Poboljšanje top-down proteomike moždanog tkiva s FAIMS-om, dio 4

Također smo identificirali brojne fragmente izvedene iz nekanonskih spojenih izoformi tauproteina za koje se zna da se eksprimiraju u ljudskom mozgu.83 Ukratko, tau izoforme definirane su brojem N-terminalnih umetaka zbog alternativnog spajanja egzona 2 i/ili 3 (navedeno na 0N, 1N i 2N) i broj ponavljanja vezanja mikrotubula zbog alternativnog spajanja egzona 10 (naziva se 3R ili 4R).84

Tau protein je važan protein u neuronskim stanicama, koji ima vrlo važnu ulogu u održavanju normalne strukture i funkcije neuronskih stanica. Studije su pokazale da je tau protein usko povezan s pamćenjem, a njegova abnormalna ekspresija može dovesti do kognitivnog pada, pa čak i kognitivnog oštećenja.

Znanstvenici su proveli mnogo istraživanja o odnosu između tau proteina i pamćenja. Prema istraživanjima, tau protein može pomoći u regulaciji stabilnosti živčanih vlakana, čime se potiče prijenos informacija i formiranje pamćenja između neuronskih stanica. Međutim, kada je tau protein abnormalan, kao što je nakupljanje proteina, to će dovesti do loma živčanih vlakana i smrti velikog broja neuronskih stanica, što će utjecati na formiranje i održavanje pamćenja, pa čak i dovesti do oštećenja pamćenja. Stoga je održavanje normalne ekspresije i funkcije tau proteina vrlo važno za održavanje zdravlja pamćenja.

Nedavne studije također su otkrile da su hranjive tvari sadržane u nekoj hrani i pićima također korisne za održavanje normalne funkcije tau proteina. Na primjer, antioksidansi, Omega-3 masne kiseline te povrće i voće bogato kofeinom mogu pomoći u regulaciji ekspresije i funkcije tau proteina, što pomaže u poboljšanju pamćenja i kognitivnih funkcija.

Stoga bismo trebali obratiti pozornost na održavanje dobrih životnih navika, kontrolu prehrane, smanjenje stresa itd., kako bismo održali normalnu ekspresiju i funkciju tau proteina. U isto vrijeme, održavanje dobrih navika učenja i umjerena tjelovježba također mogu pomoći u promicanju prijenosa informacija i formiranja pamćenja između neuronskih stanica. Vjerujem da sve dok pazimo na održavanje zdravog načina života, možemo imati zdravo pamćenje i bolje uživati ​​u životu. To pokazuje da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche tradicionalni kineski ljekoviti materijal s brojnim jedinstvenim učincima, a jedno od njih je poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanche dolazi od različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide itd. Ovi sastojci mogu promicati zdravlje mozga na različite načine.

Kliknite na 10 načina za poboljšanje pamćenja

Također je vrijedno napomenuti da su endogeni fragmenti tau čest nalaz u tkivu ljudskog mozga i cerebrospinalnoj tekućini, a diferencijalna fragmentacija tau može igrati ulogu u progresiji AD.85,86

Uočili smo nekoliko fragmenata koji mogu nedvosmisleno razlikovati {{0}}N i 1N tau (slike 10A, S7 i S8). Činjenica da opažamo visoke spektralne brojeve za 0N (86 PrSM) i 1N (91 PrSM), ali ne opažamo nijedan PrSM za 2N, usklađena je s prethodnim kvantitativnim imunoblotingom koji je utvrdio da su 0N i 1N dominantni oblici i čine ~ 91% ukupnog tau dok je 2N sadržavao samo ~9%.87

Što se tiče nedvosmislenog dodjeljivanja ponavljanja vezanja mikrotubula, promatrali smo spektre koji se također mogu pripisati i 3R (slike 10A i S9) i 4R tau (slike 10A i S10).

Štedljivo zaključivanje omogućilo nam je da zaključimo da je braintau predstavljen uglavnom mješavinom 1N3R (Tau-B) nakon koje slijede 0N4R (Tau-D) varijante spajanja, što je u skladu s prethodnim opažanjima.87,88

Dok su druge spojene izoforme također imale jedinstvene fragmente, nizak broj spektralnih podudaranja (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Iznenađujuće, N-krajevi fragmenata koji sadrže dominantnu R-domenu nastavak su C-kraja fragmenata koji sadrže dominantnu N-domenu, ili drugim riječima, čini se da su povezani fragmenti proizvedeni iz mogućeg događaja proteolitičkog cijepanja (koji se naziva mjesto #1 na slici 10A). Nadalje, C-završeci proteoformi koje sadrže 3R i 4R domenu dijele isto mjesto cijepanja (navedeno kao mjesto #2 na slici 10A), iako su same sekvence različite zbog varijacije spajanja egzona 10.

Što je još iznenađujuće, sva ta mjesta cijepanja leže unutar tri dobro opisana heksapeptidna motiva.89-95 Slika 10B prikazuje sve jedinstvene fragmente koje smo identificirali iz naših skupova podataka koji se mogu mapirati na 1N3R tau izoformu, kao i lokaciju cijepanja stranice.

Mjesto cijepanja #1 nalazi se unutar druge regije tau bogate prolinom, koja dijeli KVAVVR heksapeptidnu sekvencu i osigurava jedno od najjačih veznih mjesta za mikrotubule (Slika 10B).89-91 Mjesto cijepanja #2 nalazi se unutar 3R i 4R heksapeptidnih motiva VQIVYK i VQIINK, za koje je dokazano da pokreću agregaciju tau (Slika 10B).92–95

Zanimljivo je da mnogi od fragmenata, kao što je prikazano na slici 10B, počinju ili završavaju u blizini ova dva mjesta cijepanja. Poznato je da svaki od ovih heksapeptidnih motiva tvori -strukturu, često u obliku -ukosnica koje su u osnovi agregacije uključene u razne neurodegenerativne bolesti.89,93,96 Intrigantno, ova opažanja naglašavaju mogućnost zajedničkog puta proteolitičke razgradnje među tau izoformama koji je sposoban poremetiti njihova područja zasijavanja agregacije.25,85,86

Na kraju, pronašli smo brojna spektralna podudaranja za A koja su se mogla promatrati isključivo pomoću FAIMS-a.

Ovi A proteoformi, koji obično zahtijevaju posebne tehnike frakcioniranja ili rukovanja kako bi se poboljšao oporavak zbog njihovih hidrofobnih svojstava i svojstava sklonih agregaciji,9,16,97,98 promatrani su netaknuti korištenjem FAIMS-a unutar -40 do -50 CV raspona.

Ovo uključuje kanonske A 1-42 i A 1-40 (Slika 11A, B, respektivno), kao i nekoliko N-terminalno skraćenih oblika (točnije A 2-42 i A 4-42, Slika 11C, D).

Vrijedno je napomenuti da je proteoforme A s različitim N- i C-terminalnim cijepanjima izrazito teško identificirati u analizama odozdo prema gore zbog ekstremne hidrofobnosti triptičkih produkata, što naglašava prednost analize netaknutih proteina.

Vjerujemo da metodologija FAIMS-TDP nudi robustan način za postizanje intaktne identifikacije ovih A proteoformi, dopuštajući jednostavno određivanje različitih kombinacija proizvoda cijepanja N i C-terminala koji postoje.

ZAKLJUČCI

Opisali smo kako nano-LC odvajanje reverzne faze visoko složenih proteina koji sadrže uzorke, u širokom rasponu masa, može imati koristi od implementacije frakcioniranja u plinovitoj fazi putem FAIMS-a u kontekstu spektrometrije mase odozgo prema dolje.

Pokazalo se da FAIMS utječe na prijenos proteoformi prema veličini i/ili naboju, smanjujući kompleksnost MS1 i dopuštajući veću dubinu pokrivenosti proteoma.

FAIMS na jednom CV (-50) omogućio je identifikaciju 1833 ± 17 jedinstvenih proteoformi u prosjeku, više nego dvostruko u usporedbi bez FAIMS-a (754 ± 35). Dodatak FAIMS-a nije rezultirao pogoršanjem ponovljivosti kvantifikacije i ostao je blizu 20% RSD, što je usporedivo s pristupima odozdo prema gore bez označavanja.

Primijećeno je smanjenje CV FAIMS-a kako bi se povećala molekularna masa ionskih vrsta koje se prenose na instrument (medijan MW od ~5 kDa na -50 CV u odnosu na ~15 kDa na -20 CV), a također je primijećeno da modulacija CV utječe na prijenos omotnica stanja naboja proteoforme diferencijalno.

Također smo definirali optimalne kombinacije CV-ova koji bi mogli proizvesti najveći teorijski maksimum proteoformi/gena ili pokrivenosti sekvence proteoma. U usporedbi s tri skupa podataka "Bez FAIMS", eksterni CV korak na -50, -40 i -30 V mogao bi više nego udvostručiti broj jedinstvenih proteoformi, jedinstvenih gena i pokrivenosti sekvence proteoma.

Također je vrijedno istaknuti da je naš rad istraživao samo relativno mali CV raspon za koji smo smatrali da najbolje odgovara našem TDP pristupu korištenjem složenog uzorka. Budući da se FAIMS može lako prilagoditi drugim metodama, MS1 analize niske rezolucije s Orbitrap analizatorima mogle bi poboljšati identifikaciju većih proteoformi unutar CV raspona koji smo testirali, kao i iznad -20 V gdje bi se vjerojatno uočile veće proteoforme.

Također se može zamisliti da buduća instrumentacija analizatora mase koja poboljšava stjecanje većih proteoformi i kompatibilna je s FAIMS-om može imati koristi od istraživanja CV-ova ispod -20, koji se protežu u raspon pozitivnog napona.

Naš tijek rada TDP-a omogućio nam je identificiranje i karakterizaciju jedinstvenih proteoformi izvedenih iz gena s poznatom ulogom u neurodegenerativnim bolestima.

To je uključivalo određivanje sastava nepoznatog pomaka mase prisutnog u blizini domene -sinukleina koja veže željezo, koja je korištena za precizno određivanje lokacija potencijalnih domena za vezanje željeza u - i sinukleinu. Također je pronađeno da je PARK7 modificiran sa sukcinilnom skupinom na svom Cys ostatku aktivnog mjesta.

Uspjeli smo pojedinačno nedvosmisleno razlikovati tau fragmente koji odgovaraju 0N, 1N, 3R i 4R spojenim izoformama varijanti i opisati nova mjesta proteolitičkog cijepanja smještena unutar ili u blizini nekoliko heksapeptidnih ponavljanja agregacije.

Konačno, FAIMS je omogućio identifikaciju nekoliko netaknutih A proteoformi, uključujući A 1-42 sklonu agregaciji, bez potrebe za složenim tehnikama frakcioniranja ili pročišćavanja.

Ukratko, vjerujemo da će dodavanje FAIMS-a za otkrivanje TDP-a pružiti robusnu i ponovljivu metodu za povećanje proteoma dostupnog za detekciju i karakterizaciju.

Dopunski materijal

Za dodatni materijal pogledajte web verziju na PubMed Centralu.

ZAHVALA

Autori bi željeli zahvaliti Tao Liu i Richardu Smithu na njihovim savjetima i korisnim raspravama.

Ovaj rad je podržan od strane U01 AG061356 (PLDJ) i R01 AG015819 (DAB). Dio istraživanja proveden je korištenjem EMSL-a (grid.436923.9), Ureda za znanstvene korisnike DOE-a sponzoriranog od strane Programa za istraživanje biologije i okoliša. Grafički apstraktni i slikovni elementi unutar Slike 1 stvoreni su pomoću Biorender.com.

REFERENCE

(1). Nichols E; Szoeke CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abd-Allah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Stolar DO; Carvalho F; Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE; Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; Hagos TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Hay SI; Irvani SSN; Jha RP; Jonas JB; Kalani R; Karch A; Kasaeian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T; Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S; Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR; Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; ribnjak CD; Poustchi H; Qorbani M; Radfar A; Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Rostami A; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpathy M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Shaikh MA; Sahraian MA; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; Venketasubramanian N; Vlasov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Žare Z; Vos T; Feigin VL; Murray CJL Globalni, regionalni i nacionalni teret Alzheimerove bolesti i drugih demencija, 1990–2016: sustavna analiza za Studiju globalnog tereta bolesti 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beyreuther K; Masters CL Amiloidni prekursorski protein (APP) i beta A4 amiloid u etiologiji Alzheimerove bolesti: odnosi prekursora i proizvoda u poremećaju neuronske funkcije. Brain Pathol. 1991., 1, 241–251. [PubMed: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alzheimerova bolest: hipoteza amiloidne kaskade. Znanost 1992, 256,184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Goedert M. Tau protein i neurofibrilarna patologija Alzheimerove bolesti. Trends Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Gong CX Tau i neurodegenerativna bolest: dosadašnja priča. Nat. Rev. Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Tri dimenzije amiloidne hipoteze: vrijeme, prostor i 'krilaši'. Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Takeda S. Tau Propagacija kao dijagnostički i terapeutski cilj za demenciju: potencijali i neodgovorena pitanja. Ispred. Neurosci. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Top-down proteomika u zdravlju i bolesti: izazovi i prilike. Proteomika 2014, 14, 1195–1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrova AE; Kononikhin AS; Indeykina, Autori izjavljuju da nema konkurentskog financijskog interesa. MI; Popov IA; Nikolaev EN Analiza spektrometrije mase raznolikosti Abeta peptida: poteškoće i buduće perspektive za otkrivanje AD biomarkera. Expert Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. Masena spektrometrija višestruko je oružje koje se koristi u borbi protiv Alzheimerove bolesti: amiloidni beta peptidi i šire. Maseni spektar. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andreev VP; Petyuk VA; Brewer HM; Karpievitch YV; Xie F; Clarke J; Logor D; Smith RD; Lieberman AP; Albin RL; Nawaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Kvantitativna LC-MS proteomika Alzheimerove bolesti i normalno ostarjelih ljudskih mozgova bez oznaka. J. Proteome Res. 2012, 11, 3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Zupčanik M; Wang PG; Brada LS; Li L. Integrirana proteomika i mrežna analiza identificiraju čvorišta proteina i mrežne promjene u Alzheimerovoj bolesti. ActaNeuropathol. Komun. 2018., 6., 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com