Ekstrakcija feniletanoidnih glikozida iz Cistanche Tubulosa homogeniziranom ekstrakcijom smicanjem velikom brzinom

Pozadina:

Cistanche tubulosa poznata je tradicionalna kineska medicina porijeklom iz Xinjianga. Široko je rasprostranjena u sjevernoj Africi, Indiji itd. Cilj: Glavna bioaktivna komponenta C. tubulosa jefeniletanoidni glikozidi (PhG). Ehinakozid i akteozid su indikativne komponente za određivanje PhG i uglavnom se koriste za zaštitu jetre, imunološku zaštitu itd. Stoga je vrlo važno ekstrahirati PhG iz C. tubulosa. Metode: U ovom su istraživanju uspoređivane metode ekstrakcije potpomognute ultrazvukom (UAE), ekstrakcije potpomognute mikrovalovima (MAE) i metode homogenizacije smicanjem velike brzine (HSHE). Nadalje, optimizirani su uvjeti ekstrakcije HSHE metode. Rezultati: Rezultati su pokazali da je metoda HSHE bolja od metode UAE i MAE, a optimalni parametri ekstrakcije HSHE bili su koncentracija etanola od 50%, temperatura ekstrakcije od 70 stupnjeva, brzina rotacije od 16000 okretaja u minuti, ekstrakcija vrijeme od 2 minute, omjer kruto-tekuće 1:9 i jedan ciklus ekstrakcije. Prinosi odehinakozid i akteozidbile su 1,366 odnosno 0.519%, a brzine prijenosa ehinakozida i akteozida dosegle su 87 odnosno 94%. Zaključci: Može se zaključiti da je HSHE metoda jednostavna, brza i učinkovita tehnika za ekstrakciju PhG iz C. tubulosa. Istaknuto: Istražena je učinkovita i ekološki prihvatljiva HSHE metoda za ekstrakciju PhG iz C. tubulosa. Dobiveni su optimalni uvjeti HSHE metode za ekstrakciju PhG iz C. tubulosa. Ovo istraživanje pruža novu metodu za industrijsku ekstrakciju PhG iz C. tubulosa.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

CIstane Tubulosaje uobičajena tradicionalna kineska medicina koja potječe iz Xinjianga. Široko je rasprostranjen u sjevernoj AfriciArapskom poluotoku, Pakistanu i Indiji te je službeno zabilježen u Kineskoj farmakopeji 2010. Glavna bioaktivna komponenta C. tubulozaje feniletanoidni glikozid (PhG), klasa prirodnih proizvoda topivih u vodi uključujućiehinakozid, akteozid, izoakteozidi 2-acetilakteozid (1, 2). Struktura PhG-a sastoji se od cimetne kiseline i hidroksifeniletilnih ostataka, a oba su vezana za -glukopiranoza preko esteraodnosno glikozidne veze (3). Farmakološke studije su pokazale da PhGs odC. tubulosaimaju mnoge ljekovite funkcije, kao što su učinak protiv umora (4), neuroprotektivni (5-7), zaštitni učinak na jetru (8-10) i imunoprotektivni učinak (11). Stoga je učinkovita ekstrakcija PhG-a izC. tubulosaod velike je važnosti za razvoj i korištenje prirodnih proizvoda.

Sadašnje tradicionalne metode ekstrakcije PhG-a su ekstrakcija vrućim refluksom, ekstrakcija uz pomoć ultrazvuka (UAE) i ekstrakcija uz pomoć mikrovalova (MAE; 12-16). Ove metode imaju različite nedostatke, kao što su niska učinkovitost, dugo vrijeme ekstrakcije i visoki troškovi. U usporedbi s tradicionalnim metodama, metoda ekstrakcije smičnom homogenizacijom velikom brzinom (HSHE) je nova ekstrakcijska metoda u nastajanju i ima prednosti kraćeg vremena ekstrakcije, manje otpada otapala, većeg prinosa, jednostavnijih uređaja i lakšeg rada (17). Princip rada HSHE metode temelji se na rotirajućem unutarnjem rezaču kojeg pokreće motor velike brzine. Unutarnji i vanjski rezači proizvode snažnu silu smicanja kako bi razbili i pomiješali uzorke. U međuvremenu, rezač s velikom brzinom rotacije uzrokuje razlike u tlaku između unutarnje i vanjske šupljine rezača, što rezultira prijenosom mase između uzoraka i otapala. Kombinacijom velike sile smicanja, sile sudara, pritiska i drugih sila, može se brzo postići topljiva ravnoteža između krutih uzoraka i otapala (18). Dakle, proces ekstrakcije HSHE može biti dovršen za nekoliko minuta, pa čak i za nekoliko desetaka sekundi (19-22).

Nedavno je HSHE istražen u ekstrakciji bioaktivnih komponenti iz raznih prirodnih proizvoda (23-25). Cheng i sur. koristio je HSHE za izdvajanje pet lignana iz ploda Schisandra chinensis (26). Rezultati su pokazali da su optimalni uvjeti bili koncentracija etanola od 75%, vrijeme ekstrakcije od 1 min, omjer krutine i tekućine od 1:19, napon ekstrakcije od 180 V i čestica uzorka veličine 120 oka. Ukupni prinos pet lignana bio je 13,89 ± 0,014 mg/g u optimiziranim uvjetima. Tang i sur. koristili su HSHE za dobivanje bioaktivnog ulja iz sjemenki perile (27). Optimalni uvjeti bili su vrijeme ekstrakcije od 2 minute, omjer krutine i tekućine 1:10, napon ekstrakcije od 150 V i dva ciklusa ekstrakcije. Prinos ulja sjemenki perile dosegao je 59,3%. Gore navedeni rezultati pokazuju da HSHE ima prednosti kratkog vremena ekstrakcije, niskih troškova i visokih prinosa. Međutim, nedostaju istraživanja o ekstrakciji PhG pomoću HSHE.

U ovoj studiji, HSHE je korišten za istraživanje njegove potencijalne primjene u ekstrakciji PhG iz C. tubulosa. Prinos PhG je određen pomoću HPLC. Tri metode ekstrakcije, HSHE, UAE i MAE, uspoređivane su pod istim uvjetima. Istraživani su učinci koncentracije etanola, temperature ekstrakcije, brzine rotacije, vremena ekstrakcije, omjera krutine i tekućine i broja ciklusa ekstrakcije na prinos. Uspoređuju se i raspravljaju prednosti i nedostaci ovog rada i literature.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA KINESKA TRADICIONALNA MEDICINAPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materijali i metode

Materijal i kemijski reagensi

C. tubulosa kupljena je od Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Kina). Standardi ehinakozida (čistoće veće ili jednake 98%) i akteozida (čistoće veće ili jednake 98%) kupljeni su od Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Šangaj, Kina). Acetonitril, metanol i octena kiselina bili su HPLC kvalitete (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Etanol analitičke kvalitete kupljen je od Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Kina). Tijekom pokusa korištena je deionizirana voda.

HPLC analiza

HPLC analiza je provedena na Waters e2695 tekućinskom kromatografu (Waters, Milford, MA) opremljenom 2489 UV/Visible detektorom i Symmetry C18 kolonom (Waters), 250 × 4,6 mm, veličina čestica 5 μm. Koncentracije ehinakozida i akteozida analizirane su HPLC metodom. Mobilna faza sastojala se od (1) acetonitrila i (2) 2% vodene otopine ledene octene kiseline. Program gradijentnog eluiranja prikazan je u tablici 1.

Detektirana valna duljina je bila 330 nm, brzina protoka je bila 1 mL/min, volumen injekcije je bio 10 μL, a temperatura peći je bila postavljena na 30 stupnjeva. Kromatografski vrh analita potvrđen je usporedbom njegovog vremena zadržavanja s vremenom standarda. Kvantifikacija je provedena integracijom vrha korištenjem vanjske standardne metode.

Ispitivanje preciznosti provedeno je ubrizgavanjem istih uzoraka ekstrakcije pet puta. Za test stabilnosti, isti su uzorci analizirani u razmacima od 0, 1, 2, 4, 12, 24 i 48 h.

Testovi iskorištenja ehinakozida i akteozida provedeni su dodavanjem standarda u uzorke ekstrakcije. Zabilježene su sve površine pikova i vremena zadržavanja ehinakozida i akteozida. Rezultati kalibracijskih krivulja za ehinakozid i akteozid navedeni su u tablici 2.

Izračun prinosa

Ehinakozid i akteozid korišteni su kao indikativne komponente za određivanje PhG. Prinos ehinakozida ili akteozida izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe:

gdje je Y=prinos ehinakozida ili akteozida (%); C=koncentracije ehinakozida ili akteozida (mg/mL); V=volumen otopine za ekstrakciju (mL); i W=težina praha C. tubulosa (mg).

Metode ekstrakcije PhG-ova Stabljike C. tubulosa prvo su samljevene električnim mlinom (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Kina) i filtrirane pomoću filtarskog sita (približno 380 μm ). Zatim je prah C. tubulosa sušen u pećnici na 70 stupnjeva dok težina nije bila konstantna. Pet grama praha C. tubulosa pomiješano je s otapalom za ekstrakciju i stavljeno u bocu za ekstrakciju. Nakon toga, tekuća smjesa je prethodno zagrijavana (30-80 stupnjeva) 5 minuta u vodenoj kupelji konstantne temperature (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Kina).

(a) Metoda HSHE. - HSHE je proveden pomoću sustava FA25 (FLUKO Co., Ltd, Šangaj, Kina), koji se sastojao od rotirajućeg rezača, motora velike brzine i kontrolera. Brzina rotacije unutarnjeg rezača regulirana je u rasponu od 10000-28000 o/min, a vrijeme ekstrakcije je podešeno u rasponu od 2-15 min.

(b) UAE metoda. - Pet grama osušenog uzorka i 300 mL metanola točno su izvagani i dodani u bocu za ekstrakciju. Boca za ekstrakciju je uronjena u ultrazvučnu kupku i 10 minuta je radila na ultrazvučnoj snazi ​​od 300 W. Temperatura ekstrakcije postavljena je na 30 stupnjeva.

(c) MAE metoda. - Pet grama osušenog uzorka i 300 mL metanola točno su izvagani i dodani u bocu za ekstrakciju. Boca za ekstrakciju je stavljena u mikrovalni reaktor i držana na 180 W 10 minuta. Temperatura ekstrakcije postavljena je na 30 stupnjeva.

Metoda HSHE uspoređena je s metodama UAE i MAE s istim ekstrakcijskim otapalom, vremenom ekstrakcije, temperaturom ekstrakcije, omjerom krutine i tekućine i brojem ciklusa ekstrakcije. Otopina za ekstrakciju je filtrirana 0.22 μm membranom i analizirana pomoću HPLC da se odrede koncentracije ehinakozida i akteozida. Svi postupci ekstrakcije ponovljeni su tri puta.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE IMUNITETA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Određivanje stopa prijenosa

Na temelju standardne metode u 2015 China Pharmacopoeia određen je sadržaj ehinakozida i akteozida u prahu C. tubulosa (28). Jedan gram praha C. tubulosa i 50 mL 50% metanola točno su izvagani i dodani u smeđu volumetrijsku tikvicu od 50 mL. Tekuća smjesa je izvagana i natopljena 30 min. Zatim je smeđa volumetrijska tikvica uronjena u ultrazvučnu kupelj i provedena pri ultrazvučnoj snazi ​​od 250 W i frekvenciji od 35 kHz tijekom 40 minuta. Tekuća smjesa je ponovno izvagana, i dodan je 50% metanol da bi se spriječio gubitak otapala. Otopina za ekstrakciju je filtrirana kroz membranu od 0,22 µm i analizirana pomoću HPLC da se odrede koncentracije ehinakozida i akteozida. Postupci ekstrakcije ponovljeni su tri puta.

Brzine prijenosa ehinakozida ili akteozida izračunate su pomoću sljedeće jednadžbe:

gdje je X=brzina prijenosa ehinakozida ili akteozida (%); M1=kvaliteta ehinakozida ili akteozida u ekstraktu (mg); i M2=kvaliteta ehinakozida ili akteozida u prahu C. tubulosa (mg).

Rezultati i rasprava

Validacija HPLC metode

HPLC profili ehinakozida i akteozida iz C. tubulosa korištenjem HSHE prikazani su na slici 1. RSD područja vrha ehinakozida i akteozida bili su 1,89 odnosno 1,40%. Rezultati su pokazali da HPLC metoda ima dobru preciznost u kvantitativnoj analizi ehinakozida i akteozida. U raznim vremenima (0–48 h), RSDs područja vrha ehinakozida i akteozida bili su 1,71 odnosno 1,70%, što ukazuje da je uzorak bio stabilan u 48 h. Iskorištenje ehinakozida i akteozida iznosilo je 99,3 odnosno 99,1%, a njihov RSD 0,70 odnosno 0,67%, čime je potvrđena pouzdanost HPLC metode.

Usporedba različitih metoda ekstrakcije Usporedba metode HSHE s metodama MAE i UAE u pogledu prinosa ehinakozida i akteozida bila je

provedeno, čiji su rezultati prikazani na slici 2. Uočeno je da su prinosi ehinakozida i akteozida dobiveni pomoću HSHE veći od onih dobivenih i MAE i UAE. U usporedbi s MAE, prinosi ehinakozida i akteozida dobiveni HSHE bili su veći za 20,5 odnosno 20,8%. U usporedbi s UAE, prinosi ehinakozida i akteozida dobiveni HSHE-om bili su veći za 6,6 odnosno 7,4%. Ovi rezultati pokazuju da HSHE može značajno povećati prinose PhG-a.

Optimizacija HSHE metode

Parametri ekstrakcije PhG-a pomoću HSHE uključuju koncentraciju etanola, temperaturu ekstrakcije, brzinu rotacije, vrijeme ekstrakcije, omjer krutine i tekućine i broj ciklusa ekstrakcije (26, 29)

Učinak koncentracije etanola na ekstrakciju PhG

Koncentracija etanola važan je faktor koji utječe na prinose PhG-a. Kao što je prikazano na slici 3, ispitani su prinosi ehinakozida i akteozida iz C. tubulosa pod različitim koncentracijama etanola. Otkrilo je da se prinos ehinakozida povećao s 0 na 30%, a zatim smanjio s 30 na 90% s povećanjem koncentracije etanola. Prinos akteozida se povećao od 0 do 70%, a zatim se smanjio od 70 do 90% s povećanjem koncentracije etanola. Kada koncentracija etanola

bio 50%, zbroj prinosa ehinakozida i akteozida bio je na svom maksimumu. Različite koncentracije etanola imaju različite polaritete, što dovodi do različite topivosti ehinakozida i akteozida. Stoga je optimalna koncentracija etanola bila 50%.

Učinak temperature ekstrakcije na ekstrakciju PhG

Kako bi se procijenili učinci temperature ekstrakcije na prinos PhG-a, proučavane su različite temperature ekstrakcije (30-80 stupnjeva). Prinosi ehinakozida i akteozida pod različitim temperaturama prikazani su na slici 4. Može se uočiti da kada se temperatura ekstrakcije povećala s 30 na 70 stupnjeva, prinosi ehinakozida i akteozida su se povećali. Kada se temperatura povećala na 80 stupnjeva, prinosi ehinakozida i akteozida su se smanjili. To se pripisuje višoj temperaturi koja ubrzava razgradnju PhG-a. Stoga je optimalna temperatura ekstrakcije bila 70 stupnjeva.

Učinak brzine rotacije na ekstrakciju PhG-a

Slika 5 prikazuje učinke različitih brzina rotacije na prinose PhG-a. Prinosi ehinakozida i akteozida su se povećavali s povećanjem brzine rotacije. Povećanje brzine rotacije može povećati silu smicanja unutarnjeg i vanjskog rezača, čime se povećavaju prinosi PhG-a. Optimalna brzina vrtnje bila je 16000 okretaja u minuti.

Učinak vremena ekstrakcije na ekstrakciju PhG-a

Prinosi ehinakozida i akteozida u različitim vremenima ekstrakcije prikazani su na slici 6. Prinosi ehinakozida i akteozida bili su stabilni s povećanjem vremena ekstrakcije. Stoga se može zaključiti da se PhG-ovi mogu u potpunosti ekstrahirati iz C. tubulosa za 2 min, a optimalno vrijeme ekstrakcije bilo je 2 min.

Učinak omjera kruto-tekuće na ekstrakciju PhG-a

Kao što je prikazano na slici 7, raspravljalo se o prinosima ehinakozida i akteozida pod različitim omjerima krutine i tekućine. Prinosi ehinakozida i akteozida porasli su od 1:3 do 1:9 i postali stabilni od 1:9 do 1:24. Budući da mala količina ekstrakcijskog otapala ne može potpuno otopiti ehinakozid i akteozid, brzine prijenosa mase su smanjene. Pretjerana ekstrakcija otapala uzrokovala je nepotreban otpad. Stoga je optimalni omjer čvrste tvari i tekućine bio 1:9.

Učinak broja ciklusa ekstrakcije na ekstrakciju PhG

Slika 8 prikazuje učinke brojnih ciklusa ekstrakcije na prinose PhG-a. Prinosi ehinakozida i akteozida su se povećavali s povećanjem broja ciklusa ekstrakcije. Međutim, vrijeme ekstrakcije se značajno povećalo s povećanjem ciklusa ekstrakcije, a potrošeno je i više energije. Optimalan broj ciklusa ekstrakcije bio je jedan.

Usporedba HSHE metode s drugim ekstrakcijskim metodama za ekstrakciju PhG

Rezultati metode HSHE u usporedbi s drugim metodama ekstrakcije zaizdvajanje PhG iz C. tubulosanavedeni su u tablici 3. HSHE je jednostavniji i lakši od metoda spajanja kao što su dvofazna vodena ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom i metode tehnologije ultrazvučne mikrovalne ekstrakcije. Osim toga, tlak ekstrakcije HSHE niži je od metode ekstrakcije tekućinom pod tlakom, a radni uvjeti prve su sigurniji. Što je još važnije, iz tablice 3 može se vidjeti da HSHE pokazuje najkraće vrijeme ekstrakcije i najmanju potrošnju otapala među svim metodama ekstrakcije. Može se zaključiti da HSHE metoda ima mnoge prednosti kao što su visoka učinkovitost, blagi radni uvjeti, niske razine potrošnje, jednostavna oprema i jednostavan rad za ekstrakciju prirodnih proizvoda.

Zaključci

U ovoj studiji istražena je učinkovita i ekološki prihvatljiva HSHE metoda za ekstrakciju PhG iz C. tubulosa. U usporedbi s UAE i MAE metodama, nova HSHE metoda daje veći prinos PhG-a pod istim uvjetima. U usporedbi s metodom MAE, prinosi odehinakozid i akteozidporasli su za 20,5 odnosno 20,8%. U usporedbi s UAE, prinosi ehinakozida i akteozida povećani su za 6,6 odnosno 7,4%. Optimizirani su parametri ekstrakcije HSHE PhG iz C. tubulosa. Pod optimiziranim parametrima, prinosi ehinakozida i akteozida dosegnuli su 1,366 odnosno 0,519%, a brzine prijenosa ehinakozida i akteozida 87 odnosno 94%. HSHE metoda ima prednosti visoke učinkovitosti, blagih radnih uvjeta, niske razine potrošnje, jednostavne opreme, jednostavnog rada i niskih troškova. Ovo istraživanje pruža novu metodu za industrijsku ekstrakciju PhG iz C. tubulosa.

PRIRODNE BILJE CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%