Ekstrakcija, fizikalno-kemijska svojstva, djelovanje protiv starenja i antioksidativno djelovanje polisaharida iz ostataka industrijske konoplje 1. dio

Sažetak: Velika količina polisaharida konoplje ostaje u ostacima industrijske konoplje (IHR) nakon ekstrakcije kanabidiola, što dovodi do rasipanja resursa. Stoga je sustavno proučavanje polisaharida konoplje korisno za razvoj IHR-a u budućnosti. U ovoj studiji, ekstrakcija ostataka polisaharida industrijske konoplje (IHRP) optimizirana je jednofaktorskim eksperimentom i ortogonalnim eksperimentalnim dizajnom. Optimalni uvjeti ekstrakcije zagrijavanjem bili su temperatura ekstrakcije 98 ◦C, omjer kruto-tekućina 1:10, vrijeme ekstrakcije 1 h, broj uzastopnih ekstrakcija 2 i pH 4. Omjer ekstrakcije i sadržaj polisaharida bili su 20.12 ± 0,55 posto odnosno 12,35 ± 0,26 posto pri uvjetima. Osim toga, najbolji uvjeti za taloženje alkohola bili su pumpanje s 2 L/h, kontinuirano miješanje i ledeno-vodena kupelj 4 sata. Sirovi IHRP-ovi su dalje pročišćeni kromatografijom na stupcu i sadržaj polisaharida/proteina u pročišćenim IHRP-ovima bio je 34,44 posto i 1,61 posto. IHRP su uglavnom sastavljeni od deset monosaharida i nekih komponenti koje nisu šećer, uključujući organske kiseline, flavonoide, steroide i glikozide. FT-IR je pokazao polisaharidni kostur IHRP-a. Štoviše, stope uklanjanja DPPH i ABTS IHRP-a bile su 76.00 posto i 99,05 posto pri koncentracijama od 1 mg/mL. IHRP bi mogli potaknuti proliferaciju epidermalnih stanica i zacjeljivanje staničnih ogrebotina. U međuvremenu, IHRP bi mogli promicati ekspresiju gena povezanih s usporavanjem starenja. Sve u svemu, IHRP bi mogli biti poželjan prirodni izvor antioksidansa i proizvoda protiv starenja u mnogim aspektima.

Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i tkivu pluća eksperimentalno starih miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i može hvatati reaktivne vrste kisika, spriječiti degradaciju kolagena izazvanu slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.

Kliknite na rou cong rong pogodnosti

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ključne riječi: industrijska konoplja; polisaharid; izvlačenje; antioksidativno djelovanje; aktivnost protiv starenja

1. Uvod

Konoplja (Cannabis sativa L.), jednogodišnja biljka iz obitelji Cannabis, koristi se tisućama godina [1]. Sadržaj tetrahidrokanabinola (THC) u industrijskoj konoplji manji je od 0.3 težinskih postotaka, što se razlikuje od medicinske marihuane i marihuane za rekreacijske svrhe [2,3]. Stoga bi se industrijska konoplja mogla legalno uzgajati u velikim razmjerima. Kemijski sastav industrijske konoplje je vrlo složen, uključujući kanabinoide, terpenoide, alkaloide i flavonoide [4]. Bioaktivniji spojevi su kanabinoidi koji uključuju više od 130 terpenskih fenolnih spojeva koji se uglavnom nakupljaju u vrhovima cvjetova [5]. Glavni kanabinoidi su THC, kanabidiol (CBD), kanabinol (CBN), kanabigerol (CBG), kanabidivarin (CBDV), kanabidiol (CBT) i kanabiciklol (CBL) [6]. Među njima, THC, psihoaktivni spoj koji je zabranjen u različitim zemljama, i CBD su najviše proučavani kanabinoidi zbog svojih značajnih bioaktivnosti [7], kao što su neuroprotektivne, antiepileptičke, antikancerogene i imunoregulacijske aktivnosti [8]. Postojanje ovih spojeva povećava važnost industrijske konoplje. Trenutno se industrijska konoplja naširoko koristi u područjima svakodnevnih kemikalija, materijala, energije i medicine [9]. Sadašnja obrada ostataka industrijske konoplje (IHR) je njihovo izravno odbacivanje, što ne samo da zagađuje okoliš, već uzrokuje i rasipanje resursa [10].

Polisaharid je polimer koji se sastoji od više od 10 monosaharida [11]. Jedna je od najvažnijih bioloških makromolekula. Posljednjih godina mnogi su članci izvijestili da prirodni polisaharidi iz biljaka imaju dobra biološka djelovanja, uključujući antikancerogeno [12], protuupalno [13], antioksidativno [14], imunomodulatorno [15], hipoglikemijsko [16] i antivirusno djelovanje [17]. Molekularni sastav i prostorna struktura polisaharida općenito imaju značajne učinke na njihova svojstva i aktivnosti [18]. S razvojem tehnologije odvajanja, pročišćavanja i strukturne analize polisaharida, opće je prihvaćeno da polisaharidi imaju veliku primjenjivu vrijednost u području lijekova, kozmetike i hrane [19]. Sadržaj polisaharida iz ostataka industrijske konoplje je oko 10 posto – 15 posto. Polisaharidi konoplje imaju mnoga izvrsna fizikalno-kemijska svojstva jer sadrže mnogo hidrofilnih hidroksila, kao što su snažna sposobnost upijanja vode, svojstva emulgiranja i dobra sposobnost stvaranja filma. U međuvremenu, polisaharidi konoplje imaju zadržavanje vlage, antibakterijski i netoksični učinak. Stoga imaju velike izglede za primjenu u području kozmetike. Fermentirani proizvodi polisaharida konoplje (oligosaharidi ili neki šećerni alkoholi), za koje se izvješćuje da imaju dobre antioksidativne aktivnosti, djeluju protiv starenja i umora, korišteni su za razvoj funkcionalnih napitaka [20]. Sastav polisaharida konoplje je relativno složen i kreće se od monosaharida do polisaharida 5 × 104 Da.

Malo je izvješća o odvajanju i ekstrakciji polisaharida konoplje. Hillestad i sur. izolirao dva glikoproteina iz konoplje. Struktura povezivanja glukozidnog lanca i veza između lanca i proteina analizirani su metilacijom i Smithovom razgradnjom [21]. JW Groce i sur. mjerio je sadržaj ugljikohidrata u konoplji koja se uzgaja u Sjedinjenim Državama, Tajlandu i Vijetnamu. Istaknuto je da postoje velike razlike u vrsti i sadržaju spojeva između sorata s različitih područja [22]. Zheng i sur. analizirali su monosaharidni sastav i strukturu HSP0 i HSP0.2, dvije komponente polisaharida sjemenki konoplje, pomoću HPLC i FT-IR. Utvrđeno je da oba HSP0 i HSP0.2 sadrže sulfatne radikale [23]. Bi i sur. su gel filtracijskom kromatografijom dobili dva polisaharida sjemenki konoplje HS1 i HS2. Glavni monosaharidi bili su D-arabinoza, D-ksiloza, D-manoza, D-galaktoza i D-glukoza, a njihovi molarni omjeri bili su 0.12, 0.09 , 0.15, 0.11, odnosno 0,12 [24]. Guo i sur. pripremili polisaharide iz lišća industrijske konoplje i proučavali učinke ultraljubičastog svjetla, temperature i pH na njihovu antibakterijsku aktivnost. Utvrđeno je da su minimalna baktericidna koncentracija i minimalna koncentracija inhibicije polisaharida protiv S. aureusa bile 6,25 odnosno 3,125 mg/mL. Dodatno, antibakterijska aktivnost bila je najveća kada je pH bio 7.

U ovoj studiji, IHR nakon ekstrakcije kanabidiola korišten je kao sirovina za ekstrakciju polisaharida. Optimiziran je postupak ekstrakcije i pročišćavanja ostataka polisaharida industrijske konoplje (IHRP). Zatim je analizirana struktura i sastav IHRP-ova. Osim toga, procijenjena je sposobnost čišćenja ABTS i DPPH IHRP-a. Njegovo djelovanje protiv starenja također je proučavano na staničnoj razini. Nadamo se da bi se IHRP mogli naširoko koristiti u kozmetici i područjima funkcionalne hrane.

2. Rezultati i rasprava

2.1. Eksperimenti ekstrakcije s jednim faktorom za IHRP

2.1.1. Učinci metoda ekstrakcije na ekstrakciju polisaharida

Učinci ekstrakcije perkolacijom, ekstrakcije zagrijavanjem i ekstrakcije potpomognute ultrazvukom na ekstrakciju polisaharida prikazani su na slici 1a. Moglo se vidjeti da je sadržaj polisaharida ekstrakcije perkolacijom bio blizu 0 posto, što je značilo da gotovo nikakav polisaharid nije ekstrahiran, a ekstrakt se uglavnom sastojao od pigmenta i drugih komponenti topivih u vodi. Rezultati su rezultat toga što je ekstrakcija perkolacijom bila vrlo nježna i stanična stijenka IHR-a nije bila slomljena. Stoga se polisaharidi nisu mogli ekstrahirati iz stanica, što je uzrokovalo da sadržaj polisaharida i omjer ekstrakcije kod perkolacijske ekstrakcije budu vrlo niski. Omjer ekstrakcije kod ekstrakcije grijanjem bio je veći nego kod ekstrakcije potpomognute ultrazvukom. Međutim, sadržaj polisaharida ekstrakcije zagrijavanjem (11,27 posto) bio je niži nego kod ekstrakcije potpomognute ultrazvukom (13,81 posto). Ekstrakcija grijanjem jedna je od najčešće korištenih metoda ekstrakcije zbog jednostavnosti procesa i niske cijene. Međutim, vrijeme ekstrakcije zagrijavanjem je relativno dugo i omjer ekstrakcije nije visok. Temperatura ekstrakcije općenito ima veliki utjecaj na omjer ekstrakcije. Veći omjer ekstrakcije kod ekstrakcije grijanjem u ovom radu bio je zato što je ekstrakcija grijanjem izvedena na 98 ◦C, dok je ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom izvedena na 60 ◦C. Ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom mogla bi skratiti vrijeme ekstrakcije jer učinak kavitacije i mehanički učinak mogu uništiti stanične stijenke, poboljšati prodiranje otapala i ubrzati prijenos polisaharida u otapalo [25]. Dakle, sadržaj polisaharida ekstrakcije potpomognute ultrazvukom bio je veći nego kod ekstrakcije zagrijavanjem. Ekstrakcija zagrijavanjem odabrana je za sljedeće eksperimente s obzirom na jednostavnost procesa i industrijalizaciju.

2.1.2. Učinci temperature ekstrakcije na ekstrakciju polisaharida

Učinci temperature ekstrakcije na ekstrakciju polisaharida prikazani su na slici 1b kada je omjer krutina i tekućina bio 1:10, vrijeme ekstrakcije 1 h, broj uzastopnih ekstrakcija 2, a pH 7. Omjer ekstrakcije i sadržaj polisaharida povećana s porastom temperature. Kada je temperatura bila 98 ◦C, najveći omjer ekstrakcije i sadržaj polisaharida bili su 14,99 posto odnosno 12,03 posto.

2.1.3. Učinci omjera krutina i tekućina na ekstrakciju polisaharida

Kada je temperatura ekstrakcije bila 98 ◦C, vrijeme ekstrakcije je bilo 1 h, broj uzastopnih ekstrakcija je bio 2, a pH je bio 7, učinci omjera krutina i tekućina na ekstrakciju polisaharida prikazani su na slici 1c. Omjer ekstrakcije postupno se povećavao s omjerom krutina i tekućina od 1:6 do 1:10, a zatim je postao ujednačen. Međutim, na sadržaj polisaharida gotovo da nije utjecao omjer krutina i tekućina. Osim toga, otopina je mogla samo potopiti sirovinu kada je omjer krutina i tekućina bio 1:5 zbog niske gustoće lišća biljke. Stoga je primarno proučavan omjer krutina i tekućina od 1:6.

2.1.4. Učinci pH na ekstrakciju polisaharida

Kada je temperatura ekstrakcije bila 98 ◦C, vrijeme ekstrakcije bilo je 1 h, broj uzastopnih ekstrakcija bio je 2, a omjer krutina i tekućina bio je 1:10, učinci pH na ekstrakciju polisaharida prikazani su na slici 1d. Kad se otopina postupno zakiseli ili alkalizira, omjer ekstrakcije se donekle poboljšao. Međutim, sadržaj polisaharida imao je trend pada s porastom pH, što je ukazivalo na to da je kiselo stanje bilo korisno za ekstrakciju IHRP-a.

2.1.5. Učinci vremena ekstrakcije na ekstrakciju polisaharida

Kada je temperatura ekstrakcije bila 98 ◦C, pH je bio 7, broj uzastopnih ekstrakcija bio je 2, a omjer krutina i tekućina bio je 1:10, učinci vremena ekstrakcije na ekstrakciju polisaharida prikazani su na slici 1e. Omjer ekstrakcije lagano se smanjio kada je vrijeme ekstrakcije premašilo 1 h. Nadalje, na sadržaj polisaharida gotovo da nisu utjecala različita vremena ekstrakcije.

2.1.6. Učinci broja uzastopnih ekstrakcija na ekstrakciju polisaharida

Kad je temperatura ekstrakcije bila 98 ◦C, vrijeme ekstrakcije 1 h, pH 7, a omjer krutina i tekućina 1:10, učinci nekoliko uzastopnih ekstrakcija na ekstrakciju polisaharida prikazani su na slici 1f. Omjer ekstrakcije pao je na 5,11 posto kada je sirovina ekstrahirana drugi put. Osim toga, sadržaj polisaharida bio je vrlo nizak kada je sirovina ekstrahirana treći put.

2.2. Ortogonalni eksperimentalni dizajn ekstrakcije za IHRP

It could be seen that extraction temperature, solid–liquid ratio, number of successive extractions, and pH had a great influence on polysaccharide extraction based on the single-factor experiments. Therefore, the orthogonal experiments were carried out to further optimize the extraction conditions. As shown in Table 1, the order of effect of individual factors on polysaccharide extraction was: extraction temperature > several successive extractions>omjer kruto-tekuće > pH. Skupina 5 (omjer krutine i tekućine bio je 1:8, broj uzastopnih ekstrakcija bio je 3, temperatura ekstrakcije bila je 80 ◦C, a pH je bio 4) imala je najveći sadržaj polisaharida (12,79 posto), dok je skupina 9 (omjer krutina i tekućina bio 1). :10, broj uzastopnih ekstrakcija bio je 2, temperatura ekstrakcije bila je 98 ◦C, a pH je bio 4) imao je drugi najveći sadržaj polisaharida (12,26 posto). S obzirom na potrošnju energije i operativnost, provedena je validacija usporedbe između skupina 5 i 9 kako bi se odredili najprikladniji uvjeti ekstrakcije. Kao što je prikazano u tablici 2, verificirani pokusi pokazali su da je sadržaj polisaharida između skupina 5 i 9 bio vrlo blizak. Stoga, kako bi se uštedjela potrošnja energije, odabrani su uvjeti ekstrakcije grupe 9 za ekstrahiranje IHRP-a za njegovu upotrebu u sljedećim eksperimentima: omjer krutina i tekućina bio je 1:10, temperatura ekstrakcije bila je 98 ◦C, broj uzastopnih ekstrakcija bio je 2, i pH je bio 4.

2.3. Prikaz IHRP-ovih uvjeta taloženja alkohola

Otopina za ekstrakciju IHRP-a dobivena je prema uvjetima ekstrakcije optimiziranim prema 2.2. Učinci različitih uvjeta taloženja alkohola prikazani su u tablici 3. U usporedbi s jednokratnim dodavanjem i miješanjem 0.5 h, kontinuirano pumpanje i miješanje moglo bi dodatno poboljšati sadržaj polisaharida. Međutim, učinak brzine hlađenja na sadržaj polisaharida nije bio očit. Stoga su za pripremu IHRP odabrani uvjeti alkoholnog taloženja grupe 4.

2.4. Prinos polisaharida i kemijski sastav pročišćenih IHRP

Sirovi IHRP-ovi su obezbojeni i pročišćeni adsorpcijom aktivnim ugljenom, membranskom filtracijom, kromatografijom na stupcu i metodom iscjeđivanja. Kao što je prikazano na slici 2, tretman s 8 posto adsorpcije aktivnog ugljena imao je najbolji učinak obezbojavanja, nakon čega je slijedio tretman kromatografijom na stupcu. Osim toga, selvage metoda i membranska filtracija nisu imale gotovo nikakav učinak obezbojavanja. S obzirom na industrijalizaciju i jednostavnost procesa, kromatografija na koloni sa smolom za anionsku izmjenu korištena je za pročišćavanje IHRP-a u ovom rukopisu. Osim toga, kao što je prikazano u tablici 4, težina IHRP-a bila je 15,26 g kada je pročišćavanje provedeno nakon taloženja alkohola, dok je težina IHRP-a bila 12,74 g kada je pročišćavanje provedeno neposredno nakon ekstrakcije zagrijavanjem. Međutim, stvarna težina polisaharida dvaju procesa bila je vrlo blizu (4,69 g i 4,38 g). Stoga, radi uštede na troškovima, pročišćavanje kromatografijom na stupcu može se provesti neposredno nakon ekstrakcije zagrijavanjem.

2.5. FT-IR spektroskopija IHRP-ova

Neke strukturne karakteristike polisaharida mogu se zaključiti na temelju karakterističnih apsorpcijskih vrhova FT-IR [26]. FT-IR spektar IHRP-a prikazan je na slici 3 i može se uočiti tipična apsorpcija polisaharida. Vrh oko 3378 cm−1 pripisan je -OH vibracijama istezanja, što ukazuje na postojanje -OH [27]. Slabi vrh na 2932 cm−1 bio je CH rastezanje vibracija, uključujući vibracije -CH2 i -CH3 [28]. Snažan vrh na oko 1600 cm−1 bio je povezan s -C=O vibracijom rastezanja [29], a vrh oko 1413 cm−1 je označen za CO rasteznu vibraciju, što ukazuje na postojanje -COOH. Osim toga, relativno jak vrh na 1080 cm−1 vrlo vjerojatno odgovara OH vibracijama savijanja. FT-IR spektar IHRP-a pokazao je mnoge karakteristične apsorpcijske vrhove polisaharida, pokazujući polisaharidni kostur IHRP-a.

2.6. Analiza sastava monosaharida IHRP-a

Bioaktivnost polisaharida često je povezana s sastavom monosaharida. U ovoj studiji, monosaharidni sastav IHRP-a dobiven je ionskom kromatografijom kao što je prikazano na slici 4. Prema monosaharidnim standardima, IHRP-ovi su se sastojali od fukoze, arabinoze, ramnoze, galaktoze, glukoze, ksiloze, riboze, galakturonske kiseline, guluronske kiseline, i glukuronsku kiselinu. Njihovi postoci kvalitete bili su 1,33, 19,60, 10,41, 20,87, 27,42, 4,23, 3,12, 6,22, 0,28 i 2,37 redom. Moglo se ustanoviti da su arabinoza, ramnoza, galaktoza i glukoza glavni monosaharidi u IHRP-ima. Glukoza je bila dominantan monosaharid u IHRP-ovima i rezultat je bio u skladu s prethodnom studijom [30]. Sadržaj uronske kiseline mogao je učiniti polisaharide negativno nabijenima. Ovaj rezultat je imao značajan utjecaj na bioaktivnost polisaharida [31]. Osim toga, sadržaj polisaharida u IHRP-ima bio je između 30 i 35 posto. Komponente koje nisu šećer bile su uglavnom organske kiseline, flavonoidi, steroidi i glikozidi. U međuvremenu, sadržaj svake nešećerne komponente bio je relativno nizak.

2.7. Studija antioksidativne aktivnosti

Sposobnost hvatanja slobodnih radikala ABTS i DPPH opsežno je proučavana kako bi se procijenila antioksidacijska aktivnost polisaharida [32]. Kapacitet čišćenja IHRP-a protiv ABTS-a i DPPH-a prikazan je u Tablici 5. Kao što je prikazano u Tablici 5, brzina čišćenja DPPH-a i ABTS-a porasla je s povećanjem koncentracije IHRP-a. Kada je koncentracija IHRP-a bila 1.0 mg/mL, stopa uklanjanja DPPH bila je 76.00 posto dok je stopa uklanjanja ABTS bila 99.{{10}}5 posto . Nakon izračuna, EC50 vrijednosti ABTS i DPPH određene su kao 0.34 i 0.47 mg/mL. Koliko znamo, nema izvješća o antioksidativnom djelovanju IHRP-a. Proučavano je antioksidativno djelovanje cvatova 12 jednodomnih kultivara Cannabis sativa L. [33]. Među njima, ananas je imao najjaču sposobnost čišćenja protiv DPPH (EC50=60.00 µg/mL), dok je Kc-Virtus imao najjaču sposobnost čišćenja protiv ABTS (EC50=304.77 µg/ mL). Što se tiče antioksidativne aktivnosti ulja punog spektra kanabidiola, objavljeno je da je njegov DPPH EC50 158,0 µg/mL [34]. Dodatno, objavljeno je da je DPPH EC50 CBD-a 0,937 mM [35]. Proučavana je i sposobnost hvatanja slobodnih radikala CBDV-a, tj. ABTS EC50 iznosio je 406,3 µM dok je DPPH EC50 bio 3736 µM [36]. Gore navedeni rezultati pokazuju da su IHRP-i pokazali veliku antioksidacijsku aktivnost

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】