivacija FOXO-a u hemocitima i crijevima račića u normalnim uvjetima mogla regulirati ključni ciljni gen Foxo-a, tj. Relish, za održavanje homeostaze in vivo mikrobiote. Tijekom infekcije, invazivni patogeni aktiviraju FOXO, od čega se većina translocira u jezgru, gdje regulira više ciljnih gena, uključujući neke AMP-ove, kao što su Alf-E1 i CrusI-3, uz Relish. Uzeti zajedno, FOXO sudjeluje u regulaciji hemolimfe i homeostaze crijevne mikrobiote u zdravih račića putem aktivacije IMD signalizacije na bazalnoj razini u hemolimfi i gastrointestinalnom traktu. Infekcija patogenom aktivira FOXO smanjenjem aktivnosti AKT i potiče ekspresiju AMP-a izravno i neizravno u sustavnom imunitetu i lokalnom (crijevnom) imunitetu. Fagocitoza je fenomen posredovan receptorima, ovisan o aktinu i ATP-u, koji se pokreće vezanjem čestica ili patogena na specifične citomembranske receptore i predstavlja važan imunološki proces putem kojeg se domaćin može zaštititi od patogena [24]. Male GTPaze, kao što su RAB5 i RAB7, uključene su u kontinuirano remodeliranje membrane i promet vezikula u fagocitozi. Naša prethodna studija objavila je da su receptori čistači SRB i SRC uključeni u fagocitozu hemocita kao receptori u račićima [38,39]. U ovoj studiji otkrili smo da se nakon nokdauna Foxo-a ekspresija Src-a znatno smanjila, a stopa fagocitoze hemocita značajno smanjila, što sugerira da je Src ciljni gen FOXO-a i da je FOXO uključen u fagocitozu patogenih bakterija posredovanu SRC-om. FOXO bi također mogao promovirati ekspresiju dviju malih GTPaza, RAB5 i RAB7. Ove male GTPaze uključene su u sekvencijalni transport i ključne su determinante ranih i kasnih fagosoma [51]. Fagosomi migriraju s periferije stanice u unutarstaničnu regiju, pri čemu se RAB5 zamjenjuje RAB7 tijekom transporta, a konačna roba se transportira u lizosom na razgradnju [52,53]. Također smo otkrili da se RAB5 i RAB7 mogu ko-lokalizirati s patogenima u hemocitima, što ukazuje na to da su patogene fagocitirali hemociti u račićima prolazeći kroz rane i kasne fagosome prije nego što su se konačno razgradili u lizosomima. Stoga je FOXO uključen u stanični imunološki odgovor promicanjem fagocitoze hemocita. Zaključno, naši rezultati pokazuju da FOXO ne samo da sudjeluje u regulaciji homeostaze mikrobiote u normalnim uvjetima, već i u uklanjanju patogenih bakterija u zaraženim račićima promicanjem ekspresije AMP-a i fagocitoze hemocita.
Slika 6. FOXO obavlja svoju antibakterijsku ulogu u račićima regulirajući ekspresiju AMP-a. (A, B) Ekspresija Amps u hemocitima (A) i crijevima (B) Foxo-knockdown škampi, kako je određeno qPCR-om pomoću geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena; Kao kontrola korištena je injekcija dsGfp u račiće. Podaci su statistički obrađeni pomoću Mann-Whiteny U testa. (C, D) Ekspresija Amps u hemocitima (C) i crijevima (D) Akt nokdaun račića analizirana je qPCR-om pomoću geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena; Kao kontrola korištena je injekcija dsGfp u račiće. Značajne razlike analizirane su pomoću jednosmjerne ANOVA. (E) Shematski dijagram predviđenih veznih mjesta FOXO na Alf-E1 promotoru. (F) ChIP i RT-PCR korišteni su za otkrivanje vezanja FOXO na sekvencu promotora Alf-E1 pomoću početnica (Alf-E1-F i Alf-E1-R, Tablica 1). RT-PCR je također korišten za pojačanje kodirajuće regije Alf-E1 s RT-PCR početnicama (Alf-E1-RT-F i Alf-E1-RT-R. Tablica 1) pomoću ChIP dobivena DNK kao predložak. IgG protutijelo korišteno je kao kontrola, a normalni genomski DNA amplificirani fragment korišten je za potvrdu ciljne trake.
Slika 7. FOXO pojačava fagocitozu hemocita patogena u račićima promicanjem ekspresije SRC-a. (A) Hemocitna fagocitoza V. anguillarum promatrana pomoću fluorescentnog imunocitokemijskog testa pod fluorescentnim mikroskopom. V. anguillarum je obilježena s FITC (zeleno), a stanične jezgre obojene su s DAPI (plavo). Crvena strelica označava fagocitne hemocite. Mjerna traka=20 μm. (A') Statistička analiza stope fagocita i fagocitnog indeksa u Foxo-knockdown škampi. Skupina s injekcijom dsGfp korištena je kao kontrola. Pet stotina hemocita izbrojano je pod fluorescentnim mikroskopom u svakom eksperimentu. Podaci su statistički obrađeni pomoću Studentovog t-testa. (B) Bakterijska fagocitoza hemocita analizirana protočnom citometrijom. Fagocitirani hemociti koji sadrže bakterije (R2) odvojeni su od nefagocitiranih hemocita (R3) na temelju fluorescentnog signala obilježenih bakterija u hemocitima pomoću softvera IDEAS Application v6.0. (B') Stopa fagocita hemocita na temelju podataka protočne citometrije. Tri tisuće hemocita izbrojano je za svaku analizu i izvršena su tri ponavljanja. Skupina dsGfp korištena je kao kontrola. (C) Hemocitna fagocitoza V. anguillarum u Akt knockdown škampi promatrajte pod fluorescentnim mikroskopom. Mjerna traka=10 μm. (C') Statistička analiza stope fagocita i fagocitnog indeksa na temelju podataka u panelu (C). (D) Razina ekspresije mRNA za Srb i Src u hemocitima Foxo nokdaun račića analizirana qPCR-om pomoću geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. Injekcija dsGfp korištena je kao kontrola. (E) Ekspresija mRNA Srb i Src u crijevima Foxo-RNAi račića analizirana qPCR-om pomoću geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (F) Ekspresija mRNA Src u hemocitima Akt-RNAi račića analizirana qPCR-om pomoću geometrijske sredine ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (G) Razina proteina SRC u hemocitima Foxo-RNAi ili Akt-RNAi račića, kako je analizirano korištenjem Western blottinga. dsGfp injekcija korištena kao kontrola. (G') Statistička analiza temeljena na podacima tri ponavljanja panela (G).
Materijali i metode
Etička izjava
Svi pokusi na životinjama provedeni su u skladu s nacionalnim direktivama Kine (GB 14922.2–2011 i GB 14925–2010). Eksperimenti na zečevima za pripremu protutijela u studiji provedeni su u skladu s protokolima koje je odobrio Odbor za brigu i dobrobit životinja na Sveučilištu Shandong School of Life Sciences (SYDWLL-2021-54). Odobrenje prema pravilniku o korištenju škampa u našem istraživanju nije bilo potrebno jer je u našem istraživanju korišten ograničeni broj običnih škampa koji se često konzumiraju u široj zajednici.
Životinje
Zdravi škampi (Marsupenaeus japonicus), težine oko 6-10 g svaki, nabavljeni su s tržišta vodenih proizvoda u Qingdaou, provinciji Shandong, Kina. Prije eksperimenta, škampi su uzgajani najmanje 1 dan u sustavu uzgoja škampi s prozračenom morskom vodom na 23–25˚C radi privikavanja na novi okoliš.
Slika 8. RAB5 i RAB7 uključeni su u fagocitozu hemocita u račića posredovanu FOXO. (A, B) qPCR je korišten za analizu razina ekspresije mRNA Rab5 i Rab7 u hemocitima Foxo-knockdown škampi (A) i Akt-knockdown škampi (B) sa i bez bakterijske infekcije. qPCR je koristio geometrijsku sredinu ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (C) Razine proteina RAB5 i RAB7 u hemocitima Foxo-knockdown račića 2 h nakon izlaganja V. anguillarumu određene korištenjem Western blottinga. (C') Statistička analiza temeljena na podacima tri ponavljanja panela (C). (D) Razine proteina RAB5 i RAB7 u hemocitima Akt-knockdown račića 2 h nakon izlaganja V. anguillarumu određene korištenjem Western blottinga. (D') Statistička analiza temeljena na podacima tri ponavljanja panela (D).
Bioinformatička analiza
Sekvenca cDNA Foxo pune duljine dobivena je sekvenciranjem hemocita i intestinalnog transkripata M. japonicus (BGI, Shenzhen, Kina). Otvoreni okvir za čitanje (ORF) Foxoa pojačan je upotrebom para početnica (Foxo-EX-F i Foxo-EX-R; Tablica 1) za potvrdu sekvence. Odgovarajuća cDNA je konceptualno prevedena kako bi se dobila izvedena sekvenca proteina pomoću alata ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/). Analiza sličnosti provedena je pomoću BLAST-a (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), a predviđanje arhitekture domene provedeno je pomoću SMART-a (http://smart.emblheidelberg.de). Filogenetsko stablo FOXO različitih vrsta konstruirano je pomoću programa MEGA 6.0 [54].
Slika 9. RAB5 i RAB7 su lokalizirani s V. anguillarum. Ko-lokalizacija RAB5 i RAB7 s FITC oznakom-V. anguillarum u hemocitima račića, kako je analizirano pomoću fluorescentnog imunocitokemijskog testa. Bakterije su označene s FITC (zeleno) i ubrizgane u račiće. Hemociti su sakupljeni iz pet račića 30 minuta i 1 sat nakon bakterijske injekcije i inkubirani s anti-RAB5 ili anti-RAB7 antitijelima. Sekundarno antitijelo bilo je antizečji IgG Alexa-546 (crveno). Jezgre su obojene s DAPI (plavo). Ko-lokalizacija u hemocitima označena je bijelim strelicama. Mjerna traka=10 μm.
Slika 10. Shematski prikaz uključenosti FOXO u lokalni i sustavni urođeni imunitet u račića. (A) U neinficiranim uvjetima, FOXO održava homeostazu hemolimfe i crijevne mikrobiote promičući Relish, a zatim ekspresiju AMP-a. (B) U inficiranim stanjima, fosforilacija AKT smanjena je infekcijom patogena, što rezultira povećanjem sadržaja FOXO u jezgri. FOXO izravno potiče ekspresiju Relisha i AMP-a za eliminaciju invazivnih patogena; s druge strane, FOXO potiče fagocitozu patogena putem SRC-posredovanog puta fagocitoze.
Bakterijski izazov i prikupljanje uzoraka
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) dobiven s Pomorskog fakulteta Sveučilišta Shandong (Wei hai, Kina) i sada se čuva u našem laboratoriju. V. anguillarum je uzgajan preko noći na 37˚C u LB mediju i ponovno kultiviran 4 sata pri inokulaciji 1:100 drugog dana. Bakterije u logaritamskoj fazi rasta sakupljene su centrifugiranjem na 5000 x g tijekom 5 minuta na 4˚C i isprane dva puta fiziološkom otopinom s fosfatnim puferom (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl i 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). V. anguillarum resuspendiran u fosfatno puferiranoj slanoj otopini za izazivanje račića. Približno 2 × 107 jedinica koje stvaraju kolonije (CFU)/ račiću ubrizgano je u abdomen svakog račića pomoću mikrošprica. Kontrolnoj skupini ubrizgan je isti volumen PBS-a. Hemociti, srce, hepatopankreas, škrge, želudac i crijeva prikupljeni su iz najmanje tri račića za ekstrakciju RNA i proteina. Za prikupljanje hemocita, hemolimfa je ekstrahirana iz ventralnog sinusa pomoću šprice napunjene s 0,8 ml antikoagulantnog pufera (10% natrijevog citrata), a zatim brzo centrifugirana na 700 × g tijekom 8 minuta na 4˚C za izolaciju hemocita.
Ekstrakcija RNA i proteina, te sinteza cDNA
Ukupna RNA ekstrahirana je iz hemocita i različitih organa račića pomoću TRIzola (ET101, Transgen, Peking, Kina). Proteini iz različitih organa ekstrahirani su pomoću testa radioimunoprecipitacije (RIPA) pufera za lizu (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Kina). Sinteza prvog lanca cDNA izvedena je korištenjem cDNA Synthesis Kita (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), prema uputama proizvođača.
Tablica 1. Sekvence početnica korištenih u ovoj studiji.
MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), prema uputama proizvođača.
Rekombinantna ekspresija i priprema antitijela
cDNA sekvenca Foxoa umnožena je lančanom reakcijom polimeraze reverzne transkripcije (RT-PCR) upotrebom početnica Foxo-EX-F i Foxo-EX-R (Tablica 1). Pročišćeni PCR produkti zatim su digestirani pomoću restrikcijskih enzima i vezani u plazmid pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, SAD). a konstruirani plazmidi transformirani su u stanice Escher ichia coli Rosseta (DE3). Ekspresija proteina inducirana je pomoću 1 mM izopropil- - D-tio galaktopiranozida na 37˚C. Rekombinantni proteini su podvrgnuti afinitetnoj kromatografiji upotrebom glutationske (GST) smole (C600031, BBI, Šangaj, Kina), prema uputama proizvođača. Zečji antiserumi protiv FOXO pripremljeni su prema prethodno opisanoj metodi [55].
Zapadnjački mrlja
Proteini ekstrahirani iz različitih organa ili hemocita razdvojeni su elektroforezom u poliakrilamidnom gelu s 10% natrijevim dodecil sulfatom (SDS-PAGE). Proteini u SDS-PAGE gelovima prebačeni su na membranu celuloznog nitrata pomoću pufera za prijenos (25 mM Tris–HCl, 20 mM glicina, 0.037% mM SDS i 20% etanola) i inkubira u 5% obranom mlijeku ili 3% goveđem serumskom albuminu (BSA) u tris-puferiranoj slanoj otopini (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM tris HCl, pH 8,0) 1 h uz lagano mućkanje na sobnoj temperaturi. Membrane su zatim inkubirane s primarnim antiserumom: Anti-FOXO u razrjeđenju 1:100, anti-RAB5 u 1:25, anti Rab7 u 1:25, anti-beta aktin (ACTB) u 1:250 (pripremljeno u našem laboratoriju ); Histon-3 poliklonska protutijela (A2348, ABclonal, Wuhan, Kina, 1:2500); anti-fosforilirana (p)-AKT poliklonska protutijela (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Kina, 1:500) i lagano mućkana preko noći na 4˚C. Nakon tri puta ispiranja s TBST (0,1% Tween-20 dodanog TBS-u), membrane su inkubirane sa sekundarnim protutijelom (ZB2308 ZSGB-Bio, Peking, Kina, 1:5,000) ili ( ZB2301 ZSGB-Bio, Peking, Kina, 1:5, 000) 3 h na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje. Imunoreaktivne proteinske trake razvijene su pomoću otopine nitrotetrazolij plavog klorida (A610379, BBI) i soli P-toluidina (A610072, BBI) u mračnim uvjetima ili pomoću poboljšane kemiluminiscencije (ECL). -aktin ili histon-3 korišteni su kao referencas.
Distribucija tkiva i obrasci ekspresije u račića izazvanih bakterijama
Tkivna distribucija Foxo/FOXO u hemocitima, srcu, škrgama, sputumu, želucu i crijevima analizirana je pomoću RT-PCR s početnicama Foxo-F i Foxo-R (Tablica 1) i Western blottingom s anti-FOXO protutijelima, odnosno. PCR postupak sastojao se od početne inkubacije na 94°C tijekom 3 minute; nakon čega slijedi 35 ciklusa od 94˚C tijekom 30 s, 50˚C tijekom 30 s i 72˚C tijekom 30 s; nakon čega slijedi 72˚C tijekom 10 minuta. PCR produkti su analizirani elektroforezom u agaroznom gelu (1,5% agaroza). Gen -aktin (-aktin-F i -aktin-R; Tablica 1) korišten je kao interna kontrola. Obrasci ekspresije Foxo/FOXO u vremenskom tijeku na razini RNK i proteina u račića zaraženih V. anguillarumom analizirani su pomoću kvantitativne PCR u stvarnom vremenu (qPCR) u termalnom cikleru (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Njemačka) i pomoću west ern blotting, odnosno. qPCR postupak se sastojao od: 95˚C tijekom 10 minuta; 40 ciklusa na 95˚C tijekom 10 s i 60˚C tijekom 50 s; a zatim period taljenja od 65˚C do 95˚C. Profili ekspresije Foxo-a proizvedeni su pomoću 2-ΔΔCT metode [56] uz korištenje geometrijske sredine dva interna kontrolna gena -aktina i Ef-1 za normalizaciju. Učinkovitost para početnica u qPCR-u analizirana je prema MIQE metodi [57] s 10-strukim logaritamskim razrjeđenjem mješavine cDNA kako bi se dobila linearna standardna krivulja.
Izolacija nuklearnih i citoplazmatskih proteina
Tkivo crijeva je secirano iz račića i isprano u PBS tri puta. Ekstrakcija proteina provedena je pomoću kompleta za nuklearnu i citoplazmatsku ekstrakciju proteina (R0050, Solarbio, Peking, Kina) prema uputama proizvođača. Najmanje tri račića korištena su za ekstrakciju proteina kako bi se uklonile individualne razlike.
Ispitivanje RNA interferencije
Kako bismo analizirali funkciju gena, proveli smo testove RNA interferencije (RNAi). Nekoliko parova početnica koje sadrže sekvencu promotora T7 (Foxo-RI-F i Foxo-RI-R; Rab5-RI-F i Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F i Rab7 -RI-R; Akt-RI-F i Akt-RI-R. Tablica 1) dizajnirani su za pojačavanje šablona za sintezu dsRNA. Koristeći T7 RNA polimerazu (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i cDNA šablonu, sintetizirali smo fragmente dsRNA. Dvolančani zeleni fluorescentni protein dsGfp RNA služio je kao kontrola, koja je umnožena korištenjem Gfp-RI-F i Gfp -RI-R (Tablica 1) kao početnica za sintezu dsGfp. Zatim su fragmenti dsRNA (50 ug/svaki) ubrizgani u trbušni segment M. japonicus pomoću mikroštrcaljke, a druga injekcija je izvršena 12 sati kasnije koristeći istu dozu. Učinkovitost RNA interferencije analizirana je kvantitativnom PCR reverznom transkripcijom u stvarnom vremenu (qRT-PCR, koja uključuje reverznu transkripciju RNA da se formira cDNA, koja je zatim korištena kao predložak u qPCR testu) ili Western blottingom 24 sata nakon druge injekcije. -aktin je korišten kao interna referenca.
Reference
1. Calnan DR, Brunet A. Kod FoxO. Onkogen. 2008.; 27(16):2276-2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Put popravka DNK stimuliran transkripcijskim faktorom forkhead FOXO3a preko proteina Gadd45. Znanost. 2002; 296 (5567):530-534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Živio FOXO: razotkrivanje uloge FOXO proteina u starenju i dugovječnosti. Stanica starenja. 2016.; 15 (2): 196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Troslojna kontrola-fosforilacija, acetilacija i ubikvitinacija FOXO proteina. Stanični ciklus. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Regulacija FoxO faktora transkripcije acetilacijom i interakcijama protein-protein. Bba-Mol Cell Res. 2011.; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. Transkripcijski faktori FOXO: njihov klinički značaj i regulacija. Biomed Res Int. 2014.; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Geni koji djeluju nizvodno od DAF-16 kako bi utjecali na životni vijek Caenorhabditis elegans. Priroda. 2003.; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Putovi inzulina/IGF-1R, SIRT1 i FOXOs - intrigantna platforma interakcije za kost i osteosarkom. Front Endocrinol (Lausanne). 2019.; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt potiče preživljavanje stanica fosforilacijom i inhibicijom transkripcijskog faktora na glavi. Ćelija. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 inhibira FOX01 u supresiji tumora razgradnjom posredovanom ubikvitinom. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. Faktor transkripcije glave vilice DAF-16 transducira inzulinu slične metaboličke signale i signale dugovječnosti u C. elegans. Priroda. 1997.; 389 (6654):994-999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Intestinalna FoxO signalizacija potrebna je za preživljavanje oralne infekcije kod Drosophile. Mucosal Immunol. 2016.; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO regulira RNA interferenciju u Drosophili i štiti od infekcije RNA virusom. P Natl Acad Sci USA. 2015.; 112(47):14587-14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 promiče imunološku homeostazu crijeva kako bi se ograničila komenska disbioza i produžio životni vijek. Ćelija. 2014.; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. FOXO-ovisna regulacija urođene imunološke homeostaze. Priroda. 2010.; 463(7279):369-373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. Transkripcijski faktori FOXO reguliraju urođene imunološke mehanizme u respiratornim epitelnim stanicama. J Immunol. 2013.; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Graves DT, Milovanova TN. Imunitet sluznice i faktori transkripcije FOXO1. Front Immunol. 2019.; 10: 2530-2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Antimikrobni peptidi: od beskralježnjaka do kralježnjaka. Immunol Rev. 2004; 198: 169-184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Imunitet u Drosophila melanogaster-od mikrobnog prepoznavanja do fiziologije cijelog organizma. Nat Rev Immunol. 2014.; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Urođeni imunitet drozofile: evolucijska perspektiva. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Imunitet Drosophile: putovi i uzorci. Curr Opin Immunol. 2003.; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Nedavni napredak u istraživanju urođenog imuniteta račića u Kini. Dev Comp Immunol. 2013.; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Vezanje coiled-coil domene C-tipa lektina na Domeless receptor izravno aktivira JAK/STAT put u imunološkom odgovoru račića na bakterijsku infekciju. PLoS Patog. 2017.; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Fagocitoza: imunobiološki proces. Imunitet. 2016.; 44 (3): 463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. FoxO1-posredovana autofagija potrebna je za razvoj NK stanica i urođenu imunost. Nat Commun. 2016.; 7:11023-11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 regulira aktivnost neutrofila izazvanu bakterijama. Front Immunol. 2017.; 8: 1088-1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. Lektin C-tipa veže se za beta-Integrin kako bi pospješio hemocitnu fagocitozu u beskralješnjaka. J Biol Chem. 2014.; 289(4):2405-2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Podučavanje samoobrane račića u borbi protiv infekcija. Trendovi Biotehnologija. 2019.; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Povijesna pojava, utjecaj i trenutni status patogena račića u Aziji. J Invertebr Pathol. 2012.; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Antivirusna obrana u škampima: od urođenog imuniteta do virusne infekcije. Antivir Res. 2014.; 108: 129-141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilova V. Odnosi strukture/funkcije koji leže u osnovi regulacije FOXO transkripcijskih faktora. Onkogen. 2008.; 27(16):2263-2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.
