Procjena antioksidansa, izbjeljivanja i svojstava protiv starenja hidrolizata rižinih proteina

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hui-Ju Chen 1,2, Fan-Jhen Dai 2, Cheng-You Chen 3, Siao-Ling Fan 2, Ji-Hong Zheng 4, Yu-Chun Huang 2, Chi-Fai Chau 1, Yung-Sheng Lin 3, 4,5,* i Chin-Shuh Chen 1,*

Sažetak:Proteinski hidrolizati biljnog podrijetla imaju potencijalnu primjenu u prehrani. Proteinski hidrolizati riže (RPH), izvrstan izvor proteina, privukli su pozornost za razvoj kozmeceutike. Međutim, malo je studija izvijestilo o potencijalnoj primjeni RPH u analizi, a ova studija ih je ispitalaantioksidansaktivnosti i inhibitorne aktivnosti enzima za uklanjanje kože. Rezultati su pokazali da su ukupne koncentracije fenola i flavonoida bile 2.06 ± 0.13 mg ekvivalenta galne kiseline/g RPH i 25.96 ± 0.52 µg ekvivalenta kvercetina/g RPH, odnosno. RPH su pokazali aktivnost ovisnu o dozi za uklanjanje slobodnih radikala iz 1,1-difenil-2-pikrilhidrazila [polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50)=42.58 ± 2,1 mg/g RPH] i 2 ,20-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (IC50=2.11 ± 0,88 mg/g RPH), kapacitet redukcije ovisan o dozi (6,95 ± 1,40 mg ekvivalenta vitamina C/g RPH) i kapacitet apsorpcije kisikovih radikala (473 µmol trolox ekvivalenta/g RPH). Koncentracije RPH otopine potrebne za postizanje 50-postotne inhibicije hijaluronidaze itirozinazaaktivnosti su određene na 8,91 odnosno 107,6 mg/mL. Ovo je istraživanje pokazalo da RPH imajuantioksidansaktivnosti antihialuronidaze i antitirozinaze za buduće kozmetičke primjene.

Ključne riječi:hidrolizat proteina riže;antioksidans; hijaluronidaza;tirozinaza; kozmetički

cistancheizbjeljivanjeposljedicana koži doantioksidacija

1. Uvod

Izlaganje ultraljubičastom zračenju odgovorno je za fotostarenje (ili ekstrinzično starenje); Nasuprot tome, reaktivne vrste kisika proizvedene u metabolizmu stanica i pogoršanje bioloških funkcija odgovorne su za intrinzično starenje [1,2]. Prerađena hrana često sadrži prirodneantioksidansikao što su katehini, askorbinska kiselina, tokoferoli, ružmarinska kiselina i fenolni ekstrakti iz raznih biljaka. Istraživanje provedeno na prirodnim antioksidansima sada razmatra netradicionalno podrijetlo. Prirodnog porijeklaantioksidansisu poželjniji od kemijski proizvedenihantioksidansibudući da je za neke sintetske antioksidanse prijavljeno da su kancerogeni [3]. Riža (Oryza sativa) glavna je namirnica za ljude diljem svijeta, osobito one koji žive u Aziji. Godišnja svjetska proizvodnja riže iznosi približno 741 milijun tona [4]. U azijskim zemljama riža je navodno izvor 75 posto energetskog unosa za preko 2 milijarde ljudi [5]. Ekstenzivna proizvodnja riže rezultira odgovarajućom količinom proizvodnje nusproizvoda. Preostali proizvod iz procesa proizvodnje riže sadrži većinu proteina zrna (~60-85 posto), ali se baca ili koristi za ishranu životinja [6-8]. Peptidi dobiveni iz raznih proteinskih hidrolizata navodno djeluju kao potencijalniantioksidansi[9]. Prirodni i netoksični antioksidansi stoga se potencijalno mogu ekstrahirati iz hidrolizata proteina hrane. Brojni su znanstvenici upotrijebili modele bogate lipidima i objavili hidrolizate proteina, kao i peptide proteina mlijeka, zeina i soje koji imaju ključne antioksidativne karakteristike, uključujući hvatanje slobodnih radikala, inhibiciju peroksidacije lipida hranom i in vitro te kelaciju prijelaznih metala [10– 12].

Hijaluronska kiselina (HA) pomaže u pomlađivanju kože jer povećava viskoznost, zadržava vlagu i čini izvanstanične tekućine manje propusnima. Zbog svog izvrsnog kapaciteta zadržavanja vode, HA povećava mladolikost, hidrataciju i glatkoću kože te smanjuje stupanj bora [13,14]. Nažalost, razina HA u koži prirodno opada s godinama. Hijaluronidaza je enzim koji uništava HA, uzrokujući gubitak snage, fleksibilnosti i vlažnosti kože, što zauzvrat dovodi do starenja kože. Stoga se bore mogu liječiti inhibicijom hijaluronidaze i održavanjem sadržaja HA u koži [15,16]. Enzim koji proizvodi melanintirozinazavitalno pridonosi koraku koji ograničava brzinu procesa kroz koji se proizvodi melanin. Stoga se poremećaji pigmentacije obično liječe, a posvjetljivanje kože postiže se inhibiranjem ili smanjivanjemtirozinazaaktivnost [17,18].

U nekoliko je studija otkriveno da hidrolizati proteina žitarica i peptidi koji se mogu dobiti iz njih imaju antioksidativno, antihipertenzivno i antitumorsko djelovanje [19,20]. Pozitivni doprinosi ljudskom zdravlju peptida i proteina koji potječu iz hrane postupno se prepoznaju [21]. Potrošači sve više zahtijevaju da kozmetička i zdravstvena industrija koriste prirodne bioaktivne spojeve. Proteinhidrolizati riže (RPH) privukli su pozornost kao izvrstan izvor proteina. Međutim, nekoliko je studija izvijestilo o karakterizaciji i funkcionalnoj analizi RPH. Stoga je ovo istraživanje procijenilo antioksidativno djelovanje i hijaluronidazutirozinaza-inhibitorne aktivnosti RPH.

2. Rezultati i rasprava

2.1. Ukupna koncentracija fenola (TPC) i ukupni sadržaj flavonoida (TFC)

Standard u TPC testu bila je galna kiselina nekoliko koncentracija. Veća apsorpcija ukazuje na viši TPC. TPC RPH uzoraka dobiven je unošenjem vrijednosti optičke apsorbancije RPH uzoraka u kalibracijsku krivulju galne kiseline. Grafičkim prikazom koncentracije RPH u odnosu na koncentraciju fenola (Slika 1a), dobiveno je prosječno TPC od 2.06 ± 0.13 mg GAE/g RPH. TFC od 25,96 ± 0,52 µg QE/gRPHs dobiven je slijedeći sličan postupak (Slika 1b). Slika 1c nadalje prikazuje TPC i TFC uzoraka RPH. Otkriva da se odnos između TPC-a i TFC-a može izraziti kao y=0.0121x plus 0,0659, gdje su x i y TPC odnosno TFC.

TPC RPH uključuje koncentracije fenolnih aminokiselina i fenolnih spojeva peptida. Interakcija protein-fenolni spoj općenito uključuje kovalentnu i nekovalentnu vezu. Fenolni spojevi oslobađaju se tijekom enzimske hidrolize. Specifični enzimi mogu biti najsposobniji za uništavanje kompleksa protein-polifenol; to rezultira oslobađanjem većeg broja fenolnih spojeva i peptida s fenolnim skupinama, kao što je tirozin [22]. Zabilježena je jaka korelacija između ukupnog sadržaja polifenola u žitaricama i njihove biološke aktivnosti. Dobro je poznato da polifenoli imaju snažno antioksidativno djelovanje [23]. Iako se nalaze u manjim količinama, terpeni [24] ili seskviterpeni [25] u riži također mogu pridonijeti antioksidativnom djelovanju.

2.2. Djelovanje antioksidansa

2.2.1. Aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH

Slika 2 prikazuje aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH u RPH otopini. Otkriveno je da veća koncentracija otopine rezultira većom aktivnošću. Polumaksimalna inhibitorna koncentracija (IC50), koja je koncentracija ekstrakta za koju se može ukloniti polovica svih slobodnih radikala DPPH, bila je 42,58 ± 2,1 mg/mL rižinih peptida.

2.2.2. Aktivnost hvatanja slobodnih radikala ABTS

RPH-ova ABTS aktivnost hvatanja slobodnih radikala, prikazana na slici 3, bila je veća kada je korištena veća koncentracija ekstrakta. IC50 bio je 2,11 ± 0,88 mg/mL rižinih peptida. Ovaj rezultat je pokazao da RPH imaju jaku ABTS aktivnost hvatanja slobodnih radikala. Aminokiseline koje sadrže sumpor, uključujući Met i Cys, i hidrofobne aminokiseline, uključujući Ala, Val, Ile, Leu, Met, Cys, Tyr, Phe, Try i Pro, mogu biti važni čimbenici s obzirom na ABTS slobodne radikale čistačka aktivnost.

U ovoj studiji, IC50 vrijednost aktivnosti hvatanja slobodnih radikala ABTS bila je niža od aktivnosti hvatanja slobodnih radikala DPPH, slažući se s rezultatima ljuske i jezgre sjemena Jatropha curcas L. [28] i sjemenki i ljuske pulpe ploda žižule [29]. Ovaj nalaz također odgovara izvješću o hidrolizatima proteina rižinih mekinja s 43,98–66,25 µmol trolox ekvivalenta/g uzorka i 403,28–430,12 µmol trolox ekvivalenta/g uzorka za aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i aktivnost hvatanja slobodnih radikala ABTS [27].

Jedan od mogućih razloga je razlika u topljivosti između slobodnih radikala DPPH (topivih u ulju) i slobodnih radikala ABTS (topivih u ulju/vodi) [30,31]. Na antioksidativni potencijal hidrolizata proteina rižinih mekinja utjecao je njegov profil molekularne težine, sastav aminokiselina i hidrofobnost [32].

2.2.3. Kapacitet redukcije

Nalazi analize kapaciteta redukcije za RPH prikazani su na slici 4. Kapacitet redukcije se povećavao s koncentracijom RPH. Kapacitet redukcije bio je 6,95 ± 1,40 mg VCE/g RPH, što ukazuje da su RPH učinkoviti antioksidansi.

2.2.4. Kapacitet apsorpcije radikala kisika (ORAC)

ORAC test ima prednosti u odnosu na druge pristupe određivanju antioksidativne aktivnosti, uključujući korištene reaktante koji su peroksi radikali sa sličnim mehanizmom reakcije i redoks potencijalom kao fiziološki oksidansi; ukupni naboj i protonacijsko stanje s kojim seantioksidansireagiraju nalik onima u ljudskom tijelu [33]. ORACmetoda također ima biološku važnost za učinkovitost antioksidansa u ljudskom tijelu. Slika 5 prikazuje rezultate ORAC analize RPH i Trolox standarda u različitim koncentracijama. ORAC je izveden iz regresijske jednadžbe kalibracijske krivulje koja povezuje neto AUC s koncentracijom Troloxa. Rezultati su pokazali da je RPH imao ORAC od 473 µmol TE/g RPH.

Antioksidativni peptidi ili aminokiseline mogu se dobiti enzimatskom hidrolizom proteina, što rezultira visokom aktivnošću protiv oksidansa [34]. Helacija metalnih iona, inhibicija peroksidacije lipida i uklanjanje slobodnih radikala biološki aktivnih peptida odgovorni su za njihovo antioksidativno djelovanje. Slobodni radikali mogu se ugasiti, a ekspresija proteina i enzima koji smanjuju oksidativni stres mogu se regulirati antioksidativnim peptidima. Antioksidacijska učinkovitost proteinskih hidrolizata i peptida navodno ovisi o slijedu aminokiselina i veličini peptida, na što utječu uvjeti hidrolize, izvor proteina i vrsta proteaze [35]. Prema Adebiyiju i sur. [36], najveći probavljivi protein rižinih mekinja može se razbiti u manje komade subtilizinom, što rezultira većim prinosom i sadržajem proteina. Na TPC i antioksidacijsku aktivnost hidrolizata može utjecati specifičnost enzima. Stoga, na antioksidacijsku aktivnost peptida mogu utjecati karakteristike izvora proteina, specifičnost enzima i razina hidrolize [37].

Postoje mnoga izvješća o korištenju proteaza (kao što je alkalaza, komercijalni naziv asubtilizina A iz vrste Bacillus) za hidrolizu proteina biljnog podrijetla kako bi se dobili antioksidativni peptidi. S tim u vezi, protein soje jedan je od proteina o kojem se najviše govori [38]. Nadalje, također je pronađena alkalazna hidroliza proteina rižinih mekinja. Pod optimalnim uvjetima, alkalaza hidroliza ljepljivih rižinih mekinja proizvela je proteinske hidrolizate s IC50 vrijednošću od 0.87 ± 0,02 mg/mL u hvatanju slobodnih radikala DPPH [39]. U našem istraživanju vrijednost IC50 za RPH bila je 42,58 ± 2,1 mg/mL. Iako vrijednost IC50 u DPPH hvatanju slobodnih radikala u ovoj studiji nije bila tako učinkovita kao ona iz proteina rižinih mekinja, ABTS hvatanje slobodnih radikala (IC50=2.11 mg/mL) bilo je učinkovitije od hidrolizata proteina soje dobivenih alkalasehidrolizom ( IC50=2.93 mg/mL) [40].

2.3. Inhibitorna aktivnost hijaluronidaze

Proteolitički enzim, hijaluronidaza, nalazi se u dermisu i katalizira razgradnju HA u izvanstaničnom matriksu [41]. Ova je studija koristila taninsku kiselinu kao pozitivnu kontrolu u svrhu usporedbe. Slika 6 otkriva da je taninska kiselina imala veću inhibiciju aktivnosti hijaluronidaze; IC50 bio je 0.14 mg/mL, slično vrijednosti koju su dobili Nishida et al. (0,121 mg/mL; 71,1 mM) [42]. Nasuprot tome, IC50 od 8,91 mg/mL je izračunat za RPH otopinu. Ovaj rezultat RPH otopine odgovarao je našoj prethodnoj vrijednosti IC50, 7,61 mg/mL [43]. Proteini, polisaharidi te spojevi biljnog podrijetla i sintetski spojevi su među spojevima u kojima su prisutni inhibitori hijaluronidaze. Ovi inhibitori pomažu u održavanju ravnoteže između sinteze i razgradnje HA [44]. Niska koncentracija HA u koži rezultira suhoćom i borama. Stoga je inhibicija aktivnosti hijaluronidaze put kojim se može poboljšati morfologija kože i odgoditi njezino starenje.

2.4. Inhibitorna aktivnost tirozinaze

Proteinski hidrolizati iz prirodnih izvora imaju potencijal inhibicijeaktivnost tirozinaze. In vitro test inhibicije tirozinaze obično se koristi za procjenu kako sredstva za izbjeljivanje kože izravno utječu na aktivnost tirozinaze [45]. Sudjelujući u koraku koji ograničava brzinu sinteze melanina, tirozinaza katalizira hidroksilaciju L-tirozina u L-DOPA, a zatim oksidaciju potonjeg u o-dopakinon. Kada je poželjno spriječiti biosintezu melanina, inhibicija aktivnosti L-tirozinaze može biti ključna. Ovdje,tirozinazakorišten je za mjerenje aktivnosti RPH antitirozinaze. Kao što je prikazano na slici 7, koncentracija107,6 mg/mL postigla je 50-postotnu inhibiciju aktivnosti tirozinaze. Askorbinska kiselina je pokazala visoku inhibitornu aktivnost tirozinaze (IC50=0.098 mg/mL), što je bilo slično 0,102 mg/mL koliko je Seo et al. izvijestio [46].

Proteinski hidrolizati rižinih mekinja pokazali su se značajno visokimtirozinaza-inhibicijska aktivnost [47,48]. Inhibicijska aktivnost RPH otopine na tirozinazu može proizaći iz profila aminokiselina peptida. Schurink i sur. opisao taj učinkovittirozinaza-inhibitorni peptidi sastoje se od ostataka arginina i fenilalanina [49]. Inhibitorna aktivnost tirozinaze može se poboljšati hidrofobnim aminokiselinskim ostacima (npr. alaninom), a proizvodnja melanina može biti poremećena alaninom [50]. Osim toga, Zhang i sur. također je izvijestio da hidrolizat proteina riže može smanjiti sadržaj melanina i aktivnost tirozinaze u staničnom modelu izazvanom UVB [51].

cistanche bodybuilding

2.5. Profili aminokiselina i MW RPH

Sadržaj proteina u riži nakon uklanjanja škroba u ovoj studiji iznosio je 23,56 težinskih postotaka, a stupanj hidrolize uzorka hidroliziranog proteazom bio je 9,36 posto. Tablica 1 detaljno prikazuje sastav aminokiselina u RPH. U uzorku je svakih 100 g sadržavalo 5,18 g aminokiselina. Što se tiče komponenti aminokiselina, RPH su bili bogati alaninom, leucinom, argininom, glutaminskom kiselinom i asparaginskom kiselinom. Svakih 100 g uzorka sadržavalo je ukupno 1,73 g hidrofobnih aminokiselina (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin i cistein). Ovaj rezultat bio je potpuno drugačiji od našeg prethodnog izvješća [43] u otopini amilaze i temperaturi njezine obrade za uklanjanje škroba. Sadržaj hidrofobnih aminokiselina bio je 1,90 puta veći od našeg prethodnog izvješća. Niža temperatura obrade (60 ◦C) u ovoj studiji može spriječiti denaturaciju proteina u velikim količinama, tako da se aktivnost aminokiselina može bolje očuvati. Osim toga, sličan zaključak je također dobiven iz druge gljivične amilaze i glukoamilaze za saharificiranje škroba u bijelim rižinim mekinjama [52].

Istraživanja su pokazala da hidrofobne aminokiseline sličeantioksidansipovećanjem topljivosti temeljene na lipidima u hidrolizatima proteina i peptidima iz različitih izvora proteina, čime se potiče interakcija sa slobodnim radikalima [38,53]. Neke aminokiseline objavili su Chen i sur. [54] općenito bitiantioksidansi; spomenute kiseline uključivale su triptofan, cistein, metionin, tirozin i histidin. U ovoj studiji, aromatske aminokiseline (fenilalanin, tirozin i triptofan) sadržavale su 0.53 g/100 g RPH. Stoga su ove aminokiseline koje potiču iz peptida vjerojatno odgovorne za antioksidacijsku aktivnost RPH.

Osim toga, proteini koji su hidrolizirani u kraće peptide imaju drugačiju raspodjelu MM, a neke hidrofobne skupine složene u unutrašnjosti cjelovitih prirodnih proteinskih molekula obično su izložene vodenoj fazi. To je povezano s proteinskim molekulama koje su strukturno preuređene, a time i s funkcionalnim svojstvima proteina [55,56]. Podaci tricine-SDS-PAGE pokazuju da je MW RPH u rasponu 5–35 kDa (Slika 8a).

Slika 8b prikazuje relativni sadržaj različitih MW u RPH. Sveukupno, 45,24 posto svih proteina bilo je u glavnoj vrpci (MW ≈ 2,4 kDa). Slični rezultati dobiveni su u vezi s peptidom hidrolizata proteina rižinih mekinja. Najveća antioksidativna aktivnost koju su postigli Thamnarathip i sur. [37] bila je ona za peptide MM=6–50 kDa. Osim toga, postoji povezanost između funkcije proteinskih hidrolizata i distribucije molekulske mase i sastava aminokiselina [57]. Ovo objašnjava antioksidacijsku aktivnost RPH promatranu u ovoj studiji.

2.6. Test toksičnosti stanica

Za buduće primjene potrebna je niska toksičnost stanica. Kako bi se procijenila citotoksičnost i biokompatibilnost RPH, stanična vitalnost sirovih 264.7 stanica u otopini RPH mjerena je MTT metodom. Kao što je prikazano na slici 9, vitalnost stanica bila je iznad 100 posto kada su tretirane s 25-2000 µg/mL RPH tijekom 24 h i 48 h. Rezultati pokazuju izrazito nisku citotoksičnost RPH. Stoga se RPH mogu potencijalno koristiti kao kozmetičke aplikacije s vrlo niskom citotoksičnošću.

3. Materijali i metode

3.1. Reagensi

Željezo(III) klorid, 2,20-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS), Trolox(6-hidroksi-2,5 ,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina), l-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH) i trikloroctena kiselina nabavljeni su od Alfa Aesara (Tewksbury, MA, SAD). 2,20-azobis(2-metilpropionamidin) dihidroklorid (AAPH), Folin–Ciocalteuov fenol reagens, galna kiselina, askorbinska kiselina, gljivatirozinaza, i fluorescein natrij nabavljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Natrijev karbonat je dobiven od Riedel-de Haën (Seelze, Njemačka). Konačno, kalijev fericijanid, natrijev hidrogenfosfat i natrijev dihidrogenfosfat dobiveni su od Showa Chemical (Tokio, Japan).

3.2. Priprema RPH-ova

RPH su pripremljeni kao što je prethodno opisano, osim što je gljivična amilaza usvojena za saharificiranje škroba u rižinom brašnu, izbjegavajući oštećenje aminokiselina uzrokovano hidrolizom bakterijske amilaze na visokim temperaturama [43,58]. Stotinu grama rižinog brašna namočeno je u 1000 mL destilirane vode koja sadrži 0,5 posto gljivične amilaze (Genencor, NY, SAD); smjesa je zatim zagrijavana 24 h do 60 ◦C ( pH 4,2), nakon čega je ostavljeno da se ohladi na sobnu temperaturu. Centrifugiranje je obavljeno 10 minuta na 1968 x g kako bi se uklonio preostali supernatant. Nakon 20-dodavanja vode i 2 mL 0,1 posto hidrolitičke proteaze (Healthmate, Changhua, Tajvan) netopljivom dijelu, otopina je protresena i inkubirana 4 sata na 55 ◦C. Za održavanje pH otopine na optimalnoj razini korištena je pH-stat metoda, a zatim je provedeno zagrijavanje na 85 ◦C tijekom 10 minuta za inaktivaciju enzima. Preostala netopljiva frakcija je uklonjena centrifugiranjem tijekom 15 minuta na 3075 x g. Liofilizacija je provedena na supernatantu, koji je zatim pohranjen na -20 ◦C prije upotrebe.

3.3. Antioksidativna aktivnost RPH

3.3.1. Ukupna koncentracija fenola (TPC)

Korištena je Folin–Ciocalteuova metoda za otkrivanje TPC RPH [59]. Prvo je 200 µL Folin–Ciocalteuovog fenolnog reagensa (0,3 M) jednolično pomiješano kroz 5-min mućkanja s 200 µL RPH otopine, a ovoj smjesi je dodano 400 µL deionizirane (DI) vode i 200 µL 10 posto (w/v) otopine natrijevog karbonata. Miješana otopina je podvrgnuta 60 minuta inkubacije u tami na sobnoj temperaturi. Zatim je centrifugirana 15 minuta na 3000 okretaja u minuti. Za mjerenje je korišteno 100 µL supernatanta. Za određivanje TPC (jedinica: mg) ekvivalenta galne kiseline (GAE) po gramu suhog uzorka RPH (jedinica: mg GAE/g RPH), podaci o optičkoj apsorbanciji uneseni su u standardnu ​​krivulju koja predstavlja galnu kiselinu. Apsorbancija je dobivena na 700 nm korištenjem EpochMicroplate spektrofotometra (BioTek, VT, SAD).

3.3.2. Ukupni sadržaj flavonoida (TFC)

TFC je dobiven prema pristupu Wathonija i sur. s manjim izmjenama [60]. Prvo je pomiješano 500 µL svakog uzorka i 2 posto (w/v) otopine aluminijevog klorida. Reakcijska otopina je temeljito promiješana i ostavljena 10 minuta, te je procijenjena apsorbancija na 415 nm. Rezultat se izražava u mikrogramima ekvivalenta kvercetina (QE) po gramu suhog RPH uzorka (µg QE/g RPH).

cistanche bodybuilding

3.3.3. DPPH aktivnost hvatanja slobodnih radikala

Prvo su pomiješane 198 µM DPPH otopina etanola (50 µL) i RPH otopina ili DI voda (0,5 µL; uzorak i kontrola) i zatim ostavljene stajati 30 minuta u tami na sobnoj temperaturi. Nakon toga je dobivena apsorbancija otopine na 517 nm. Relativna aktivnost čišćenja izračunata je određivanjem razlike u apsorbanciji između uzorka i kontrole. Visoka aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH odražava se niskom optičkom apsorbancijom. U procjeni DPPH aktivnosti hvatanja slobodnih radikala RPH otopine korišteni standard bio je vitamin C [61-63].

3.3.4. Aktivnost hvatanja slobodnih radikala ABTS

Pristup koji su objavili Wu et al. korišten je za procjenu antioksidativne aktivnosti RPH otopine [64]. Prvo je 7 mM matične otopine ABTS (250 µL) reagiralo s 2,45 mM kalijevog persulfata (250 µL) kako bi se dobio ABTS kation slobodnih radikala (ABTS• plus ), uz zadržavanje smjese 16 h na 4 ◦C u mraku prije nego što je korišten. Nakon ekvilibracije u tami na sobnoj temperaturi, 0.1 M fiziološka otopina puferirana fosfatom (PBS; pH 7,4) korištena je za razrjeđivanje otopine do 0,70 ± 0,02 apsorbancije na 734 nm. Zatim je u 180 µL razrijeđene ABTS otopine dodano 20 µL Troloxa (pozitivna kontrola) ili RPH otopine (uzorak). Smjesa je zatim podvrgnuta 10 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi. Ova studija je odredila optičku apsorbanciju na 734 nm; niža apsorbancija odgovarala je većoj ABTS aktivnosti hvatanja slobodnih radikala. Standard korišten za procjenu aktivnosti hvatanja slobodnih radikala RPHsolution ABTS bio je antioksidans Trolox.

3.3.5. Kapacitet redukcije

Test antioksidativne snage redukcije željeza korišten je za određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti RPH otopine. Kao što su izvijestili Lin i sur. [29], RPH otopina (200 µL) jednolično je pomiješana s 1 posto (w/v) K3Fe(CN)6 i 0,2 M PBS pufera (pH 6,6; 100 µL svaki) Tijekom 20 minuta korištena je vodena kupelj na 50 ◦C za zagrijavanje smjese; nakon uklanjanja smjese iz kupke, brzo je ohlađena 3 minute. Zatim je izvršeno dodavanje 10 posto (w/v) trikloroctene kiseline (100 µL) i 10-min centrifugiranje na 3000 okretaja u minuti. Nakon toga je uslijedila ekstrakcija supernatanta (400 µL) i njegovo ravnomjerno miješanje s 0. 1 posto (w/v) FeCl3 (100 µL) i DI vode (400 µL). Fe4[Fe(CN)6]3 dobiven je 10-minutnom reakcijom ove smjese u mraku. Nakon toga, veća optička apsorbancija (mjerena na 700 nm) ukazuje na veći kapacitet redukcije. Standardni vitamin C korišten je za određivanje sadržaja ekvivalenta vitamina C (VCE) po gramu RPH.

3.3.6. Kapacitet apsorpcije radikala kisika (ORAC)

Ova je studija dobila ORAC modificiranjem prethodno objavljene metode [65]. Nakon otapanja RPH uzorka u destiliranoj vodi, RPH otopina (50 µL) je pomiješana s fluoresceinom (10 µM) u mikrotitarskoj ploči 96-jažica. Otopina je podvrgnuta 15- min inkubacije na 37 ◦C nakon čega je uslijedilo dodavanje 50 µL AAPH (500 mM). Svakih 5 minuta i tijekom ukupno 120 minuta, bilježena je fluorescencija (λex i λem=485 odnosno 528 nm). Antioksidativni kapacitet RPH otkriven je iz kinetike opadanja fluorescencije izračunavanjem površine ispod krivulje (AUC ). U izračunavanju RPH ORAC, standard je bio 15-250 µM Trolox. ORAC se prijavljuje kao mikromoli Trolox ekvivalenta (TE) po gramu suhog RPH uzorka (µmol TE/g RPH).

3.4. Inhibitorna aktivnost hijaluronidaze

Test inhibicije hijaluronidaze proveden je korištenjem {{0}}mikroploče s jažicama i prethodno objavljene metode s malim modifikacijama [40]. N-acetilglukozamin je oslobođen reakcijom hijaluronidaze sa supstratom HA. U prisutnosti bilo kojeg inhibitora, otpuštanje N-acetilglukozamina je smanjeno, pri čemu se to otpuštanje detektira dobivanjem apsorbancije 600-nm. HA je istaložen s kiselom otopinom albumina koja se sastoji od 0.1 M acetatnog pufera (pH 3,9) i goveđeg serumskog albumina (1 mg/mL). Otopina uzorka i 5 mg/mL hijaluronidaze podvrgnuti su 20- min inkubacije na 37 ◦C. Inkubacijskoj smjesi je naknadno dodana HA (1{{20}}0 µL; 5,0 mg/mL u 0,1 M acetatnom puferu). Provedena je daljnja inkubacija na 37 ◦C tijekom 40 minuta. Dodano je 0,1 mL 0,4 M otopine alkalnog borata da se zaustavi enzimska reakcija.

3.5. Inhibitorna aktivnost tirozinaze

Ova studija procijenila je antitirozinaznu aktivnost RPH-a korištenjem prethodno objavljenog protokola s modifikacijama [66]. Otopina enzima (135 U/mL) pripravljena je otapanjem tirozinaze u 20 mM fosfatnom puferu (pH 6,8). Dodatno, DI voda je korištena za pripremu otopine 1,25 mM L-DOPA. Zatim je 40 µL različitih koncentracija RPH otopina uzorka pomiješano s 40 µL otopine tirozinaze i 120 µL otopine L-DOPA. Tijekom 30 minuta, ova smjesa je držana na 37 ◦C u testu RPH inhibicijetirozinazaaktivnost. Za dobivanje apsorbancije 475-nm korišten je spektrofotometar (FLUOstar Omega MicroplateReader, BMG Labtech GmbH, Njemačka). Sva su mjerenja izvedena tri puta. Apsorpcija odgovarajuće skupine kadatirozinazanije bilo oduzeto je. Stopa inhibicije enzima određena je kao

3.6. Karakterizacija RPH

3.6.1. Profili aminokiselina

Ovo je istraživanje otkrilo aminokiselinski sastav RPH. Prvo je 24 sata i na 115 ◦C korištena 4 M metansulfonska kiselina za hidrolizu uzoraka u evakuirano zatvorenim epruvetama. Dva Waters 510 sustava za isporuku otapala i analizator aminokiselina (L 8900; Hitachi, Tokio, Japan) korišteni su za derivatiziranu separaciju aminokiselina na aSpherisorb ODS2 koloni od 25 m × 64,6 mm. Ova studija je koristila sljedeća otapala: (a) natrijev acetat (0,14 M) i trietilamin (850 µL/L; pH 5,6) i (b) 60 postotni acetonitril, za koji je gradijent bio 0 posto tijekom 2 minute; 0–42 posto tijekom 15,5 minuta (konveksna krivulja); i 100 posto tijekom 4 minute. Dvostruki uzorci uzeti su za mjerenje profila aminokiselina na 254 nm [67,68].

3.6.2. Molekularna težina (MW) proteina

U skladu sa Schäggerovom metodom [69] i pod redukcijskim uvjetima, ovom studijom dobivena je distribucija MW elektroforezom tricin–natrijev dodecil sulfat (SDS)–poliakrilamidegel (PAGE) uz male modifikacije. Pufer za uzorak (30 g/L SDS, 0.375 MTris-HCl, 0.125 g/L Coomassie Brilliant Blue G-250 i 75 g/ L glicerol; pH 7) korišten je za disperziju zamrzavanjem osušenog uzorka, uz centrifugiranje koje je zatim izvedeno prije punjenja. Ukupno 20 µL 2-merkaptoetanola dodano je u 1 mL tricin-SDS-PAGE uzorka. Uzorak je zagrijavan na 100 ◦C 90 s. Jažica s uzorkom napunjena je sa svakim uzorkom i neobojenim proteinskim standardom širokog raspona (Bio-Rad Laboratories, Njemačka) pomoću mikroštrcaljke. Zatim je provedena elektroforeza — prvo na konstantnih 30 mV dok se cijeli uzorak ne nađe unutar gela za slaganje, a zatim do završetka na konstantnih 100 mV. Nakon toga, 0,02 postotna otopina Coomassie Brilliant Blue R-250 primijenjena je za bojenje gela. Apsolutno pozadinsko odbojavanje gelova provedeno je mućkanjem gelova u 10 postotnoj octenoj kiselini preko noći. Konačno, slika gela je analizirana da se identificiraju proteinske trake u stazama; ova analiza je provedena u ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Standardni markeri korišteni su za dobivanje kalibracijske krivulje iz koje je procijenjena MW. Ukratko, prvi korak bio je odrediti duljinu migracije (Rf) svake trake od vrha gela za razdvajanje. Ovaj drugi korak bio je izračun kalibracijske krivulje korištenjem Rf i log (MW) za standardni marker s danom MW. Određivanje MW provedeno je korištenjem Rf proteinskih vrpci u RPH.

3.7. Ispitivanje citotoksičnosti

Neobrađene 264.7 stanice uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (DMEM) s visokim sadržajem glukoze koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 4,5 g/L glukoze, 1 posto otopine antibiotika (100 jedinica/ mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina), 4 mM L-glutamina i 1,5 g/L natrijevog bikarbonata na 37 ◦C i 5 posto CO2. Stanična toksičnost sirovih 264.7 stanica za RPHs mjerena je metodom ispitivanja proliferacije 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil-tetrazolij bromida (MTT) . Otprilike 1 × 104 stanica po jažici stavljeno je u 96-ploče s jažicama. Nakon 24 sata, različite koncentracije RPH (0-2000 µg/mL) dodane su u stanice. Nakon 24 i 48 h inkubacije, dodano je 100 uL MTT otopine (0,5 mg/mL). Provjeravanjem pod mikroskopom uočeni su plavi kristali formazana. DMEM je uklonjen i po jažici je dodano 100 uL dimetil sulfoksida (DMSO). Apsorbancija je mjerena pomoću čitača mikrotitarskih ploča. Vijabilnost stanica (postotak) tada je izračunata kao [A570 (tretirane stanice) − A570 (pozadina)] / [A570 (netretirane stanice) − A570 (pozadina)] × 100 posto [70].

3.8. Statistička analiza

Izvješće za svaki uzorak hidrolizata bila je prosječna vrijednost iz tri neovisna ponovljena pokusa i određivanja. Rezultati izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) analizirani su jednosmjernom ANOVA i Duncanovim post hoc testom korištenjem StatisticalAnalysis System (verzija 20.0; SPSS, Armonk, NY, SAD). Vrijednosti p < 0,05="" smatrane="" su="" statističkom="">

4. Zaključci

Ova studija ispitivala je funkcije RPH-a. Eksperimentalni rezultati otkrili su da RPH sadrže fenolne spojeve i flavonoide i pokazuju niz antioksidativnih aktivnosti, kao što su aktivnosti čišćenja DPPH i ABTS, sposobnost redukcije i ORAC. Osim toga, RPH su učinkovito inhibiranitirozinazai aktivnosti hijaluronidaze. Proteaza je bila kritični čimbenik koji je utjecao na uzorke MW RPH. Analiza RPH-a ukazuje na njihov potencijal za korištenje kao sastojka u kozmetici.

cistanche bodybuilding

Reference

1. Ichihashi, M.; Ando, ​​H.; Yoshida, M.; Niki, Y.; Matsui, M. Fotostarenje kože. Anti-Aging Med. 2009, 6, 46–59. [CrossRef]

2. Kim, J.-S.; Kim, D.; Kim, H.-J.; Jang, A. Zaštitni učinak hidrolizata želatine magareće kože na fotostarenje fibroblasta ljudske kože izazvano UVB zračenjem. Postupak. Biochem. 2018, 67, 118–126. [CrossRef]

3. Carocho, M.; Ferreira, IC Pregled antioksidansa, prooksidansa i srodnih kontroverzi: prirodni i sintetski spojevi, metodologije pregleda i analize i buduće perspektive. Food Chem. Toxicol. 2013, 51, 15–25. [CrossRef]

4. Guo, X.; Zhang, J.; Ma, Y.; Tian, ​​S. Optimizacija ograničene hidrolize proteina u ostatku riže i karakterizacija funkcionalnih svojstava proizvoda. J. Food Proc. Očuvati. 2013, 37, 245–253. [CrossRef]

5. Park, H.-Y.; Lee, K.-W.; Choi, H.-D. Sastojci rižinih mekinja: Imunomodulirajuće i terapeutsko djelovanje. Funkcija hrane. 2017, 8,935–943. [CrossRef] [PubMed]

6. Zhou, K.; Canning, C.; Sun, S. Učinci hidrolizata proteina riže pripremljenih mikrobnim proteazama i ultrafiltracijom na slobodne radikale i oksidaciju lipida mesa. LWT 2013, 50, 331–335. [CrossRef]

7. Piu', LD; Tassoni, A.; Serrazanetti, DI; Ferri, M.; Babini, E.; Tagliazucchi, D.; Gianotti, A. Iskorištavanje tekućeg nusproizvoda industrije škroba za proizvodnju bioaktivnih peptida iz hidroliziranih proteina riže. Food Chem. 2014, 155, 199–206. [CrossRef]

9. Ferri, M.; Graen-Heedfeld, J.; Bretz, K.; Guillon, F.; Michelini, E.; Calabretta, MM; Lamborghini, M.; Gruarin, N.; Roda, A.; Kraft, A.; et al. Peptidne frakcije dobivene iz nusproizvoda riže postupkom koji nije prihvatljiv za okoliš pokazuju in vitro bioaktivnost u vezi sa zdravljem. PLOS ONE 2017, 12, e0170954. [CrossRef]

9. Wen, C.; Zhang, J.; Zhang, H.; Duan, Y.; Ma, H. Antioksidativni peptidi dobiveni iz biljnih proteina: Izolacija, identifikacija, mehanizam djelovanja i primjena u prehrambenim sustavima: Pregled. Trends Food Sci. Technol. 2020., 105, 308–322. [CrossRef]

10. Phelan, M.; Aherne, A.; FitzGerald, RJ; O'Brien, NM Bioaktivni peptidi dobiveni iz kazeina: Biološki učinci, industrijska upotreba, sigurnosni aspekti i regulatorni status. Int. Mljekar J. 2009, 19, 643–654. [CrossRef]

11. Udenigwe, CC; Aluko, RE Bioaktivni peptidi dobiveni iz proteina hrane: proizvodnja, obrada i potencijalne zdravstvene koristi. J.Food Sci. 2012, 77, 11–24. [CrossRef] [PubMed]

12. Fardet, A.; Rock, E. In vitro i in vivo antioksidativni potencijal mlijeka, jogurta, fermentiranog mlijeka i sireva: narativni pregled dokaza. Nutr. Res. Rev. 2018, 31, 52–70. [CrossRef]

13. Leach, JB; Kathryn, AB; Charles, WPJ; Christine, ES Fotoumreženi hidrogelovi hijaluronske kiseline: prirodne, biorazgradive skele inženjeringa tkiva. biotehnologija. bioinž. 2003, 82, 578–589. [CrossRef]

14. Jegasothy, SM; Zabolotniaia, V.; Bielfeldt, S. Učinkovitost nove topikalne nano-hijaluronske kiseline kod ljudi. J. Clin. Aesthet.Dermatol. 2014, 7, 27–29.

15. Ndlovu, G.; Fouche, G.; Tselanyane, M.; Cordier, W.; Steenkamp, ​​V. In vitro određivanje potencijala protiv starenja četirijužnoafričkih ljekovitih biljaka. BMC komplement. Alternativa. Med. 2013, 13, 304. [CrossRef]

16. Jiratchayamaethasakul, C.; Ding, Y.; Hwang, O.; Im, S.-T.; Jang, Y.; Myung, S.-W.; Lee, JM; Kim, H.-S.; Ko, S.-C.; Lee, S.-H. In vitro ispitivanje inhibitornih i antioksidativnih aktivnosti elastaze, kolagenaze, hijaluronidaze i tirozinaze 22 ekstrakta halofitnih biljaka za nove kozmeceutike. Riba. Aquat. Sci. 2020, 23, 1–9. [CrossRef]

17. Kang, M.; Park, S.-H.; Oh, SW; Lee, SE; Yoo, JA; Nho, YH; Lee, S.; Han, BS; Cho, JY; Lee, J. Antimelanogeni učinci resorcinola posredovani su supresijom cAMP signalizacije i aktivacijom p38 MAPK signalizacije. Biosci. biotehnologija. Biochem.2018, 82, 1188-1196. [CrossRef]

19. Chatatikun, M.; Yamauchi, T.; Yamasaki, K.; Aiba, S.; Chiabchalard, A. Antimelanogeni učinak Croton roxburghii i Crotonsublyratus ostavlja u -MSH stimuliranim B16F10 stanicama. J. Tradit. Upotpuniti, dopuna. Med. 2019, 9, 66–72. [CrossRef] [PubMed]

19. Rizzello, CG; Nionelli, L.; Coda, R.; Gobbetti, M. Sinteza peptida lunasina za prevenciju raka pomoću bakterija mliječne kiseline tijekom fermentacije kiselog tijesta. Nutr. Rak 2012, 64, 111–120. [CrossRef] [PubMed]

20. Rizzello, CG; Tagliazucchi, D.; Babini, E.; Rutella, GS; Saa, DLT; Gianotti, A. Bioaktivni peptidi iz matrica biljnih namirnica: Trendovi istraživanja i nove biotehnologije za sintezu i oporavak. J. Funkt. Hrana 2016, 27, 549–569. [CrossRef]

21. Coscueta, ER; Campos, DA; Osório, H.; Nerli, BB; Pintado, M. Enzimska hidroliza proteina soje: Alat za proizvodnju biofunkcionalnih sastojaka hrane. Food Chem. X 2019, 1, 100006. [CrossRef]

22. Aydemir, LY; Yemenicioglu, A. Jesu li fenolni antioksidansi vezani za proteine ​​u mahunarkama nevidljivi dio ledenog brijega? J. Plant. Biochem.Physiol. 2013, 1, 1–3. [CrossRef]

23. Huang, SH; Ng, LT Kvantifikacija sadržaja polifenola i bioaktivnih sastojaka nekih komercijalnih sorti riže u Tajvanu. J. Food Compos. analno 2012, 26, 122–127. [CrossRef]

24. Yoshitomi, K.; Taniguchi, S.; Tanaka, K.; Uji, Y.; Akimitsu, K.; Gomi, K. Rižina terpen sintaza 24 (OsTPS24) kodira monoterpen sintazu osjetljivu na jasmonat koja proizvodi antibakterijski terpinen protiv patogena riže. J. Plant. Physiol. 2016, 191, 120–126. [CrossRef]

25. Kamolsukyeunyong, W.; Sukhaket, W.; Pitija, K.; Thorngkham, P.; Mahatheeranont, S.; Toojinda, T.; Vanavichit, A. Rižin seskviterpen igra važnu ulogu u antiksenozi protiv smeđe biljčice u riži. Biljke 2021, 10, 1049. [CrossRef][PubMed]

26. Liu, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Liang, M.; Yang, L. In vitro antioksidacijska aktivnost proteina riže pod utjecajem alkalnog stupnja i probave gastrointestinalne proteaze. J. Sci. Food Agric. 2016, 96, 4940–4950. [CrossRef] [PubMed]

27. Phongthai, S.; D'Amico, S.; Schoenlechner, R.; Homthawornchoo, W.; Rawdkuen, S. Frakcioniranje i antioksidativna svojstva hidrolizata proteina rižinih mekinja stimuliranih in vitro gastrointestinalnom probavom. Food Chem. 2018, 240, 156–164. [CrossRef][PubMed]

28. Huang, S.-L.; Wang, W.-H.; Zhong, X.-Y.; Lin, C.-T.; Lin, W.-S.; Chang, M.-Y.; Lin, Y.-S. Antioksidativna svojstva Jatropha curcas L. Ekstrakti ljuske sjemena i jezgre. Appl. Sci. 2020, 10, 3279. [CrossRef]

29. Lin, Y.-S.; Lin, W.-S.; Tung, J.-W.; Cheng, Y.-C.; Chang, M.-Y.; Chen, C.-Y.; Huang, S.-L. Antioksidativni kapacitet sjemenki ploda žižule i kore pulpe. Appl. Sci. 2020, 10, 6007. [CrossRef]

30. Šahi, Z.; Sayyed-Alangi, SZ; Najafian, L. Učinci tipa enzima i vremena procesa na stupanj hidrolize, trake elektroforeze i antioksidativna svojstva hidroliziranih proteina izvedenih iz odmašćenog Bunium persicum Bioss. prešani kolač. Heliyon 2020, 6,e03365. [CrossRef] [PubMed]

31. Xie, H.; Huang, J.; Woo, MW; Hu, J.; Xiong, H.; Zhao, Q. Učinak hladne i vruće deaktivacije enzima na strukturna i funkcionalna svojstva proteinskih hidrolizata rižinog taloga. Food Chem. 2021, 345, 128784. [CrossRef]

33. Rani, S.; Pooja, K.; Pal, GK Istraživanje hidrolizata i peptida proteina riže s posebnim osvrtom na antioksidativni potencijal: računalno izvedeni pristupi za određivanje bioaktivnosti. Trends Food Sci. Technol. 2018, 80, 61–70. [CrossRef]

33. Bisby, RH; Brooke, R.; Navaratnam, S. Učinak antioksidativnog oksidacijskog potencijala u ispitivanju kapaciteta apsorpcije kisikovih radikala (ORAC). Food Chem. 2008, 108, 1002–1007. [CrossRef]

35. Elias, RJ; Kellerby, SS; Decker, E. Antioksidativna aktivnost proteina i peptida. krit. Rev. Food Sci. Nutr. 2008, 48, 430–441.[CrossRef] [PubMed]

35. Mine, Y.; Li-Chan, E.; Jiang, B. (Ur.) Bioaktivni proteini i peptidi kao funkcionalna hrana i nutraceutici; Wiley-Blackwell:Hoboken, NJ, SAD, 2010.; str. 29–42.

36. Adebiyi, AP; Adebiyi, AO; Yamashita, J.; Ogawa, T.; Muramoto, K. Pročišćavanje i karakterizacija antioksidativnih peptida izvedenih iz hidrolizata proteina rižinih mekinja. Eur. Food Res. Technol. 2008, 228, 553–563. [CrossRef]

37. Thamnarathip, P.; Jangchud, K.; Nitisinprasert, S.; Vardhanabhuti, B. Identifikacija molekularne težine peptida iz hidrolizata proteina rižinih mekinja s visokom antioksidativnom aktivnošću. J. Cereal Sci. 2016, 69, 329–335. [CrossRef]

39. Tacias-Pascacio, VG; Morellon-Sterling, R.; Siar, E.-H.; Tavano, O.; Berenguer-Murcia, Á.; Fernandez-Lafuente, R. Upotreba alkalaze u proizvodnji bioaktivnih peptida: pregled. Int. J. Biol. Macromol. 2020, 165, 2143–2196. [CrossRef] [PubMed]

39. Sarringkarin, W.; Laokuldilok, T. Optimizacija proizvodnih uvjeta hidrolizata proteina glutinskih rižinih mekinja s antioksidativnim svojstvima. CMU J. Nat. Sci. 2017, 16, 1–18. [CrossRef]

40. Zhang, Q.; Tong, X.; Qi, B.; Wang, Z.; Li, Y.; Sui, X.; Jiang, L. Promjene u antioksidativnoj aktivnosti alkalaze-hidroliziranog sojinog hidrolizata pod simuliranom gastrointestinalnom probavom i transepitelnim transportom. J. Funkt. Hrana 2018, 42, 298–305. [CrossRef]

41. Tu, PTB; Tawata, S. Antioksidativna, anti-starenje i anti-melanogena svojstva eteričnih ulja dviju sorti alpinia zerumbet. Molecules 2015, 20, 16723–16740. [CrossRef]

42. Nishida, Y.; Sugahara, S.; Wada, K.; Toyohisa, D.; Tanaka, T.; Ono, M.; Yasuda, S. Inhibitorni učinci ekstrakta etil acetata iz lukovica Scilla scilloides na aktivnosti lipoksigenaze i hijaluronidaze. Pharm. Biol. 2014, 52, 1351–1357. [CrossRef]

43. Chen, H.-J.; Dai, F.-J.; Fan, S.-L.; Huang, Y.-C.; Chau, C.-F.; Lin, Y.-S.; Chen, C.-S. Kinetika inhibicije hijaluronidaze hidrolizatom proteina riže (Oryza sativa L.). Appl. Sci. 2020, 10, 9087. [CrossRef]

44. Girish, K.; Kemparaju, K. Čarobno ljepilo hijaluronan i njegova gumica hijaluronidaza: Biološki pregled. Life Sci. 2007, 80, 1921–1943. [CrossRef] [PubMed]

45. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Khan, MTH; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Opsežan pregled inhibitora tirozinaze. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Seo, EJ; Hong, ES; Choi, MH; Kim, KS; Lee, SJ Antioksidativni i učinci izbjeljivanja kože ekstrakata Rhamnus yoshinoi. Korejski J. Food Sci. Technol. 2010, 42, 750–754.

48. Ochiai, A.; Tanaka, S.; Tanaka, T.; Taniguchi, M. Protein rižinih mekinja kao moćan izvor antimelanogenih peptida s inhibicijskim djelovanjem na tirozinazu. J. Nat. proizvod 2016, 79, 2545–2551. [CrossRef] [PubMed]

48. Kubglomsong, S.; Theerakulkait, C.; Reed, RL; Yang, L.; Maier, CS; Stevens, JF Izolacija i identifikacija inhibitora tirozinaze i peptida koji keliraju bakar iz hidroliziranog albumina dobivenog iz rižinih mekinja. J. Agric. Food Chem. 2018, 66, 8346-8354.[CrossRef]

50. Schurink, M.; van Berkel, WJ; Wichers, H.; Boeriu, CG Novi peptidi s inhibicijskim djelovanjem na tirozinazu. Peptidi 2007, 28,485-495. [CrossRef]

50. Ishikawa, M.; Kawase, I.; Ishii, F. Kombinacija aminokiselina smanjuje pigmentaciju u stanicama melanoma B16F0. Biol. Pharm.Bull. 2007, 30, 677–681. [CrossRef] [PubMed]

51. Zhang, R.; Wei, Y.; Li, M.; Cai, M.; Gu, R.; Ma, Y.; Chen, L.; Wang, J. Učinci melanogeneze hidrolizata proteina riže i njegovih karakterističnih peptida Leu-Leu-Lys, Leu-Pro-Lys i pyroGlu-Lys na UVB-inducirane ljudske epidermalne melanocitne stanice. FoodFunct. 2020, 11, 8757–8767. [CrossRef]

52. Wang, Y.; Cai, D.; On, M.; Wang, Z.; Qin, P.; Tan, T. Otvorena fermentacijska proizvodnja l-mliječne kiseline korištenjem bijelih rižinih mekinja istovremenom saharifikacijom i fermentacijom. Bioresour. Technol. 2015, 198, 664–672. [CrossRef] [PubMed]

54. Pan, M.; Jiang, TS; Pan, JL Antioksidativna aktivnost hidrolizata proteina uljane repice. Bioproces hrane. Technol. 2009, 4, 1144-1152.[CrossRef]

54. Chen, HM; Muramoto, K.; Yamauchi, F.; Nokihara, K. Antioksidativna aktivnost dizajniranih peptida temeljenih na antioksidativnom peptidu izoliranom iz digestije proteina soje. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 2619-2623. [CrossRef]

55. Liu, Q.; Kong, B.; Xiong, YL; Xia, X. Antioksidativna aktivnost i funkcionalna svojstva hidrolizata proteina svinjske plazme pod utjecajem stupnja hidrolize. Food Chem. 2010., 118, 403–410. [CrossRef]

56. Lemes, A.; Sala, L.; Rude, JDC; Braga, ARC; Egea, MB; Fernandes, KF Pregled najnovijih dostignuća u šifriranim bioaktivnim peptidima iz otpada bogatog proteinima. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 950. [CrossRef] [PubMed]

57. Wang, J.-S.; Zhao, M.-M.; Zhao, Q.-Z.; Jiang, Y.-M. Antioksidativna svojstva papain hidrolizata pšeničnog glutena u različitim oksidacijskim sustavima. Food Chem. 2007., 101, 1658–1663. [CrossRef]

58. Gao, M.-T.; Kaneko, M.; Hirata, M.; Toorisaka, E.; Hano, T. Korištenje rižinih mekinja kao izvora hranjivih tvari za fermentativnu proizvodnju mliječne kiseline. Bioresour. Technol. 2008, 99, 3659–3664. [CrossRef] [PubMed]

59. Huang, WY; Lin, YR; Ho, RF; Liu, HY; Lin, YS Učinci vodenih otopina na ekstrakciju lišća zelenog čaja. Sci. World J. 2013, 2013, 368350. [CrossRef]

60. Wathoni, N.; Shan, CY; Shan, WY; Rostinawati, T.; Indradi, RB; Pratiwi, R.; Muchtaridi, M. Karakterizacija i antioksidativna aktivnost pektina iz kore indonezijskog mangostina (Garcinia mangostana L.). Heliyon 2019, 5, e02299. [CrossRef]

61. Tsai, C.-C.; Chan, C.-F.; Huang, W.-Y.; Lin, J.-S.; Chan, P.; Liu, H.-Y.; Lin, Y.-S. Primjena supernatanta Lactobacillus rhamnosus SpentCulture u kozmetičkim primjenama antioksidacije, izbjeljivanja i zadržavanja vlage. Molecules 2013, 18, 14161–14171.[CrossRef]

62. Huang, W.-Y.; Lee, P.-C.; Hsu, J.-C.; Lin, Y.-R.; Chen, H.-J.; Lin, Y.-S. Učinci kvalitete vode na otapanje Yerba Mate ekstrakta u prahu. Sci. Svijet J. 2014, 2014, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

63. Chan, C.-F.; Wu, C.-T.; Huang, W.-Y.; Lin, W.-S.; Wu, H.-W.; Huang, T.-K.; Chang, M.-Y.; Lin, Y.-S. Antioksidacija i inhibicija melanogeneze raznih ekstrakata Dendrobium tosaense. Molecules 2018, 23, 1810. [CrossRef] [PubMed]64. Wu, C.-T.; Agrawal, DC; Huang, W.-Y.; Hsu, H.-C.; Yang, S.-J.; Huang, S.-L.; Lin, Y.-S. Analiza funkcionalnosti iskorištenih ekstrakata mljevene kave dobivenih hidrotermalnom metodom. J. Chem. 2019., 2019., 1–8. [CrossRef]

65. Dorta, E.; Rodríguez-Rodríguez, EM; Jiménez-Quezada, A.; Fuentes-Lemus, E.; Speisky, H.; Lissi, E.; López-Alarcón, C. Korištenje testa kapaciteta apsorpcije kisikovih radikala (ORAC) za predviđanje sposobnosti nusproizvoda manga (Mangifera indica L.) da inhibiraju oksidaciju proteina mesa. Analna hrana. Metode 2016, 10, 330–338. [CrossRef]

66. Lin, Y.-S.; Chen, H.-J.; Huang, J.-P.; Lee, P.-C.; Tsai, C.-R.; Hsu, T.-F.; Huang, W.-Y. Kinetika inhibitorne aktivnosti tirozinaze korištenjem ekstrakata lišća Vitis vinifera. BioMed Res. Int. 2017, 2017, 5232680. [CrossRef] [PubMed]

67. Bidlingmeyer, BA; Cohen, SA; Tarvin, TL Brza analiza aminokiselina korištenjem derivatizacije prije kolone. J. Chromatogr. BBiomed. Sci. Appl. 1984, 336, 93–104. [CrossRef]

68. Asai, TT; Oikawa, F.; Yoshikawa, K.; Inoue, N.; Sato, K. Kolagenski peptidi dobiveni iz hrane, prolil-hidroksiprolin (Pro-Hyp) i hidroksiprolil-glicin (Hyp-Gly) pospješuju rast primarnih uzgojenih fibroblasta mišje kože pomoću fetalnog goveđeg seruma bez hidroksiprolil peptida. Int. J. Mol. Sci. 2019, 21, 229. [CrossRef]

69. Schägger, H. Tricine–SDS–PAGE. Nat. Protoc. 2006, 1, 16–22. [CrossRef]

70. Diao, J.; Chi, Z.; Guo, Z.; Zhang, L. Hidrolizat proteina Mung graha modulira imunološki odgovor kroz NF-kB put u RAW 264.7 makrofagima stimuliranim lipopolisaharidom. J. Food Sci. 2019, 84, 2652–2657.[CrossRef]