Procjena antioksidansa, izbjeljivanja i svojstava protiv starenja hidrolizata rižinih proteina

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hui-Ju Chen1,2, Fan-Jhen Dai 2, Cheng-You Chen 3, Siao-Ling Fan 2, Ji-Hong Zheng 4, Yu-Chun Huang 2, Chi-Fai Chau 1, Yung-Sheng Lin3,4, 5,* i Chin-Shuh Chen1,*

Odjel za znanost o hrani i biotehnologiju, Nacionalno sveučilište Chung Hsing, Taichung 402204, Tajvan; d103043004@mail.nchu.edu.tw (H.-JC); chaucf@nchu.edu.tw (C.-FC)

Healthmate Co., Ltd., Changhua City 500016, Tajvan; jane@healthmate.com.tw (F.-JD); eileen@healthmate.com.tw (S.-LF); tina@healthmate.com.tw (Y.-CH)

dr.sc. Program za materijale i kemijsko inženjerstvo, National United University, Miaoli 360001, Tajvan; D0612002@smail.nuu.edu.tw

Department of Chemical Engineering, National United University, Miaoli 360001, Tajvan; U0714049@smail.nuu.edu.tw

Institut za sigurnost hrane i procjenu zdravstvenih rizika, Nacionalno sveučilište Yang-Ming, Taipei 112304, Tajvan Korespondencija: linys@nuu.edu.tw (Y.-SL); cschen@mail.nchu.edu.tw (C.-SC)

Sažetak: Proteinski hidrolizati biljnog podrijetla imaju potencijalnu primjenu u prehrani. Hidrolizati proteina riže (RPH), izvrstan izvor proteina, privukli su pozornost za razvoj kozmeceutike. Međutim, nekoliko je studija izvijestilo o potencijalnoj primjeni RPH u analizi, a ova je studija ispitala njihovuantioksidansaktivnosti i inhibitorne aktivnosti enzima starenja kože. Rezultati su pokazali da su ukupne koncentracije fenola i flavonoida bile 2.06 士 0.13 mg ekvivalenta galne kiseline/g RPH i 25.96 士 0.52 µg ekvivalenta kvercetina/g RPH , odnosno. RPH su pokazali aktivnost ovisnu o dozi za uklanjanje slobodnih radikala iz 1,1- difenil-2-pikrilhidrazila [polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50)=42.58 士 2,1 mg/g RPH] i 2 ,2′-i-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (IC50=2.11 士 0,88 mg/g RPH), kapacitet redukcije ovisan o dozi (6,95 士 1,40 mg vitamina C ekvivalent/g RPH) i kapacitet apsorpcije kisikovih radikala (473 µmol Trolox ekvivalent/g RPH). Koncentracije RPH otopine potrebne za postizanje 50-postotne inhibicije hijaluronidaze itirozinazaaktivnosti su određene na 8,91 odnosno 107,6 mg/mL. Ovo je istraživanje pokazalo da RPH imajuantioksidans, antihijaluronidaza i anti-tirozinazaaktivnosti za buduće kozmetičke primjene.

Ključne riječi: hidrolizat proteina riže; antioksidans; hijaluronidaza; tirozinaza; kozmetički

Cistanche imaantioksidansinjega za izbjeljivanjeposljedica

1. Uvod

Izlaganje ultraljubičastom zračenju odgovorno je za fotostarenje (ili ekstrinzično starenje); nasuprot tome, reaktivne vrste kisika proizvedene u metabolizmu stanica i pogoršanju bioloških funkcija odgovorne su za intrinzično starenje [1,2]. Prerađena hrana često sadrži prirodneantioksidansikao što su katehini, askorbinska kiselina, tokoferoli, ružmarinska kiselina i fenolni ekstrakti iz raznih biljaka. Istraživanja provedena u prirodnimantioksidansisada razmatra netradicionalne provenijencije. Prirodnog porijeklaantioksidansisu poželjniji od kemijski proizvedenihantioksidansibudući da je za neke sintetske antioksidanse zabilježeno da su kancerogeni [3]. Riža (Oryza sativa) glavna je namirnica za ljude diljem svijeta, osobito one koji žive u Aziji. Godišnja svjetska proizvodnja riže iznosi oko 741 milijun tona [4]. U azijskim zemljama riža je navodno izvor 75 posto energetskog unosa za preko 2 milijarde ljudi [5]. Ekstenzivna proizvodnja riže rezultira odgovarajućom količinom proizvodnje nusproizvoda. Ostaci proizvoda iz procesa proizvodnje riže sadrže većinu proteina zrna (~60-85 posto), ali se bacaju ili koriste za prehranu životinja [6-8]. Peptidi dobiveni iz raznih proteinskih hidrolizata navodno djeluju kao potencijalniantioksidansi[9]. Prirodni i netoksični antioksidansi stoga se potencijalno mogu ekstrahirati iz hidrolizata proteina hrane. Brojni su znanstvenici upotrijebili modele bogate lipidima i objavili da su hidrolizati proteina, kao i peptidi proteina mlijeka, zeina i soje ključniantioksidanssvojstva, uključujući hvatanje slobodnih radikala, inhibiciju hrane i in vitro peroksidaciju lipida i kelaciju prijelaznih metala [10-12].

Hijaluronska kiselina (HA) pomaže u pomlađivanju kože jer povećava viskoznost, sadrži vlagu i čini izvanstanične tekućine manje propusnima. Zbog svoje izvrsne sposobnosti zadržavanja vode, HA povećava mladolikost, hidrataciju i glatkoću kože te smanjuje stupanj bora [13,14]. Nažalost, razina HA u koži prirodno opada s godinama. Hijaluronidaza je enzim koji uništava HA, uzrokujući gubitak čvrstoće, fleksibilnosti i vlažnosti kože, što zauzvrat dovodi do starenja kože. Stoga se bore mogu liječiti inhibicijom hijaluronidaze i održavanjem sadržaja HA u koži [15,16]. Enzim koji proizvodi melanintirozinazavitalno pridonosi koraku koji ograničava brzinu procesa kroz koji se proizvodi melanin. Stoga se poremećaji pigmentacije obično liječe, a posvjetljivanje kože postiže se inhibicijom ili smanjenjemtirozinazaaktivnost [17,18].

U nekoliko je studija otkriveno da hidrolizati proteina žitarica i peptidi koji se iz njih mogu dobitiantioksidans, antihipertenzivno i antitumorsko djelovanje [19,20]. Pozitivni doprinosi ljudskom zdravlju peptida i proteina koji potječu iz hrane postupno se prepoznaju [21]. Potrošači sve više zahtijevaju da kozmetička i zdravstvena industrija koriste prirodne bioaktivne spojeve. Hidrolizati proteina riže (RPH) privukli su pozornost kao izvrstan izvor proteina. Međutim, malo je studija izvijestilo o karakterizaciji i funkcionalnoj analizi RPH. Stoga je ova studija procijenilaantioksidansaktivnost i hijaluronidaza itirozinaza-inhibitorni

aktivnosti RPH.

2. Rezultati i rasprava

2.1. Ukupna koncentracija fenola (TPC) i ukupni sadržaj flavonoida (TFC)

Standard u TPC testu bila je galna kiselina nekoliko koncentracija. Veća apsorbancija ukazuje na viši TPC. TPC RPH uzoraka dobiven je unosom vrijednosti optičke apsorbancije RPH uzoraka u kalibracijsku krivulju galne kiseline. Iscrtavanjem koncentracije RPH u odnosu na koncentraciju fenola (Slika 1a), dobiveno je prosječno TPC od 2.06 士 0.13 mg GAE/g RPH. TFC od 25,96 士 0,52 µg QE/g RPH dobiven je slijedeći sličan postupak (Slika 1b). Slika 1c dalje povezuje TPC i TFC uzoraka RPH. Otkriva da se odnos između TPC-a i TFC-a može izraziti kao y=0.0121x plus 0,0659, gdje su x i y TPC odnosno TFC.

TPC RPH uključuje koncentracije fenolnih aminokiselina i fenolnih spojeva peptida. Interakcija protein-fenolni spoj općenito uključuje kovalentnu i nekovalentnu vezu. Fenolni spojevi oslobađaju se tijekom enzimske hidrolize. Specifični enzimi mogu biti najsposobniji za uništavanje proteinsko-polifenolnih kompleksa; to rezultira oslobađanjem većeg broja fenolnih spojeva i peptida s fenolnim skupinama, poput tirozina [22]. Zabilježena je jaka korelacija između ukupnog sadržaja polifenola u žitaricama i njihove biološke aktivnosti. Dobro je poznato da polifenoli imaju snažnu snaguantioksidansaktivnosti [23]. Iako se nalaze u manjim količinama, terpeni [24] ili seskviterpeni [25] u riži također mogu pridonijetiantioksidansaktivnosti.

2.2. Djelovanje antioksidansa

2.2.1. Aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH

Slika 2 prikazuje aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH u RPH otopini. Otkriveno je da veća koncentracija otopine rezultira većom aktivnošću. Polumaksimalna inhibitorna koncentracija (IC50), koja je koncentracija ekstrakta za koju se može ukloniti polovica svih slobodnih radikala DPPH, bila je 42,58 士 2,1 mg/mL rižinih peptida.

2.2.2. Aktivnost hvatanja slobodnih radikala ABTS

RPH-ova ABTS aktivnost hvatanja slobodnih radikala, prikazana na slici 3, bila je veća kada je korištena veća koncentracija ekstrakta. IC50 bio je 2,11 士 0,88 mg/mL rižinih peptida. Ovaj rezultat je pokazao da RPH imaju jaku ABTS aktivnost hvatanja slobodnih radikala. Aminokiseline koje sadrže sumpor, uključujući Met i Cys, i hidrofobne aminokiseline, uključujući Ala, Val, Ile, Leu, Met, Cys, Tyr, Phe, Try i Pro, mogu biti važni čimbenici s obzirom na ABTS uklanjanje slobodnih radikala aktivnost [26]. Štoviše, aromatske aminokiseline, uključujući Phe i Tyr, također potiču ABTS aktivnost hvatanja slobodnih radikala jer njihovi benzenski prstenovi doniraju protone radikalima s nedostatkom elektrona [27].

Slika 3. Utjecaj koncentracije RPH na sposobnost čišćenja 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kiseline) (ABTS).

U ovoj studiji, IC50 vrijednost aktivnosti hvatanja slobodnih radikala ABTS bila je niža od aktivnosti hvatanja slobodnih radikala DPPH, slažući se s rezultatima ljuske i jezgre sjemena Jatropha curcas L. [28] i sjemenki i ljuske pulpe ploda žižule [29]. Ovaj nalaz također odgovara izvješću o hidrolizatima proteina rižinih mekinja s 43,98-66,25 µmol Trolox ekvivalenta/g uzorka i 403,28-430,12 µmol Trolox ekvivalenta/g uzorka za aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i aktivnost hvatanja slobodnih radikala ABTS [27].

Jedan od mogućih razloga je razlika u topljivosti između slobodnih radikala DPPH (topivih u ulju) i slobodnih radikala ABTS (topivih u ulju/vodi) [30,31]. TheantioksidansNa potencijal hidrolizata proteina rižinih mekinja utjecao je njegov profil molekularne težine, sastav aminokiselina i hidrofobnost [32].

2.2.3. Kapacitet redukcije

Nalazi analize kapaciteta redukcije za RPH prikazani su na slici 4. Kapacitet redukcije se povećavao s koncentracijom RPH. Kapacitet smanjenja bio je 6,95 士 1,40 mg VCE/g RPH, što ukazuje da su RPH učinkovitiantioksidans.

Slika 4. Utjecaj koncentracije RPH na redukcijski kapacitet.

2.2.4. Kapacitet apsorpcije radikala kisika (ORAC)

ORAC test ima prednosti u odnosu na druge pristupeantioksidansodređivanje aktivnosti, uključujući korištene reaktante koji su peroksi radikali sa sličnim mehanizmom reakcije i redoks potencijalom kao fiziološki oksidansi; ukupni naboj i stanje protonacije s kojimantioksidansireagiraju nalik onima u ljudskom tijelu [33]. ORAC metoda također ima biološku važnost za učinkovitostantioksidansiu ljudskom tijelu. Slika 5 prikazuje rezultate ORAC analize RPH i Trolox standarda u različitim koncentracijama. ORAC je izveden iz regresijske jednadžbe kalibracijske krivulje koja povezuje neto AUC s koncentracijom Troloxa. Rezultati su pokazali da RPH imaju ORAC od 473 µmol TE/g RPH.

Antioksidanspeptidi ili aminokiseline mogu se dobiti enzimatskom hidrolizom proteina, što rezultira visokom aktivnošću protiv oksidansa [34]. Kelacija metalnih iona, inhibicija lipidne peroksidacije i hvatanje slobodnih radikala biološki aktivnih peptida odgovorni su za njihovu antioksidacijsku aktivnost. Slobodni radikali mogu se ugasiti, a ekspresija proteina i enzima koji smanjuju oksidativni stres mogu se reguliratiantioksidanspeptidi. Antioksidacijska učinkovitost proteinskih hidrolizata i peptida navodno ovisi o slijedu aminokiselina i veličini peptida, na što utječu uvjeti hidrolize, izvor proteina i vrsta proteaze [35]. Prema Adebiyiju i sur. [36], najveći probavljivi protein rižinih mekinja može se razbiti u manje komade subtilizinom, što rezultira većim prinosom i sadržajem proteina. TPC hidrolizata iantioksidansaktivnost može biti pod utjecajem specifičnosti enzima. Stoga, na antioksidacijsku aktivnost peptida mogu utjecati karakteristike izvora proteina, specifičnost enzima i razina hidrolize [37].

Postoje mnoga izvješća o korištenju proteaza (kao što je alkalaza, komercijalni naziv subtilizina A iz vrste Bacillus) za hidrolizu proteina biljnog podrijetla kako bi se dobiliantioksidanspeptidi. S tim u vezi, protein soje jedan je od proteina o kojem se najviše govori [38]. Nadalje, alkalaza hidroliza proteina rižinih mekinja također je pronađena. Pod optimalnim uvjetima, alkalaza hidroliza ljepljivih rižinih mekinja proizvela je proteinske hidrolizate s IC50 vrijednošću od 0.87 士 0,02 mg/mL u DPPH uklanjanju slobodnih radikala [39]. U našem istraživanju, IC50 vrijednost RPH bila je 42,58 士 2,1 mg/mL. Iako vrijednost IC50 u DPPH uklanjanju slobodnih radikala u ovoj studiji nije bila tako učinkovita kao ona iz proteina rižinih mekinja, ABTS uklanjanje slobodnih radikala (IC50=2.11 mg/mL) bilo je učinkovitije od hidrolizata proteina soje dobivenih Alcalaseom hidroliza (IC50=2.93 mg/mL) [40].

2.3. Inhibitorna aktivnost hijaluronidaze

Proteolitički enzim, hijaluronidaza, nalazi se u dermisu i katalizira razgradnju HA u izvanstaničnom matriksu [41]. Ova studija koristila je taninsku kiselinu kao pozitivnu kontrolu u svrhu usporedbe. Slika 6 otkriva da je taninska kiselina imala veću inhibiciju aktivnosti hijaluronidaze; IC50 bio je 0.14 mg/mL, slično vrijednosti koju su dobili Nishida et al. (0,121 mg/mL; 71,1 mM) [42]. Nasuprot tome, IC50 od 8,91 mg/mL izračunat je za RPH otopinu. Ovaj rezultat RPH otopine odgovara našoj prethodnoj vrijednosti IC50, 7,61 mg/mL [43]. Proteini, polisaharidi te biljnog podrijetla i sintetski spojevi su među spojevima u kojima su prisutni inhibitori hijaluronidaze. Ovi inhibitori pomažu u održavanju ravnoteže između sinteze i razgradnje HA [44]. Niska koncentracija HA u koži rezultira suhoćom i borama. Stoga je inhibicija aktivnosti hijaluronidaze način na koji se može poboljšati morfologija kože i odgoditi njezino starenje.

2.4. Inhibitorna aktivnost tirozinaze

Proteinski hidrolizati iz prirodnih izvora imaju potencijal inhibicijetirozinazaaktivnost. In vitro test inhibicije tirozinaze obično se koristi za procjenu kako sredstva za izbjeljivanje kože izravno utječu na aktivnost tirozinaze [45]. Sudjelujući u koraku koji ograničava brzinu sinteze melanina,tirozinazakatalizira hidroksilaciju L-tirozina u L-DOPA i zatim oksidaciju potonjeg u o-dopakinon. Kada je poželjno spriječiti biosintezu melanina, inhibicija aktivnosti L-tirozinaze može biti ključna. Ovdje,tirozinazakorišten je za mjerenje aktivnosti RPH antitirozinaze. Kao što je prikazano na slici 7, koncentracija 107,6 mg/mL postigla je 50-postotnu inhibiciju aktivnosti tirozinaze. Askorbinska kiselina je pokazala visoku aktivnost inhibiranja tirozinaze (IC50=0.098 mg/mL), što je bilo slično 0,102 mg/mL koje su dali Seo i sur. izvijestio [46].

Slika 7. Učinak koncentracije RPH natirozinaza-inhibitorna aktivnost. Značajke koje ne dijele zajednički gornji indeks značajno se razlikuju (p <>

Hidrolizati proteina rižinih mekinja pokazali su se značajno visokimtirozinaza-inhibicijska aktivnost [47,48]. Inhibicijska aktivnost RPH otopine na tirozinazu može proizaći iz aminokiselinskih profila peptida. Schurink i sur. opisao taj učinkovittirozinaza-inhibitorni peptidi sastoje se od ostataka arginina i fenilalanina [49]. Inhibitorna aktivnost tirozinaze može se poboljšati hidrofobnim aminokiselinskim ostacima (npr. alaninom), a proizvodnja melanina može biti poremećena alaninom [50]. Osim toga, Zhang i sur. također je izvijestio da hidrolizat proteina riže može smanjiti sadržaj melanina itirozinazaaktivnost u UVB-induciranom staničnom modelu [51].

2.5. Profili aminokiselina i MW RPH

Sadržaj proteina u riži nakon uklanjanja škroba u ovoj studiji bio je 23,56 posto težine, a stupanj hidrolize uzorka hidroliziranog proteazom bio je 9,36 posto. Tablica 1 detaljno prikazuje sastav aminokiselina u RPH. U uzorku je svakih 100 g sadržavalo 5,18 g aminokiselina. Što se tiče aminokiselinskih komponenti, RPH su bili bogati alaninom, leucinom, argininom, glutaminskom kiselinom i asparaginskom kiselinom. Svakih 100 g uzorka sadržavalo je ukupno 1,73 g hidrofobnih aminokiselina (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin i cistein). Ovaj rezultat bio je potpuno drugačiji od našeg prethodnog izvješća [43] u otopini amilaze i temperaturi njezine obrade za uklanjanje škroba. Sadržaj hidrofobnih aminokiselina bio je 1,90 puta veći od našeg prethodnog izvješća. Niža temperatura tretmana (60 O C) u ovoj studiji može spriječiti denaturaciju proteina u velikim količinama, tako da se aktivnost aminokiselina može bolje očuvati. Osim toga, sličan zaključak je također dobiven od druge gljivične amilaze i glukoamilaze za saharificiranje škroba u bijelim rižinim mekinjama [52].

Tablica 1. Profili aminokiselina u uzorcima hidrolizata proteina riže (RPH).

Istraživanja su pokazala da hidrofobne aminokiseline sličeantioksidansipovećanjem topljivosti temeljene na lipidima u hidrolizatima proteina i peptidima iz različitih izvora proteina, čime se potiče interakcija sa slobodnim radikalima [38,53]. Neke aminokiseline objavili su Chen i sur. [54] općenito biti antioksidansi; spomenute kiseline uključivale su triptofan, cistein, metionin, tirozin i histidin. U ovoj studiji, aromatske aminokiseline (fenilalanin, tirozin i triptofan) sadržavale su 0.53 g/100 g RPH. Stoga su ove aminokiseline koje potiču iz peptida vjerojatno odgovorne za RPHantioksidansaktivnost.

Osim toga, proteini koji su hidrolizirani u kraće peptide imaju drugačiju distribuciju MM, a neke hidrofobne skupine složene u unutrašnjosti cjelovitih prirodnih proteinskih molekula obično su izložene vodenoj fazi. To je povezano s proteinskim molekulama koje su strukturno preuređene, a time i s funkcionalnim svojstvima proteina [55,56]. Podaci tricin-SDS-PAGE pokazuju da je MW RPH u rasponu 5-35 kDa (Slika 8a).

Slika 8. Određivanje molekularne težine (MW) za RPH elektroforezom natrijev dodecil sulfat–poliakrilamidni gel (SDS-PAGE): (a) obrasci tricin-SDS-PAGE markera MW (linija 1) i RPH (linija 2) i (b) relativni sadržaj (postotak) svakog MW RPH-a.

Slika 8b prikazuje relativni sadržaj različitih MW u RPH. Sveukupno, 45,24 posto svih proteina bilo je u glavnoj vrpci (MW ≈ 2,4 kDa). Slični rezultati dobiveni su u vezi s peptidom hidrolizata proteina rižinih mekinja. Najvišeantioksidansaktivnost koju su dobili Thamnarathip i sur. [37] bila je ona za peptide MM=6–50 kDa. Osim toga, postoji povezanost između funkcije proteinskih hidrolizata i distribucije molekulske mase i sastava aminokiselina [57]. Ovo objašnjavaantioksidansaktivnosti RPH promatranih u ovoj studiji.

2.6. Test toksičnosti stanica

Za buduće primjene potrebna je niska toksičnost stanica. Kako bi se procijenila citotoksičnost i biokompatibilnost RPH, stanična vitalnost sirovih 264.7 stanica u otopini RPH mjerena je MTT metodom. Kao što je prikazano na slici 9, vitalnost stanica bila je iznad 100 posto kada su tretirane s 25-2000 µg/mL RPH tijekom 24 h i 48 h. Rezultati pokazuju izrazito nisku citotoksičnost RPH. Stoga se RPH mogu potencijalno koristiti kao kozmetičke aplikacije s vrlo niskom citotoksičnošću.

Slika 9. MTT test za staničnu toksičnost sirovih 264.7 stanica tretiranih različitim koncentracijama RPH tijekom 24 i 48 sati.

3. Materijali i metode

3.1. Reagensi

Željezov(III) klorid, 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS), Trolox (6-hidroksi-2,5,7 ,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina), l-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ( DPPH), a trikloroctena kiselina nabavljena je od Alfa Aesara (Tewksbury, MA, SAD). 2,2′-azobis(2-metilpropionamidin) dihidroklorid (AAPH), Folin–Ciocalteuov fenol reagens, galna kiselina, askorbinska kiselina, gljiva tirozinaza i fluorescein natrij nabavljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Natrijev karbonat je dobiven od Riedel-de Haën (Seelze, Njemačka). Konačno, kalijev fericijanid, natrijev hidrogenfosfat i natrijev dihidrogenfosfat dobiveni su od Showa Chemical (Tokio, Japan).

3.2. Priprema RPH-ova

RPH su pripremljeni kao što je prethodno opisano, osim što je gljivična amilaza usvojena za saharificiranje škroba u rižinom brašnu, izbjegavajući oštećenje aminokiselina uzrokovano hidrolizom bakterijske amilaze na visokim temperaturama [43,58]. Stotinu grama rižinog brašna namočeno je u 1000 mL destilirane vode koja sadrži 0,5 posto gljivične amilaze (Genencor, NY, SAD); smjesa je zatim zagrijavana 24 sata do 60 °C (pH 4,2), nakon čega je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu. Centrifugiranje je obavljeno 10 minuta na 1968 x g kako bi se uklonio preostali supernatant. Nakon 20-ukupne vode i 2 mL 0,1 posto hidrolitičke proteaze (Healthmate, Changhua, Tajvan) dodano je netopljivom dijelu, otopina je protresena i inkubirana 4 h na 55 °C. pH-stat metoda je korišten za održavanje pH otopine na optimalnoj razini, a zatim je izvedeno zagrijavanje na 85 O C tijekom 10 minuta za inaktivaciju enzima. Preostala netopljiva frakcija uklonjena je centrifugiranjem 15 minuta na 3075 x g. Liofilizacija je provedena na supernatantu, koji je potom pohranjen na _20 O C prije upotrebe.

3.3. Antioksidativna aktivnost RPH

3.3.1. Ukupna koncentracija fenola (TPC)

Korištena je Folin-Ciocalteuova metoda za otkrivanje TPC RPH [59]. Prvo je 200 µL Folin-Ciocalteuovog fenolnog reagensa (0,3M) jednolično pomiješano kroz 5-min mućkanja s 200 µL RPH otopine, a u ovu smjesu dodano je 400 µL deioniziranog (DI) dodano je vode i 200 uL 10 postotne (w/v) otopine natrijevog karbonata. Pomiješana otopina je podvrgnuta 60 min inkubacije u tami na sobnoj temperaturi. Zatim je centrifugiran 15 minuta na 3000 okretaja u minuti. Za mjerenje je korišteno 100 µL supernatanta. Za određivanje TPC (jedinica: mg) ekvivalenta galne kiseline (GAE) po gramu suhog uzorka RPH (jedinica: mg GAE/g RPH), podaci o optičkoj apsorbanciji uneseni su u standardnu ​​krivulju koja predstavlja galnu kiselinu. Apsorbancija je dobivena na 700 nm korištenjem Epoch Microplate Spectrofotometra (BioTek, VT, SAD).

3.3.2. Ukupni sadržaj flavonoida (TFC)

TFC je dobiven prema pristupu Wathonija i sur. s manjim izmjenama [60]. Prvo je pomiješano 500 µL svakog uzorka i 2 posto (w/v) otopina aluminijevog klorida. Reakcijska otopina je temeljito promiješana i ostavljena 10 minuta, te je procijenjena apsorbancija na 415 nm. Rezultat se izražava u mikrogramima ekvivalenta kvercetina (QE) po gramu suhog RPH uzorka (µg QE/g RPH).

3.3.3. DPPH aktivnost hvatanja slobodnih radikala

Prvo su pomiješane 198 µM DPPH otopina etanola (50 µL) i RPH otopina ili DI voda (0,5 µL; uzorak i kontrola) i zatim ostavljene stajati 30 minuta u tami na sobnoj temperaturi. Nakon toga je dobivena apsorbancija otopine na 517 nm. Relativna aktivnost čišćenja izračunata je određivanjem razlike apsorbancije između uzorka i kontrole. Visoka aktivnost hvatanja slobodnih radikala DPPH odrazila se na nisku optičku apsorbanciju. U procjeni DPPH aktivnosti hvatanja slobodnih radikala RPH otopine, korišteni standard bio je vitamin C [61-63].

3.3.4. Aktivnost hvatanja slobodnih radikala ABTS

Pristup koji su objavili Wu et al. korišten je za procjenu RPH rješenjaantioksidansaktivnost [64]. Prvo je 7 mM osnovne otopine ABTS (250 µL) reagiralo s 2,45 mM kalijevog persulfata (250 µL) kako bi se dobio ABTS kation slobodnih radikala (ABTS● plus), a smjesa je ostavljena 16 h na 4 °C u mraku prije nego što je korišten. Nakon uspostavljanja ravnoteže u tami na sobnoj temperaturi, 0.1 M fosfatno puferirana fiziološka otopina (PBS; pH 7,4) korištena je za razrjeđivanje otopine do 0,70 ± 0,02 apsorbancije na 734 nm. Zatim je u 180 µL razrijeđene ABTS otopine dodano 20 µL Troloxa (pozitivna kontrola) ili RPH otopine (uzorak). Smjesa je zatim podvrgnuta 10 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi. Ova studija je odredila optičku apsorbanciju na 734 nm; niža apsorbancija je odgovarala višoj ABTS aktivnosti hvatanja slobodnih radikala. Standard korišten za procjenu aktivnosti hvatanja slobodnih radikala RPH otopine ABTS bio je antioksidans Trolox.

3.3.5. Kapacitet redukcije

Za određivanje ukupne RPH otopine korištena je analiza antioksidativne snage koja reducira željezoantioksidansaktivnost. Kao što su izvijestili Lin i sur. [29], RPH otopina (200 µL) jednolično je pomiješana s 1 posto (w/v) K3Fe(CN)6 i 0,2 M PBS pufera (pH 6,6; 100 µL svaki) . Tijekom 20 minuta korištena je vodena kupelj na 50 °C za zagrijavanje smjese; nakon uklanjanja smjese iz kupelji, brzo je ohlađena 3 minute. Zatim je izvršeno dodavanje 10 posto (w/v) trikloroctene kiseline (100 µL) i 10-min centrifugiranje na 3000 okretaja u minuti. Nakon toga je uslijedila ekstrakcija supernatanta (400 µL) i njegovo ravnomjerno miješanje s 0,1 posto (w/v) FeCl3 (100 µL) i DI vodom (400 µL). Fe4 [Fe(CN)6 ]3 dobiven je 10-min reakcijom ove smjese u mraku. Nakon toga, veća optička apsorbancija (mjerena na 700 nm) ukazuje na veći kapacitet redukcije. Standardni vitamin C korišten je za određivanje sadržaja ekvivalenta vitamina C (VCE) po gramu RPH.

3.3.6. Kapacitet apsorpcije radikala kisika (ORAC)

Ova je studija dobila ORAC modificiranjem prethodno objavljene metode [65]. Nakon otapanja RPH uzorka u destiliranoj vodi, RPH otopina (50 µL) je pomiješana s fluoresceinom (10 µM) u mikrotitarskoj ploči 96-jažica. Otopina je podvrgnuta 15-min inkubaciji na 37 O C nakon čega je uslijedilo dodavanje 50 µL AAPH (500 mM). Svakih 5 minuta i tijekom ukupno 120 minuta, bilježena je fluorescencija (λex i λem=485 odnosno 528 nm). TheantioksidansKapacitet RPH je otkriven iz kinetike opadanja fluorescencije izračunavanjem površine ispod krivulje (AUC). U izračunavanju RPH ORAC, standard je bio 15-250 µM Trolox. ORAC se prijavljuje kao mikromoli Trolox ekvivalenta (TE) po gramu suhog RPH uzorka (µmol TE/g RPH).

3.4. Inhibitorna aktivnost hijaluronidaze

Test inhibicije hijaluronidaze proveden je korištenjem mikropločice s jažicama i prethodno objavljene metode s malim modifikacijama [40]. N-acetilglukozamin je oslobođen reakcijom hijaluronidaze sa supstratom HA. U prisutnosti bilo kojeg inhibitora, otpuštanje N-acetilglukozamina je smanjeno, pri čemu se ovo otpuštanje detektira dobivanjem 600-nm apsorbancije. HA je istaložen s kiselom otopinom albumina koja se sastoji od 0.1 M acetatnog pufera (pH 3,9) i goveđeg serumskog albumina (1 mg/mL). Otopina uzorka i 5 mg/mL hijaluronidaze podvrgnuti su 20-min inkubaciji na 37 O C. U smjesu za inkubaciju, HA (1{{20}}0 µL; 5,0 mg/mL u 0,1 M acetatni pufer) je naknadno dodan. Provedena je daljnja inkubacija na 37 O C tijekom 40 minuta. Dodano je 0,1 mL 0,4 M otopine alkalnog borata da se zaustavi enzimska reakcija.

3.5. Inhibitorna aktivnost tirozinaze

Ova studija procijenila jeantitirozinazaaktivnost RPH korištenjem prethodno objavljenog protokola s modifikacijama [66]. Otopina enzima (135 U/mL) pripravljena je otapanjemtirozinazau 20 mM fosfatnom puferu (pH 6,8). Dodatno, DI voda je korištena za pripremu otopine 1,25 mM L-DOPA. Zatim je 40 µL različitih koncentracija RPH otopina uzorka pomiješano s 40 µL otopine tirozinaze i 120 µL otopine L-DOPA. Tijekom 30 minuta, ova smjesa je držana na 37 O C u testu inhibicije RPH-atirozinazaaktivnost. Spektrofotometar (FLUOstar Omega Microplate Reader, BMG Labtech GmbH, Njemačka) korišten je za dobivanje 475-nm apsorbancije. Sva mjerenja obavljena su tri puta. Apsorpcija odgovarajuće skupine kadatirozinazanije bilo oduzeto je. Stopa inhibicije enzima određena je kao

3.6. Karakterizacija RPH

3.6.1. Profili aminokiselina

Ovo je istraživanje otkrilo aminokiselinski sastav RPH. Prvo je tijekom 24 sata i na 115 O C korištena 4 M metansulfonska kiselina za hidrolizu uzoraka u evakuiranim zatvorenim epruvetama. Dva Waters 510 sustava za isporuku otapala i analizator aminokiselina (L- 8900; Hitachi, Tokio, Japan) korišteni su za odvajanje derivatiziranih aminokiselina na koloni Spherisorb ODS2 dimenzija 25 m × 64,6 mm. U ovoj studiji korištena su sljedeća otapala: (a) natrijev acetat (0.14 M) i trietilamin (850 µL/L; pH 5,6) i (b) 60-postotni acetonitril, za koji je gradijent bio je 0 posto tijekom 2 minute; 0–42 posto tijekom 15,5 min (konveksna krivulja); i 100 posto za 4 min. Dvostruki uzorci uzeti su za mjerenje profila aminokiselina na 254 nm [67,68].

3.6.2. Molekularna težina (MW) proteina

U skladu sa Schäggerovom metodom [69] i pod redukcijskim uvjetima, ovom studijom dobivena je distribucija MW elektroforezom tricin–natrij dodecil sulfat (SDS)–poliakrilamidni gel (PAGE) uz male modifikacije. Pufer za uzorak (30 g/L SDS, 0.375 M Tris-HCl, 0.125 g/L Coomassie Brilliant Blue G-250 i 75 g /L glicerola; pH 7) korišten je za disperziju zamrzavanjem osušenog uzorka, uz centrifugiranje koje je zatim izvršeno prije punjenja. Ukupno 20 µL 2-merkaptoetanola dodano je u 1 mL tricin-SDS-PAGE uzorka. Uzorak je zagrijavan na 100 O C 90 s. Jažica s uzorkom napunjena je sa svakim uzorkom i neobojenim proteinskim standardom širokog raspona (Bio-Rad Laboratories, Njemačka) pomoću mikroštrcaljke. Zatim je provedena elektroforeza — prvo na konstantnih 30 mV dok se cijeli uzorak ne nađe unutar gela za slaganje, a zatim do završetka na konstantnih 100 mV. Nakon toga, 0,02 postotna otopina Coomassie Brilliant Blue R-250 primijenjena je za bojenje gela. Apsolutno pozadinsko odbojavanje gelova provedeno je mućkanjem gelova u 10-postotnoj octenoj kiselini preko noći. Konačno, slika gela je analizirana da se identificiraju proteinske trake u stazama; ova analiza je obavljena u ImageJ (SAD National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Standardni markeri korišteni su za dobivanje kalibracijske krivulje iz koje je procijenjena MW. Ukratko, prvi korak je bio određivanje duljine migracije (Rf) svake trake od vrha gela za razdvajanje. Drugi korak bio je izračun kalibracijske krivulje primjenom Rf i log (MW) za standardni marker s danom MW. Određivanje MW provedeno je korištenjem Rf proteinskih vrpci u RPH.

3.7. Ispitivanje citotoksičnosti

Neobrađene 264,7 stanice uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (DMEM) s visokim sadržajem glukoze koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 4,5 g/L glukoze, 1 posto otopine antibiotika (100 jedinica/ mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina), 4 mM L-glutamina i 1,5 g/L natrijevog bikarbonata na 37 O C i 5 posto CO2. Stanična toksičnost sirovih 264.7 stanica za RPH mjerena je testom proliferacije 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil-tetrazolij bromida (MTT) metoda. Otprilike 1 x 104 stanica po jažici postavljeno je u 96-ploče s jažicom. Nakon 24 sata, različite koncentracije RPH (0-2000 µg/mL) su dodane u stanice. Nakon 24 i 48 h inkubacije, dodano je 100 µL otopine MTT (0,5 mg/mL). Plavi kristali formazana uočeni su kada su provjeravani pod mikroskopom. DMEM je uklonjen i dodano je 100 uL dimetil sulfoksida (DMSO) po jažici. Apsorbancija je mjerena pomoću čitača mikrotitarskih ploča. Stanična održivost (postotak) je zatim izračunata kao [A570 (tretirane stanice) _ A570 (pozadina)] / [A570 (netretirane stanice) _ A570 (pozadina)] × 100 posto [70].

3.8. Statistička analiza

Izvješće za svaki uzorak hidrolizata bila je prosječna vrijednost iz tri neovisna ponovljena pokusa i određivanja. Rezultati izraženi u srednjoj 士 standardnoj devijaciji (SD) analizirani su jednosmjernom ANOVA i Duncanovim post hoc testom korištenjem Sustava za statističku analizu (verzija 20.0; SPSS, Armonk, NY, SAD) . Vrijednosti p < 0,05="" smatrane="" su="" statistički="">

4. Zaključci

Ova studija ispitivala je funkcije RPH-a. Eksperimentalni rezultati otkrili su da RPH sadrže fenolne spojeve i flavonoide i pokazuju nizantioksidansaktivnosti, kao što su aktivnosti čišćenja DPPH i ABTS, kapacitet smanjenja i ORAC. Osim toga, RPH su učinkovito inhibiranitirozinazai aktivnosti hijaluronidaze. Proteaza je bila kritičan čimbenik koji je utjecao na MW uzorke RPH. Analiza RPH-a ukazuje na njihov potencijal za korištenje kao sastojka u kozmetici.

Doprinosi autora: Studiju su konceptualizirali Y.-SL; formalnu analizu izvršili su Y.-SL i C.-SC; obradu podataka izvršili su H.-JC, F.-JD, C.-YC, J.-HZ i Y.-CH; originalni rukopis izradili su H.-JC, F.-JD i S.-LF; konačno, nacrt su pregledali i uredili C.-FC, Y.-SL i C.-SC. Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje: Ministarstvo znanosti i tehnologije financiralo je ovu studiju. Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Podaci prikazani u ovoj studiji dostupni su na zahtjev odgovarajućeg autora.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa. Dostupnost uzorka: Nije dostupno.