Fine čestice 2.5 poboljšavaju melanogenezu u A375 ljudskim stanicama melanoma
Jul 19, 2023
Uredniku: Epidemiološke studije pokazale su da izloženost finim česticama 2,5 (PM2,5) povećava rizik od hiperpigmentacije kože.[1] Nedavna studija dokazala je da PM2.5 može inducirati melanogenezu reguliranjem tirozinaze (TYR) i ekspresije proteina 1 (TYRP1) i 2 (TYRP2) povezanih s tirozinazom preko arilnog ugljikovodika receptora (AhR)/mitogen-aktivirane protein kinaze koja signalizira aktivaciju.[ 2] AhR je široko rasprostranjen u stanicama kože i njegovo vezivanje kontrolira oksidaciju/antioksidaciju, funkciju epidermalne barijere, foto-inducirani odgovor, urođeni imunitet i melanogenezu. Može se aktivirati dioksinom i policikličkim aromatskim ugljikovodicima (sastojci PM2.5), a njegova aktivacija inducira transkripciju gena koji kodiraju enzime metabolizma ksenobiotika faze I i faze II (citokromi P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 i CYP1B1). [3,4] BaP i opasni dioksini aktiviraju AhR s snažnim stvaranjem reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), što je barem djelomično posredovano CYP1A1. Štoviše, oksidativni stres posredovan CYP1A1- odgovoran je za proizvodnju proupalnih citokina, kao što su interleukin (IL)-1, IL-6 i IL-8 u okolišu ljudski keratinociti tretirani kontaminantima.[3,5] Međutim, postoji vrlo malo studija o toksičnim učincima PM2.5 na melanogenetske stanice. Ovdje smo tretirali ljudske stanice melanoma A375 različitim koncentracijama PM2.5 kako bismo istražili može li PM2.5 pospješiti melanogenezu i njegov odnos s AhR signalizacijom, oksidativnim stresom i upalnim odgovorom.
Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i tkivu pluća eksperimentalno starih miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i ima sposobnost hvatanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.
Kliknite na dodatak Cistanche Tubulosa
【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
PM2,5 prikupljen je tijekom zime (od prosinca do siječnja) u Pekingu. HY-1000 inteligentni uzorkivač ukupnih suspendiranih čestica (TSP) velikog protoka (opcijski rezač PM2,5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Kina) korišten je za uzorkovanje kvarcnog filtra. Kvarcna membrana je uronjena u 75 postotni etanol nakon čega je uslijedilo ultrazvučno protresanje. Za pripremu osnovne otopine visoke koncentracije korištena je sterilna voda. Ljudske stanice melanoma A375 uzgajane su u 5 posto CO2 na 37 stupnjeva u redovnom Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, SAD) koji sadrži fetalni goveđi serum (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD). Stanice A375 tretirane su različitim koncentracijama PM2.5 (0, 100, 200 i 400 ug/mL) tijekom 24 sata, a stanice su korištene za sljedeće studije. Nespareni Studentov t-test i jednosmjerna analiza varijance korišteni su za statističku analizu, a P < 0,05 smatralo se statistički značajnim.
Kako bi se istražio utjecaj PM2.5 na stanice A375, stanična proliferacija detektirana je pomoću CCK-8 kompleta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), a stanična apoptoza je detektirana pomoću Annexin V fluorescein izotiocijanata/ propidium jodide (FITC/PI) komplet za apoptozu (Multisciences, SAD), na temelju uputa proizvođača. Rezultati su pokazali da je PM2.5 pokazao citotoksičnost ovisnu o koncentraciji za A375 stanice, ali nije utjecao na apoptozu [Dopunska slika 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
Za određivanje sadržaja melanina korištena je NaOH metoda. Stanice A375 tretirane PM25- isprane su fiziološkom otopinom s fosfatnim puferom (PBS) i lizirane vodom. Lizati su centrifugirani na 12, 000 okr/min 5 minuta, isprani s 10 posto trikloroctene kiseline (500 mL) (Sigma, St. Louis , MO, SAD) i 75 postotnog etanola (500 mL), a zatim se ponovno izbistri. Nakon toga, 50 mL 1 mol/L NaOH koji je sadržavao 10 posto dimetil sulfoksida dodano je peletama tijekom 1 sata na 80 stupnjeva. Apsorbancija na 490 nm (OD 490) izmjerena je pomoću čitača mikropločica. Budući da je TYR najvažniji melanogeni enzim, zatim smo otkrili aktivnost TYR koristeći levodopa (L-DOPA) test. Sixwell ploče (Corning, SAD) nasađene su stanicama A375 u gustoći od 3 105 stanica/jažici. Stanice su zatim isprane s PBS-om i lizirane s 0,5 postotnim natrijevim deoksiholatom (Sigma). Lizat je podijeljen u tri skupine, a svakom uzorku dodan je 0,1 posto L-DOPA (Sigma). Nakon 5 minuta izmjeren je OD 490 i 0,1 posto L-DOPA korišteno je kao standard. Također smo mjerili razine ekspresije mRNA i proteina TYR. Ukupna RNA je ekstrahirana pomoću RNeasy mini kita (Qiagen, Valencia, CA, SAD). Reverzna transkripcija provedena je pomoću pribora ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japan). Nakon toga je izvedena kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qRT-PCR) na Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japan). Početnice iz Invitrogena predstavljene su u Dodatnoj tablici 1, http://links. lww.com/CM9/A917, a razina ekspresije svake mRNA izračunata je pomoću metode 2*DDCT. Razine ekspresije proteina analizirane su Western blotom. Stanice su isprane s PBS i lizirane u RIPA puferu (Beyotime, Kina) koji sadrži fenilmetilsulfonil fluorid (mješavina inhibitora proteaze, 20:1, Sigma-Aldrich). Koncentracije proteina mjerene su korištenjem kompleta za analizu proteina BCA (Beyotime, Kina). Ukupni protein je kuhan na 70 stupnjeva 10 minuta, odvojen u 4-12 postotnom gelu na 200 V tijekom 40 minuta, prebačen na membranu na 4 stupnja pomoću 120 mA tijekom 75-100 minuta, a zatim inkubiran s 5 posto nemasnog mlijeka 1 sat. Membrane su zatim testirane s anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 i anti-CYP1B1 antitijelima (Abcam) preko noći na 4 stupnja. Anti-mišje IgG protutijelo konjugirano s peroksidazom hrena (Proteintech, SAD) korišteno je kao sekundarno protutijelo. Rezultati su pokazali da je PM2.5 povećao sadržaj melanina i aktivnost TYR na način ovisan o dozi. Razine ekspresije TYR-a i mRNA i proteina bile su regulirane prema gore [Dodatna slika 2 A–D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 može pojačati aktivnost TYR aktiviranjem puta AhR. Kako bismo utvrdili utječe li PM2.5 na signaliziranje AhR-a, otkrili smo razine transkripcije AhR-a i njegovih klasičnih nizvodnih gena CYP1A1 i CYP1B1 pomoću qRT-PCR-a i Western blottinga. Rezultati su pokazali da je PM2.5 unaprijed regulirao razine ekspresije mRNA AhR i CYP1A1, kao i ekspresiju proteina CYP1A1 [Dodatna slika 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
Aktivacija AhR uzrokuje stvaranje ROS, što također može povećati aktivnost TYR.[5] Stoga smo procijenili proizvodnju ROS-a pomoću 20,70 -diklorofluorescein diacetata (DCFHDA) i protočne citometrije. Nakon 24 sata tretmana s PM2.5, A375 stanice su inkubirane s DCFH-DA (5 mmol/L) 30 minuta na 37 stupnjeva u mraku. Stanice su isprane dva puta u PBS-u, a fluorescencija je izmjerena protočnim citometrom. Srednji intenzitet fluorescencije kvantificiran je pomoću softvera FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, New York, NY, SAD). Kako se smatra da je proizvodnja ROS izazvana CYP1A1- odgovorna za upalni odgovor, [5] razine ekspresije mRNA proupalnih citokina (IL-1a, IL-6, IL{ {19}}, i faktor nekroze tumora [TNF]-a). Utvrđeno je da je PM2.5 povećao proizvodnju ROS-a, kao i razine mRNA IL-1a, IL-6 i IL-8 u stanicama A375 [Dodatna slika 2 H i I, http ://veze. lww.com/CM9/A917].
Nalazi ove studije pokazali su da PM2.5 potiče melanogenezu i povećava aktivnost i ekspresiju TYR u stanicama A375. Štoviše, PM2.5 bi mogao aktivirati AhR signalizaciju i potaknuti oksidativni stres i upalni odgovor, što bi mogla biti melanogena signalna kaskada odgovorna za hiperpigmentaciju.
Priznanja
Izražavamo našu iskrenu zahvalnost sljedećem: prof. dr. Masutaka Furue i prof. dr. Tsuji Gaku sa Sveučilišne bolnice Kyushu koji su poboljšali rukopis i pomogli s informacijama vezanim za AhR. Također smo zahvalni za englesko uređivanje koje nam je omogućio prof. dr. Robert Schwartz s medicinske škole Rutgers New Jersey.
Financiranje
Ova je studija potpomognuta donacijom Nacionalne zaklade za prirodne znanosti Kine (br. 2101000271).
Sukob interesa
Nijedan.
Reference
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Izloženost finim česticama povezana sa senilnim lentigom u kineskih žena: studija presjeka. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. Čestice potiču hiperpigmentaciju putem aktivacije signala AhR/MAPK i povećanjem parakrinih razina a-MSH u keratinocitima. Onečišćenje okoliša 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Potencijalna uloga PM2.5 u melanogenezi. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Arilni ugljikovodični receptor (AhR) moguća meta za liječenje kožnih bolesti. Med Hypotheses 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakočak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Utjecaj čestica iz zraka na kožu: sustavni pregled od epidemiologije do in vitro studija. Dio Fiber Toxicol 2020; 17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
