Favonoidni i fitooksilipinski odgovori u lišću nara (Punica Granatum L.) 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Metil jasmonat (MeJA) proizveden u biljkama može posredovati u njihovom odgovoru na okolišne stresove. Također se pokazalo da egzogena primjena MeJA aktivira signalne putove i inducira nakupljanje fitoaleksina u mnogim biljnim vrstama. Da bi se razumjelo kako biljke nara biokemijski reagiraju na okolišne stresove, analiza metabolita provedena je u lišću nara podvrgnutom primjeni MeJA i otkrila je jedinstvene promjene u hidrolizabilnim taninima, flavonoidima i fitooksilipinima. Osim toga, analize transkriptoma i qPCR u stvarnom vremenu lišća nara tretiranog lažnim i MeJA-om identificirale su različito izražene metaboličke gene i faktore transkripcije koji su potencijalno uključeni u kontroluhidrolizabilanputevi tanina, flavonoida i fitooksilipina. Molekularna, biokemijska i bioinformatička karakterizacija jedinoglipoksigenazas kontinuiranom, MeJA-induciranom ekspresijom pokazalo je da je sposoban oksidirati višestruko nezasićene masne kiseline, iako se ne nalazi u podstaničnom odjeljku gdje su proizvedeni ne-jasmonatni (ne-JA) fitooksilipini. Ovi rezultati zajedno upućuju na to da, iako je široka supresija flavonoida i antocijanina barem djelomično kontrolirana na razini transkripcije, inducirana biosinteza ne-JAFito-oksilipinivjerojatno nije regulirano transkripcijom. Općenito, bolje razumijevanje načina na koji lišće nara reagira na okolišne stresove ne samo da će promicati zdravlje i produktivnost biljaka, već će također utjecati na ljudsko zdravlje budući da su plodovi dobiveni iz biljaka nara bogat izvor nutritivnih spojeva.

Ključne riječi:Metil jasmonat.flavonoid·Antocianin· Masna kiselina.Fito-oksilipin· Lipoksigenaza

Kliknite ovdje da saznate više

Uvod

Kada su ranjene ili napadnute biljojedima i patogenima, biljke proizvode i emitiraju metil jasmonat (MeJA), koji percipiraju neozlijeđena biljna tkiva i susjedne biljke kako bi aktivirale obrambenu reakciju (Cheong i Choi 2003). Dodatno, pokazalo se da egzogena primjena MeJA na biljku izaziva signalne putove, kao i proizvodnju proteina povezanih s patogenezom i obrambenih kemikalija poznatih kao fitoaleksini. Fenolni fitoaleksini, npr. flavonoidi i antocijanini, pokazali su povećanu akumulaciju kao odgovor na tretman MeJA u različitim biljkama, kao što su Arabidopsis thaliana, grožđe (Vitis vinifera), banana (Musa acuminate), jabuka (Malus Domestica) i crvena malina (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res i Ruiz del Castillo 2014). Biosinteza flavonoida i antocijanina počinje stvaranjem naringenin kalkona iz kumaroil CoA i tri molekule malonil CoA katalizirane kalkon sintazom (CHS) i naknadnom izomerizacijom naringenin kalkona u naringenin pomoću kalkon izomeraze (CHI). Naringenin se zatim koristi za generiranje kostura jezgre flavonoida i antocijanina, koji se dalje modificiraju s glikozilnim, metilnim, hidroksilnim i prenilnim funkcionalnim skupinama kako bi doveli do različitih struktura i funkcija (Tian et al. 2008).

Cistanche može poboljšati imunitet

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 posto sličnosti) i ne sadrže signalni peptid, dok LOX tipa II imaju ukupnu nisku sličnost sekvenci (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Nar (Punica granatum L.) je posebna hortikulturna kultura cijenjena zbog obilja fenolnih spojeva u svom plodu, kao što su flavonoidi, antocijanini i hidrolizabilni tanini (HT) koji su izvedeni iz međuproizvoda shikimatnog puta (Ono et al. 2016.). ). Mnoge su se studije do sada usredotočile na ulogu fenola nara u ublažavanju stresa i bolesti kod ljudi (Wu i Tian 2017). Nasuprot tome, malo se zna o funkciji fenola i drugih fitokemikalija u obrani nara od abiotičkih i biotičkih čimbenika (npr. ranjavanje, patogeni, indukcija MeJA) u lišću i plodovima. Dva nedavna izvješća procijenila su tretman MeJA prije berbe na kvalitetu plodova nara nakon berbe (Koushesh Saba i Zarei 2019; Garcia-Pastor et al. 2020). Ukupni antocijanini, flavonoidi i fenoli plodova tretiranih MeJA, ali ne i lišća, zajedno su analizirani pomoću spektrofotometra. Jedna od studija također je analizirala pojedinačne antocijanine pomoću masene spektrometrije (Garcia-Pastor et al.2020). Međutim, ostaje nejasno kako tkivo biljke nara, bilo lišće ili plodovi, reagiraju na okolišne stresove prije zametanja plodova.

Kako bismo započeli seciranje interakcija između biljaka nara i čimbenika okoliša, istražili smo metabolički odgovor lišća nara na egzogenu primjenu MeJA pomoću tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) i tandemske masene spektrometrije tekućinske kromatografije i elektrospreja (LC-ESI-MS/MS) . Jedinstvene promjene u HT, flavonoidima i antocijaninima, kao i promjene u lipidima, masnim kiselinama i fitooksilipinima primijećene su u listovima nara tretiranim MeJA. Usporedna analiza transkriptoma, potvrđena qPCR analizom u stvarnom vremenu, otkrila je da su strukturni i/ili regulatorni geni uključeni u metabolizam HT, flavonoida, antocijanina i fitooksilipina različito izraženi u listovima nara tretiranim lažnim i MeJA. Jedini LOX gen koji je pokazao stalnu pojačanu ekspresiju u listovima tretiranim MeJA bio je podvrgnut daljnjoj molekularnoj, biokemijskoj i filogenetskoj karakterizaciji.

Materijali i metode

Standardi -glukogalina i pentagaloil glukoze kupljeni su od Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Šangaj, Kina). Kemikalije korištene u LOX testu nabavljene su od sljedećih dobavljača: 3-(dimetilamino)benzojeva kiselina (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Šangaj, Kina), linolna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), 3-metil-2-benzotiazolinon (MBTH) i hemoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Šangaj, Kina).

Biljni materijal Plodove i sjemenke nara (cv. Wonderful) velikodušno je osigurala Akademija poljoprivrednih i šumarskih znanosti Panzhihua, a identificirao ih je dr. Binjie Ge u šangajskom botaničkom vrtu Chenshan. Uzorak vaučera (br. CSHO173966) pohranjen je u herbariju Shanghai Chenshan Botaničkog vrta, Šangaj, Kina. Sadnice nara uzgajane su u prostoriji za uzgoj s kontroliranom temperaturom 6 tjedana na 25 stupnjeva i 16 sati svjetla/8 sati mraka. Koncentracija MeJA za nanošenje sprejom na biljna tkiva navodno se kreće od 100 do 250 μM（Ku et al.2014; Hickman i sur.2017). Različite koncentracije MeJA u početku su primijenjene na listove nara, od kojih je 200 μM MeJA dovelo do vidljivog metaboličkog odgovora u preliminarnoj analizi i korišteno je za analizu metabolita i ekspresije gena opisanu u ovoj studiji. Prije tretmana MeJA, polovica biljaka nara premještena je u drugu prostoriju za uzgoj sa sličnim uvjetima. Dok su biljke u jednoj prostoriji za rast prskane s 200 μM MeJA, one u drugoj prostoriji za rast prskane su vodom (tj. lažna kontrola). U 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,i72-h nakon tretmana, odlazi od3 prikupljeno je do 5 lažno ili MeJA tretiranih biljaka, koje čine jednu biološku repliku. Tri biološka replika prikupljena su za pokuse lažnog i MeJA tretmana; svaki biološki replikat podijeljen je u alikvote za profiliranje metabolita i analizu ekspresije gena.

Analiza profila metabolita

Listovi nara su liofilizirani, izvagani i samljeveni u fini prah pomoću zrna cirkonijevog oksida u mutilici (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Njemačka) 90-ih na 30 Hz. Za HPLC analizu, uzorak lišća je ekstrahiran u 70 postotnom metanolu 60 minuta uz sonikaciju i centrifugiran na 13,000 okretaja u minuti 10 minuta. Supernatant je prebačen u bočicu za HPLC, od čega je 30 μL ubrizgano u HPLC reverzne faze (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD) i analizirano kao što je prethodno opisano (Wil-son et al. 2019). Metaboliti su detektirani UV apsorpcijom na 254 nm, 280 nm, 320 nm i 360 nm. Konstruirane su standardne kalibracijske krivulje -glukogalina i pentagaloil glukoze; korišteni su za pretvorbu područja vrhova koji odgovaraju retencijskim vremenima i apsorpcijskim spektrima -glukogalina i pentagaloil glukoze u odgovarajuće koncentracije.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 se smatraju značajno promijenjenima.

Analiza transkriptoma

Ukupna RNA ekstrahirana je iz lišća nara pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) i kvantificirana pomoću Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Integritet uzoraka RNA potvrđen je odvajanjem na agaroznom gelu (bez vidljive degradacije) i određivanjem omjera OD20/28o (između 1,8 i 2,2) pomoću Nanodrop2000. Obogaćivanje mRNA iz ukupne RNA provedeno je upotrebom oligo (dT) magnetskih kuglica (Invitrogen). mRNA-Seq biblioteke konstruirane su upotrebom kompleta za pripremu biblioteke Truseq RNA (Illumina, San Diego, CA, SAD). Analiza transkriptoma provedena je na Illumina HiSeq4000 i dobiveno je 55-60 milijuna 150-bp uparenih krajnjih čitanja (PE150) za svaku biblioteku uzoraka. Podaci neobrađene sekvence obrađeni su uklanjanjem sekvenci adaptera kao i kratkih (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, i prilagođena P vrijednost<>

qPCR analiza u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz lišća nara tretiranog lažnim i MeJA-om pomoću kompleta RNAprep Pure Plant (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Kina). Reverzna transkripcija (RT) provedena je korištenjem ukupne RNA i PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan). Kvantitativni PCR (qPCR) proveden je korištenjem TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) kompleta ( Takara) i StepOnePlus PCR sustav u stvarnom vremenu (Ther-moFisher Scientific). Provedena je analiza krivulje taljenja i pokazala je jedan produkt pojačanja za svaki par početnica. Za RT-qPCR analizu ispitana su tri biološka ponavljanja i svaki s tri tehnička ponavljanja za lažno tretirane uzorke i uzorke tretirane MeJA. Ekspresija gena analizirana je komparativnom C,(△AC) metodom (Livak i Schmittgen 2001), a razine značajnosti određene su dvostranim Studentovim t-testom. Nizovi početnica za qPCR analizu u stvarnom vremenu i učinkovitosti pojačanja parova početnica prikazani su u tablici S1.

Ekspresija i pročišćavanje rekombinantnih proteina i enzimski testovi

Otvoreni okvir čitanja Pgr025417 (koji kodira pretpostavljeni LOX) sintetiziran je za optimalnu upotrebu kodona u E. coli (Genewiz, Suzhou, Kina) i kloniran u pET28a. Rekombinantni plazmid je transformiran u E. coli BL21 (DE3) stanice. 5-mL Luria Bertani (LB) kultura s 50ug mL-Ikanamicina je započeta iz jedne kolonije i inkubirana preko noći uz mućkanje na 37C. Kultura preko noći korištena je za inokulaciju 100-mL LB medija s 50 ug mL-kanamicina i ostavljena da raste do OD600 od 0,5. Zatim je dodan izopropil- -D-tiogalaktozid (IPTG) do konačne koncentracije od 0,1 mM za indukciju ekspresije proteina. Nakon inkubacije uz mućkanje na 16 stupnjeva tijekom 18 sati, stanice su sakupljene centrifugiranjem. Stanične pelete resuspendirane su u puferu za lizu (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol) i homogenizirane upotrebom staničnih disruptora (Constant Systems Ltd, Northants, UK). His-označeni proteini pročišćeni su upotrebom Ni-NTA kuglice (ThermoFisher Scientific) s puferom za ispiranje (50 mM NaH,PO, pH 7,4,300 mM NaCl, 25 mM imidazol) i puferom za ispiranje (50 mM NaH,PO,pH 7,4,300 mM NaCl, 500 mM imidazol). Pročišćeni proteini su odvojeni na 10 postotnom SDS-PAGE gelu za vizualizaciju čistoće proteina. Koncentracija pročišćenih proteina određena je korištenjem Bradfordovog testa (Bradford 1976).

Za LOX test, linolna kiselina korištena je kao supstrat u kolorimetrijskoj metodi u dva koraka s malim modifikacijama (Anthon i Barrett 2008). 500-µL reakcijske smjese, uključujući 50 mM Na-fosfata, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM linolne kiseline i različite količine pročišćenih rekombinantnih proteina (1,5 mg mL -), inkubirana je na 25 stupnjeva 10 minuta. Druga otopina （500 µL） koja sadrži 0,2 mM MBTH i 0,1 mg mL-hemoglobina dodana je u reakcijsku smjesu, koja je inkubirana dodatnih 5 minuta. Reakcija je prekinuta dodavanjem 500 μL 1 posto （w/v） natrijevog lauril sulfata. Određena je apsorpcija svjetla na 598 nm. Subcelularna lokalizacija i filogenetske analize. Pretraživanje označenog genoma nara (Qin et al. 2017.) identificiralo je 1l pretpostavljenih LOX-ova pune dužine (786 aa do 970 aa), uključujući Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr025417, PgrO18982, PgrO2grO1880, -sekvenca duljine u GenBank XP_031395793),Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 i PgrO13780. Substanična lokalizacija i mjesta cijepanja signalnih peptida za LOX-ove nara predviđeni su pomoću TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al. 2019).

Analiza TF-veznog mjesta

Za predviđanje veznih mjesta TF-ova, 1000 bp uzvodno od ATG početnog kodona ciljnih gena dobiveno je iz GenBank i pretraženo u usporedbi s TF-ovima Eucalyptus Grandis u PlantRegMap (verzija 5) (Tian et al. 2020). Vrijednost praga za vezanje identifikacija mjesta postavljena je na P Manje od ili jednako le-4. Statistička analiza kvantifikacije metabolita, transkriptoma i qPCR podataka u stvarnom vremenu opisana je u odgovarajućim odjeljcima.

Rezultati

MeJA modulira staničnu signalizaciju i metaboličke putove u lišću nara

Da bismo razumjeli transkripcijski odgovor nara na izazivanje MeJA na cijelom genomu, transkriptomi listova nara na 2-h,6-h,24-h i 72-h nakon MeJA ili analizirani su lažni tretman (svaki s tri biološka ponavljanja) (slika S1). Približno 55 milijuna očitavanja neobrađenih sekvenci (2×150 bp upareni kraj) dobiveno je za svaki transkriptom s GC-sadržajem oko 52 posto i vrijednostima Q30 u rasponu od 91,6 do 95 posto (Tablica S2). Za sve transkriptome, više od 96 posto očitanih sekvenci mapirano je na referentni genom nara (Qin et al. 2017) (Tablica S3). Većina sastavljenih transkripata bila je manja od 1000 bp (34,3 posto), 1000 bp— 2000 bp (32,9 posto), ili 2000 bp—3000 bp (18,1 posto) (Tablica S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, prilagođeno P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Kako bi se utvrdilo mogu li promjene u količini transkripata biosintetskog gena shikimata i HT utjecati na razinu metabolita izvedenih iz ovih puteva, fenolni metaboliti ekstrahirani su iz lišća ubranog u 24-h, 30-h. 36-h,48-h i 72-h nakon MeJA ili lažne primjene i analizirano HPLC-om (Sl. 2). Treba napomenuti da su ove vremenske točke odabrane kako bi se uzela u obzir vrijeme potrebno za sintezu proteina i proizvodnju metabolita i nakupljanje nakon promatranih promjena ekspresije shikimata i HT biosintetskih gena u 6-h. Vremena zadržavanja i apsorpcijski spektri dvaju metabolita eluiranih na 4,57 min (pik 1) i 24,98 min (pik 2) podudaraju se s onima međuprodukata HT puta - glukogalina i Penta legure-glukoze, redom (slike la i 2a). Oba vrha pokazala su značajne promjene u integriranim područjima vrhova u više vremenskih točaka (Slika 2b). Konkretno, vršna vrijednost 1 povećala se u listovima tretiranim MeJA u odnosu na lažne kontrole na 30-h, 36-h i 48-h (Slika 2b). Zanimljivo je da se maksimum 2 u listovima tretiranim MeJA-om u početku smanjio na 24-h, ali se kasnije povećao na 30-h i 36-h prije nego što se vratio na razinu sličnu lažnim kontrolama na 48- h i 72-h (Slika 2b). Smanjenje većine flavonoida i antocijana, kao i povećanje metiliranih flavona i flavonola, vidljivo je u listovima nara tretiranim MeJA-om

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tablice S5 i S6). Za različito akumulirane metabolite, došlo je do ukupnog obogaćivanja metabolita uključenih u sekundarni/specijalizirani metabolizam biljaka (67 od 102), posebno fenolnih spojeva (63 od 102) (Tablica S6).

Među fenolima, usklađeno smanjenje širokog raspona flavonoida i antocijana (42 od 73 smanjena spoja) bilo je vidljivo u listovima tretiranim MeJA (Slika 3; Tablica S6). Intrigantno je da su tri mono- ili di-O-metilirana flavona i flavonola, uključujući di-O-metil kvercetin, krizoberil O-heksozil-O-heksozid i prodajni 5-O-heksozid, povećani u listovima tretiranim MeJA (Slika 3; Tablica S6). Nekoliko intermedijera puteva flavonoida i antocijana, uključujući luteolin, krizoberil, dihidrokempferol, dihidrokvercetin, dihidromiricetin, epikatehin, delfinidin i pelargonidin, mogli su se otkriti, ali nisu pokazali značajne promjene u lišću tretiranom MeJA (Slika 3; Tablica S5). Derivati ​​hidroksicin-namoila, izoflavoni i kumarini bili su među ostalim fenolima koji su pokazali smanjenu akumulaciju nakon indukcije MeJA (Tablica S6). Nasuprot tome, dvije fenolne kiseline, 2,3-dihidroksibenzojeva kiselina i protokatehuinska kiselina (3,4-dihidroksibenzojeva kiselina) i kumarin, 6-metil kumarin, povećane su u lišću tretiranom MeJA (Tablica S6).

U skladu s uvelike smanjenim flavonoidima i antocijaninima u listovima nara tretiranim MeJA-om, transkripti dvaju ključnih enzima za biosintezu flavonoida i antocijana. CHS(Pgr005566) i CHI (Pgr025966), bili su značajno smanjeni u 6-h i 24-h nakon primjene MeJA prema analizi transkriptoma (Slika 4). Provedena je qPCR analiza u stvarnom vremenu kako bi se ispitala ekspresija CHS i CHI s dodatnim vremenskim točkama, uključujući 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h, i 72-h (Slika 4). Transkripti CHS pali su u listovima tretiranim MeJA-om u 3-h i ostali su znatno niži od onih u lažnom kontrole do 72-h, s najvećim smanjenjem u 12-h. Nasuprot tome, smanjenje ekspresije CHI bilo je značajno samo u 24-h, 48-h i 72-h nakon liječenja MeJA (Slika 4).

Ovaj je članak izvađen iz Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9